Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, farklı mantar büyüme aşamalarında uçucu ve uçucu olmayan antifungal bileşiklerin nispi etkinliğinin doğru yan yana karşılaştırmalarını yapmak için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, çok çeşitli moleküller içeren kurutulmuş veya sıvı formlarda kullanılan bitki türevli ürünlerin antifungal aktivitesini değerlendirmek için çok uygundur. Bu yöntem, bitki türevli ürünlerin uygulama şekli hakkında değerli bilgiler sağlayabilir ve özellikle biyokontrol alanında çok uygundur.

Prosedürü gösteren, Sup'Biotech laboratuvarından bir mühendis asistanı olan Valentina Gligorijeviç olacak. Conidia toplama için, bir trichoderma miselyum kültürü üzerine üç mililitre% 0.05 Tween 20 katlayın ve hiflerin yırtılmasını önlemek için miselyuma bastırmamaya dikkat ederek conidiaforları konidioforlardan serbest bırakmak için bir tırmık kullanın. Tüm conidia serbest bırakıldığında, hızlı bir şekilde iyileşmek için bir mikropipet kullanın ve conidia solüsyonunu saymak için 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin.

Mantar plakaları hazırlamak için, PDA ortamı içeren dokuz santimetrelik bir Petri kabına mililitre konsantrasyonda üç kez 10 ila altı sporda 10 mikrolitre spor bırakın ve plakaya 10 gram iki milimetre çapında cam boncuk eklemek için steril bir spatula kullanın. Daha sonra plakayı hafifçe ileri ve geri sallayın ve sporları agar yüzeyine eşit olarak dağıtmak için plakayı tamamen döndürülene kadar 90 derecelik segmentler halinde döndürün ve döndürün. Daha sonra plakayı büyüme inhibisyonu analizine kadar 30 santigrat derecede inkübe edin.

Sarımsak tozu ile bir temas önleme testi yapmak için, istenen sarımsak tozu miktarını ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere tartmak için steril bir spatula kullanın. genellikle mililitre başına 0.25 ila 16 miligram arasında değişen konsantrasyonlar elde etmek için. Her tüpe 10 mililitre yaklaşık 45 santigrat derece PDA ekleyin ve tozu agar boyunca eşit olarak dağıtmak için her tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin.

Hızlı bir şekilde homojenize süspansiyonları beş santimetre çapındaki Petri kaplarına dökün ve agarın oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Bir temas inhibisyon testi yapmak için, kontrol ve mantar önleyici bileşik ile muamele edilmiş kaplarda agarın merkezinde bir daire çizmek için beş milimetre çapında steril paslanmaz çelik bir boru kullanın ve agar silindirlerini atmak için steril bir kürdan kullanın. Daha sonra, mantar plakalarına rastgele 15 ila 20 daire çizmek için beş milimetre çapında yeni bir paslanmaz çelik boru kullanın ve spor, hifler veya miselyum kaplı silindirleri PDA plakalarının boş bölgelerine dikkatlice aktarmak için steril kürdan kullanın.

Ardından plakaları 30 derece santigrat derece inkübatöre geri koyun. Buhar fazı antifungal inhibisyon testi için bir plaka hazırlamak için, 10 mililitre antifungal bileşikler içeren 10 mililitre PDA ortamı veya tek başına PDA ortamı içeren beş santimetre çapında bir Petri kabının kapağına 10 mililitre PDA ortamı dökün ve agarın oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Kalibrasyon aracı olarak 50 mililitrelik bir santrifüj tüp kullanarak, agarın ortasında bir PDA çemberi oluşturun ve dairenin etrafındaki agarı çıkarmak için steril bir spatula kullanın.

Kapaktaki ortamın ortasına bir daire çizmek için beş milimetre çapında steril paslanmaz çelik bir boru kullanın ve burgu silindirini atmak için steril bir kürdan kullanın. Daha sonra, hazırlanan mantar plakalarında rastgele tapalar yapmak için beş milimetre çapında steril paslanmaz çelik bir boru kullanın ve spor, hifler veya miselyum kaplı tıkaçları tahlil plakalarının kapaklarına dikkatlice aktarmak için steril bir kürdan kullanın. Bu analizde, üç antifungal bileşik tarafından tetiklenen trichoderma türü SBT 10-2018 büyüme inhibisyonu, her mantar aşaması için gösterildiği gibi temas ve buhar fazı inhibisyon testleri kullanılarak değerlendirildi.

Trichoderma ve antifungal bileşikler temas halindeyken erken hif ve miselyum ağlarına kıyasla karbendazