Name: 3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Keşfedin 3D meme hücreli sferoidlerin endotel ağlarına biyobaskı yöntemini. Bu teknik, ilaç tarama çalışmaları için hızlı ve biyolojik olarak uygun ko-kültür modelleri oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.

1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya
<ol><li>MCF10A meme epitel hücreleri NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.<ol>
<li>20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 mL steril%0,1 BSA'ya 500 μL 200 μg/mL EGF ekleyin. Mağaza 12 aya kadar -20 °C'de 20 μg/mL EGF aliquots hazırladı.</li>
		<li>500 μg/mL hidrokortizon hazırlamak için, 1 mg hidrokortizon 1 mL mutlak etanol (200 kanıt) seyreltin. 500 μg/mL hidrokortizon stok çözeltisi yapmak için bu karışıma 1 mL steril DMEM F:12 ekleyin. Hydrocortisone stok aliquots'u -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>10 μg/mL kolera toksini hazırlamak için, 1 mg/mL kolera toksin stok çözeltisi yapmak için 1 mg steril dH 2 O'da1mg kolera toksini lyophilized tozunu çözün. Kolera toksin stok aliquotlarını -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>Growth Medium'u hazırlamak için 500 μL EGF (20 μg/mL), 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 20 ng/mL EGF'lik son konsantrasyon için 500 mL DMEM F:12'ye 25 mL at serumu, 500 ng/mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu. Biyobaskı işleminde sterilitenin azalmasını hesaba katmak için antibiyotik konsantrasyonu% 2'ye yükseltildi; bununla birlikte, antibiyotik konsantrasyonu% 1'e düşürülebilir.</li>
		<li>Assay Medium'u hazırlamak için 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 500 mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisin ve %5 v/v at serumu için 500 mL'ye 25 mL at serumu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOT: Üç negatif (östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 eksikliği) meme kanseri epitel hücre hattı metastatik meme adenokarsinomlu bir kadın hastanın plevral efüzyonundan oluşturulur44. Hücreler agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış bir meme kanserini temsil eder.<ol>
<li>Growth and Assay Medium'ı hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL penisilin ve streptomisine ve 500 mL DMEM'e 25 mL at serumu ekleyerek son konsantrasyon için %10 v/v fetal sığır serumu, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Meme Epitel Hücre Kültürü
<ol><li>10 mL MCF10A veya MDA-MB-231 büyüme ortamına sahip 10 cm (P100) doku kültürü çanasında tohum 500.000 MCF10A veya MDA-MB-231 hücresi. MCF10A ve MDA-MB-231 hücreleri 48 saat içinde %90 birliğe ulaşır.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini geçirmek için, önce 10 mL sıcak PBS ile hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini yemeğe %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Yemeği 20-25 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Trypsin nötralize hücrelerine 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium'da yeniden ıslatın.</li>
	<li>MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ile birlikte 5 yeni 10 cm doku kültürü yemeklerinde 1 mL hücre süspansiyonu plakası. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreler 2-3 gün içinde tekrar geçişe hazır olacaktır. MCF10A hücreleri 35 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler. MDA-MB-231 hücreleri 24 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler.</li>
</ol>3. Meme Epitel Sferoid Oluşumu
<ol><li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (örneğin Matrigel) (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Matrix çözeltisini polimerize etmek için 15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kuluçka odası slaytları.</li>
	<li>200.000 hücre/mL'de MCF10A Assay Medium'da yeniden 200.000 hücre/mL veya yeniden 200.000 hücre/mL'de MDA-MB-231 Growth Medium'da 1-MB-231 hücrelerini yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>MCF10A hücrelerini kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisinin son konsantrasyonu için 5 mL Assay Medium'a 5 μL EGF (20 μg/mL) ve 100 μL matris çözeltisi ekleyerek taze MCF10A Küresel Büyüme Ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Matris çözeltisi ile önceden kaplanmış oda slaydını inkübatörden çıkarın. Her kuyuya 50 μL MCF10A veya MDA-MB-231 hücre süspansiyonu (10.000 hücre) ekleyin. MCF10A hücreleri kullanıyorsanız, 450 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin. MDA-MB-231 hücreleri kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisi (9 μL) ile önceden karıştırılmış 450 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Oda kaydıranı derhal 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı her 4 günde bir değiştirin. 200 μL pipet ucu kullanarak her kuyunun bir köşesinden dikkatlice pipet 200 μL eski ortam. Bu işlem sırasında, küresellerin bozulmamasını sağlamak için hazne kaydıranı 45 ° 'de eğin. 200 μL taze hazırlanmış MCF10A Küresel Büyüme Ortamı veya MDA-MB-231 Growth Medium daha önce% 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış, sferoidlerin matris tabakasına bağlı kalmasını sağlamak için damlalar halinde köşedeki her kuyuya ekleyin. Ortamın sadece ~ % 50'si değiştirilir, böylece küreseller tarafından üretilen tüm sitokinler tamamen tükenmez. NOT: MCF10A meme epitel sferoidlerinin polarize ve içi boş merkezler oluşturması 8 güne kadar sürer. MDA-MB-231 meme epitel sferoidlerinin oluşması 5 güne kadar sürer ve içi boş merkezleri yoktur.</li>
</ol>4. Endotel Hücre Ağı Oluşumu
<ol><li>İnsan Göbek Damarı Endotel Hücresi (HUVEC) Kültürü<ol>
<li>İnsülin büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotel büyüme faktörü, askorbik asit, epidermal büyüme faktörü içeren tek bir Endotel Büyüme Orta-2 kitinin içeriğini ekleyin, heparin ve gentamisin-amfoterisin B, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL penisilin-streptomisin ve 5 mL 200 mM glutamin ila 500 mL Endotel Bazal Orta-2 (EBM-2) ile birlikte komple Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) oluşturur.</li>
		<li>10 mL EGM-2'de 10 cm doku kültürü çanasında 500.000 endotel hücresi tohumu. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatöre % 80 izdiliğe ulaşana kadar (yaklaşık 48 saat) yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri geçirmek için endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri faz kontrastı mikroskopisi ile yakından izleyin. Hücreler toplandığında hazırdır, ancak çanağa bağlı kalırlar.</li>
		<li>Trypsin'i dikkatlice yemekten çıkar. Yemeğe 8 mL EGM-2 ekleyin. EGM-2'yi tüm bulaşık yüzeyi üzerinde yukarı ve aşağı pipetle yıkayarak bulaşıktan hücreleri yıkayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, tripsin nötralize hücrelerine 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice emiş ve hücre peletini 10 mL EGM-2'de yeniden kullanın.</li>
		<li>10 cm'lik doku kültürü çanaklarına 9 mL EGM-2'ye 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ortamın 2/3'ü her 2 günde bir taze EGM-2 ile değiştirin. Hücreler 3-5 gün içinde geçişe hazır olacaktır. HUVEC, 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endotel Hücresi (HUVEC) Ağ Oluşumu</li>
	<li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Kuluçka odası Matrigel'i polimerize etmek için15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kayar.<ol>
<li>10 cm'lik bir HUVEC çanağa 10 μL kırmızı hücreli izleyici (1:1000) 37 °C'de 30 dakika, %5 CO2 inkübatör için önceden lekeleyin.</li>
		<li>Endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için kabı 5 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>Tripsin nötralize etmek için yemeğe 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücre süspansiyonu 25 mL konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 1.200 x g'da Santrifüj HUVEC. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini serumsuz EBM-2'nin 5 mL'sinde yeniden boşaltın.</li>
		<li>Uygulanabilir hücreleri belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. 1 x 106 hücre/mL çözümü oluşturun.</li>
		<li>200 μL serumsuz EBM-2 ile her kuyuya 100.000 HUVEC ekleyin. Daha fazla hücre eklenirse, tüp ağı yerine bir yüzey monolayer oluştururlar.</li>
		<li>HUVEC'i 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatır. 6 saat sonra, faz kontrastı mikroskopisi ile HUVEC ağlarını görüntüleyin. Ağlar artık meme sferoidleri ile coculture için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Önceden oluşturulmuş HUVEC Ağlarında Meme epitel sferoidlerinin biyobaskı
NOT: Biyofabrikasyon işlemi için çift nozül biyo-biriktirme sistemi kullanılmalıdır. Bu durumda, sistem, malzeme birikiminin mikron ölçekli uzamsal kontrolüne izin vermek için üç hareket koluna ve 10 mL şırıngadan biyoink biriktirmek için iki vida tahrikli motora sahipti. Sistem, biyobaskı sırasında steril bir ortamı korumak için yüksek verimli partikül hava filtrasyon sisteminin yanı sıra UV sterilizasyon yetenekleri ile işlevselleştirilmelidir. Biyobaskı, baskı işleminden önce bir saat boyunca UV sterilize edilir.
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi meme epitel sferoidleri ve HUVEC ağları oluşturun. Temsili faz kontrastı mikroskopi görüntülerinde sferoidleri sayarak her kuyudaki meme epitel sferoidlerinin sayısını tahmin edin.</li>
	<li>1000 μL pipet ucunun ucundan 0,5 cm kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak tüm sferoidleri 8 kuyulu hazneli kaydıramadan 50 mL'lik bir tüpe dikkatlice pipetleyin. Seçilen biyoinkteki sferoidleri 100 sferoid/100 μL'de resuspend. NOT: Daha yüksek küresel konsantrasyonlar küresel kümelenme ile sonuçlanabilir ve küresel ağlar ile endotel ağları arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesini önleyebilir.</li>
	<li>Büyük veya kümelenmiş küreselleri çıkarmak için küresel karışımı 70 μm hücreli bir süzgeçten geçirin.</li>
	<li>Havuzalanmış sferoidleri 10 mL steril bir şırıngaya yükleyin ve 25 kalibrelik steril bir iğne ile kaplayın. Şırınnayı biyo-biriktirme sistemine takın.</li>
	<li>Ortamı 8 kuyulu oda kaydırağını HUVEC ağlarının dışına aspire edin.</li>
	<li>100 μL meme epitel sferoidlerini 1 mL/dk akış hızında 6 kuyu huvec ağlarına ekstrüde edin. Huvec ağlarının 2 kuyularını kontrol olarak koruyun.</li>
	<li>HUVEC ağlarında basılmış MCF10A küreselleri kullanıyorsanız 400 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin veya HUVEC ağlarında basılmış MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız daha önce % 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. huvec kontrol kuyularında ilgili küresel büyüme ortamı kullanılmalıdır.</li>
	<li>Medya değişikliği olmadan 24 - 96 saat boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde ortak kültürleri kuluçkaya yatırın. Ortak kültürler dört güne kadar orijinal ortamda canlı kalacak.</li>
</ol>6. Konfokal Mikroskopi
<ol><li>İmmünofluoresans ve PBS-Glisin Yıkama Tampon Hazırlama<ol>
<li>10x PBS'nin 500 mL'sinde 2,5 g sodyum azid, 5 g sığır serum albümini, 10 mL Triton X-100 ve 2,05 mL Ara-20 ekleyerek Immunofluorescence (IF) tampon 10x stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini bir yıla kadar 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x IF tamponu seyrelterek çalışan bir IF tamponu oluşturun. Çalışma sokmasını oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın.</li>
		<li>10x PBS'nin 500 mL'sine 37,5 g glisin ekleyerek 10x PBS-Glisin tampon stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x PBS-Glisin tamponunu seyrelterek çalışan bir PBS-Glisin çözeltisi oluşturun. Çalışma sokmasını 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokal Mikroskopi ile Etiket Biyobaskı Örnekleri ve Görüntü<ol>
<li>Biyobaskıda 3D ortak kültürlerden ortapirat yapın ve sıcak PBS ile 3 kez durulayın. Biyobaskıda 3D ortak kültürleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlayın. Örnekleri 1x PBS-Glisin ile 20 dakika boyunca 3 kez durulayın.</li>
		<li>IF tamponu ile 90 dakika boyunca %10 keçi serumu (birincil blok) karıştırılmış örnekleri bloke edin, ardından IF tamponu artı %10 keçi serumu ve Affinipure Fab parçası (1:100, ikincil blok) ile 40 dakika.</li>
		<li>MCF10A sferoidleri kullanıyorsanız, örnekleri 4 °C'de bir gecede ikincil blokaj tamponunda integrin α6 (1:100) için birincil antikor ile etiketle, ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:200) ve Hoescht 33342 (1:1000). MCF10A hücre hatları, küresel polarizasyon ve morfolojiyi göstermek için gerekli olan yüksek düzeyde integrin α6'yı ifade eder.</li>
		<li>Düşük integrin α6 seviyelerini ifade eden MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız, numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 saat boyunca ikincil blokaj tamponunda Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) ve Hoescht 33342 (1:1000) ile etiketler. Phalloidin, aktüyon filament görselleştirmesini sağlar, böylece küresel amorf ve invaziv morfoloji değerlendirilebilir.</li>
		<li>Numuneleri 1X PBS glisin ile 3 kez 20 dakika yıkayın.</li>
		<li>Üreticinin aracını kullanarak hazne slaydını çıkararak numuneleri montaj için hazırlayın. Her kuyuya küçük bir damla antifade çözeltisi ekleyin. Her oda kaydırağının üzerine 22 mm x 60 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin ve kenarları açık oje ile dikkatlice kapatın.</li>
		<li>5 μm adımda ~10 dilimden oluşan Z yığınları olarak konfokal mikroskop kullanan görüntü örnekleri. İsterseniz, hücre görüntüleme yazılımındaki Genişletilmiş Odak komutunu kullanarak Z düzlemlerini tek bir düzleme sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntü J'yi kullanarak endotel ağlarına küresel yapışkanlığı ölçün. Yapışan küresellerin sayısı, uygun parçacık boyutuna ve daireselliğe sahip analiz eklentisi kullanılarak ölçülebilir. Görüntü alanına bağlı küresellerin sayısını normalleştirin.</li>
		<li>Tekrarlanabilirliği sağlamak için, ortak kültürlerin 4 x 4 karo görüntüsünde yapışan küresellerin sayısını ölçün. Küresel sayı istatistiksel olarak diğer deneylerden anlamlı olarak daha düşükse, deney tekrarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. HUVEC ağları, sırasıyla b...

3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör modülasyonunda farklılıklar gösterir8,9; ErbB210dahil onkogen fonksiyonu; büyüme ve apoptoz sinyal11,12; ve kemoterapi direnci13,14. Vasküler endotel hücreleri benzer şekilde 3D ve geleneksel 2D kültür15 , 16 , 17,18'deçevresel uyaranlara farklı yanıt verir. Bununla birlikte, vasküler endotel ve meme epitel etkileşimlerinin anlaşılmasının çoğu, şartlandırılmış orta veya Transwell kesici uçlar kullanılarak 2D kültüründen veya iki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı 3D modellerden gelir19,20,21,22,23. Bu ortak kültür modelleri sınırlı fizyolojik içgörü sağlar, çünkü hem 3D kültür hem de hücre-hücre teması vasküler endotel için kritik öneme sahiptir - meme epitel hücre etkileşimleri24,25,26.
3D kanser modelleri, hidrojellerde veya mühendislik iskelelerinde asılı damla küresel oluşumu, biyobaskı, manyetik montaj ve kültür dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak üretilmiştir5,27,28,29. Daha yakın zamanda, kendi 3D yapılarında düzenlenmiş birden fazla hücre tipi ile 3D tümör modelleri oluşturulmuştur. Çip üzerindeki tümör platformunun bir örneğinde, kanser, endotel ve stromal hücreler bir matrise karıştırıldı ve daha sonra polidimetilsiloksiksan (PDMS) cihazındaki üç merkezi doku odasına enjekte edildi. Doku odaları, arter ve venule'yi temsil eden iki dış kanalla sınırlandı. 5-7 günlük kültürden sonra endotel hücreleri bir mikrovasküler ağ oluşturdu ve kanser hücreleri çoğalarak vaskülatın yakınında küçük tümörler oluşturdu. Bu platform daha sonra uyuşturucu ve ilaç kombinasyonlarını taramak için kullanıldı30. Belirli mekanik uyaranlara (örneğin, akciğerdeki mekanik zorlanma) sahip metastaz ve kanser türlerini incelemek için ek çip üzerinde tümör platformları oluşturulmuştur31,32. Bununla birlikte, bu platformlar genellikle ilgili 3D yapılarında hem vaskülat hem de kanser içermez.
Biyofabrikasyon, hücre konumu üzerinde sıkı mekansal kontrol sağladığından, 3D in vitro vasküler tümör modellerinin ilerletmesinde büyük umut vaat ediyor. Son on yılda biyobaskı büyümesine rağmen, çok az çalışma özellikle tümörlere odaklanmaktadır33,34. Bir örnekte, in vitro serviks kanseri modeli oluşturmak için hela hücrelerinin jelatin/aljinat/fibrinojen hidrojelde 3D baskısı kullanılmıştır. Tümör hücreleri tek tek hücreler olarak biyobaskı yapıldı ve daha sonra daha yüksek çoğalma oranı, matris metalloproteinaz ekspresyözü ve 2D kültürdeki hücrelerden daha yüksek chemoresistance gösteren küreseller oluşturmasına izin verildi35. Bu çalışmalarda, diğerlerinde olduğu gibi36,37, ayrışmış hücre süspansiyonları biyobaskı verildi ve daha sonra hücre kültürlerine hücrelerin 3D bir yapı oluşturmasını sağlamak için gerekli mekanik ve biyokimyasal ipuçları sağlandı. Bununla birlikte, hücresel kendi kendine montaj günler veya haftalar sürebilir, karmaşık uzamsal ve zamansal çevresel ipuçları gerektirebilir veya iki hücre tipi birlikte kültürlendiğinde gerçekleşmeyebilir. Örneğin, meme epitel hücreleri 2D ortak kültürde endotel hücrelerinde hücre ölümüne neden oldu ve ayrışmış meme epitel hücreleri aljinat / jelatin hidrojellerinde biyobaskılandığında 3D sferoidler oluşturmadı38. Dissosiyatif meme epitel veya kanser hücreleri aljinat bazlı biyoinkslerde sadece dairesel PDMS kalıplarına yakalandığında sferoidler oluşturdu. Diğer durumlarda, sferoidler ultra düşük bağlanma dairesel kuyu plakalarında askıya alınmış damlacıklar kullanılarak oluşturulmuş ve daha sonra aljinat bazlı biyoinks39,40' a karıştırılmıştır.
Şimdi bu protokolde alternatif bir 3D doku biyomüslüm yöntemini tarif ediyoruz. Tohum ayrışmış hücreler yerine ve bu hücrelerin 3D yapıları oluşturmasını beklemek yerine, hemen kullanılabilecek bir tümör ortak kültür modeli oluşturmak için vasküler bir tüp ağında 3D tümör sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını ve biyobaskı yapılacağını açıklıyoruz. Tümör sferoidleri in vitro olarak yetiştirilebilir veya insan dokularından (organoidler) türetilebilir. Benzer şekilde, vasküler tüpler yetiştirilebilir veya yağ dokusu mikrovasküler parçalarından elde edilebilir. Biyoinksler biyolojik olarak aktif olmayan aljinattan son derece biyolojik olarak aktif Matrigel41'ekadar değişebilir. Bu 3D tümör ortak kültür modeli çeşitli hücre yapıları ve biyoinks ile oluşturulabildiğinden, birden fazla hücre tipi, hücre dışı matrisler ve kemokin gradyanları15,42. Mevcut formülasyonunda, endotel ağları perfüzyona maruz kalamasa da, gelecekteki yinelemeler bu yöntemi mikrofluidler veya yonga üzerindeki sistemlerle entegre edebilir. Endotel ağlarına biyobaskı 3D meme epitel sferoidleri, ilaç testi ve kişiselleştirilmiş hassas tıp için insan meme modellerinin hızlı biyofabrikasyonuna olanak sağlar27.

<table><tbody><tr><td>37&derece; C inkübatör, %5 CO2 ve %95 nem</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Hücre inkübasyonu</td></tr><tr><td>3D Biyo yazıcı</td><td>ısmarlama</td><td>Yok Biyobaskı</td><td>için kullanılır</td></tr><tr><td>8 kuyulu odacıklı slaytlar</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>sferoidleri tohumlamak için</td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>biyobaskı şırınga iğnesi</td></tr><tr><td>Mutlak etanol (200 kanıt</td>) <td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>medya bileşenlerinin yeniden yapılandırılması</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;)2 parçalı keçi anti-fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>ikincil blok - İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>İkincil antikor-İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Sığır insülini</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Bloke edici ajan -İmmünofloresan</td></tr><tr><td>Falcon 70 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Büyük veya kümelenmiş sferoidleri çıkarın</td></tr><tr><td>CellTracker&trade; Kırmızı CMTPX</td><td>Boya Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>HUVEC tüpleri için ön boyama</td></tr><tr><td>Kompakt Santrifüj</td><td>Hermle-Labnet, Edison, NJ</td><td>Z206A</td><td>Hücre santrifüjleri için</td></tr><tr><td>Kolera Toksin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>Konik tüpler 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Hücrelerin toplanması ve askıya alınması</td></tr><tr><td>Kontes II-FL Hücre sayacı</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>sayma hücreleri</td></tr><tr><td>Cam pipetler (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>hücre resüspansiyonu</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A bazal medya</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 bazal medya</td></tr><tr><td>Endotelyal Bazal Ortam-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC bazal medya</td></tr><tr><td>Endotelyal Büyüme Ortamı-2 (EGM-2)</td> <td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Bir Bulletkit ile birlikte (büyüme faktörleri içeren)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor & trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Etiketleme MDA-MB-231 sferoidleri</td></tr><tr><td>Fetal Sığır serumu</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC / MDA-MB-231 medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>İmmünofloresan etiketleme bileşeni</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immünofloresan tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Çekirdek lekesi immünofloresan</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>İnsan Umblikal Ven Endotel hücreleri (HUVEC'ler)</td> <td>Hücre uygulamaları, San Diego, CA</td><td>200-05f</td><td>Endotel hücre hatları</td></tr><tr><td>Integrin ve alfa; 6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>İmmünofloresan küresel etiketleme bileşeni</td></tr><tr><td>Canlı Ölü tahlil</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Hücre canlılığı için canlı ve ölü hücre leke deneyi</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Hücreleri görselleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Matrigel - büyüme faktörü 10 mg / ml azaltıldı</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Küresel oluşumu</td></tr><tr><td>MCF10A hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Meme hücre hattı</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Meme hücre hattı</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>hücre fiksatif</td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC Medya katkı maddesi</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu 1X (PBS)</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Tripsinizasyondan önce hücreler için yıkama tamponu</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immünofloresan tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Altın antifadesini uzatın</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immünofloresan montaj ortamı</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A / tahlil ortamı bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immünofloresan tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Steril şırınga (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>biyobaskı işlemi</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>tek katmanlı hücre kültürü</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immünofloresan tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Tripan mavisi% 0.4</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>hücre sayacı katkı maddesi</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA% 0.05</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>hücre dekolmanı</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immünofloresan tampon bileşeni</td></tr><tr><td>Vasküler Endotelyal Büyüme faktörü (VEGF165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tüp katkı maddesi</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 hücre görüntüleme yazılımı</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z yığın sıkıştırıcı</td></tr></tbody></table>

3d Çok hücreli meme sferoidlerinin endotel ağlarına doğrudan biyobaskı

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.

Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoidler oluşturur. Küreseller yaklaşı...

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Protokolümüz, meme epitel sferoidleri gibi önceden oluşturulmuş 3D hücresel yapıların yazdırılmasını kolaylaştırarak, biyolojik olarak ilgili modellerin ve çeşitli biyo-mürekkeplerin hızlı bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, 3D tümör sferoidlerinin, herhangi bir deneysel çalışma için hemen hemen kullanılabilecek bir vasküler ağ üzerine biyo-baskısını kolaylaştırmasıdır. Bu 3D biyobaskılı doku modelleri, kişiselleştirilmiş hassas tıp için genişletilebilen hızlı bir in vitro platform sağlar.Bu çok yönlü 3D biyo-baskı yöntemi, damar sistemi ile 3D etkileşimlerin önemli olduğu diğer fizyolojik sistemlere uygulanabilir. Meme epitelyal sferoid oluşumu için önce 200 mikrolitrelik pipet uçlarını 30 dakika dondurun ve büyüme faktörü azaltılmış matris solüsyonunu buz üzerine yerleştirin. Uçlar donduğunda, oyuk başına yeni bir buz gibi soğuk pipet ucu kullanarak, sekiz oyuklu bir hazneli slaydın her bir oyuğunun yanına ve köşelerine 30 mikrolitre buz gibi soğuk matris çözeltisi ekleyin ve merkeze son bir damla ekleyin eşit bir kaplama sağlamak için.Tüm kuyucuklar kaplandıktan sonra, slaytı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 15 ila 20 dakika inkübe edin. Matr

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, birlikte kültürlenmiş pankreas kanseri hücrelerinin ve fibroblastların 3D manyetik biyo-baskısını açıklamaktadır. Pankreas kanseri hücreleri ve aktive edilmiş pankreas fibroblast hücreleri, manyetik kuvvetlerin etkisi altında sferoidler oluşturmak için biyouyumlu bir nanopartikül düzeneği kullanılarak birlikte kültürlenir ve manyetize edilir.

Manyetik Olarak Biyobaskılı 3D Sferoid Ko-kültürler: Kanserli Hücrelerin ve Fibroblastların Birlikte Kültürlenmesi İçin Bir Yöntem

Bir Kartezyen biyoyazıcı, hassas, tekrarlanabilir geometrilerde çok malzemeli biriktirmeye izin verirken aynı zamanda çevresel faktörlerin kontrolüne de izin verecek şekilde tasarlanmış ve üretilmiştir. Üç boyutlu biyo-yazıcıyı kullanarak, karmaşık ve uygulanabilir yapılar basılabilir ve kolayca çoğaltılabilir.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Bu protokol, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Burada sunulan bir basit kullanımlı, çekirdek / kabuk, üç boyutlu biyobaskı kurulum içi boş iskeleler, vasküler ve diğer borulu yapıların doku mühendisliği için uygun tek adımlı imalatı için.

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Tasarlanmış flepler, dahil edilmiş bir fonksiyonel vasküler ağ gerektirir. Bu protokolde, hiyerarşik vasküler ağ ve onun doğrudan mikrocerrahi anastomozlarını sıçan femoral arterine içeren 3D baskılı bir doku flebi üretme yöntemini sunuyoruz.

3D Baskı Teknolojileri Kullanılarak Mühendislik Vasküler Flaplarının İmalatı

Plaka üzerinde damar (VOP) olarak adlandırılan 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak standart altı oyuklu bir plaka üzerinde esnek boyutlara ve istenen desenlere sahip vasküler kanalların yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, riskli endotel ile ilişkili bozukluklar için terapötiklerin geliştirilmesini ilerletme potansiyeline sahiptir.

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin 3D meme hücreli sferoidlerin endotel ağlarına biyobaskı yöntemini. Bu teknik, ilaç tarama çalışmaları için hızlı ve biyolojik olarak uygun ko-kültür modelleri oluşturur.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Daha fazla video keşfet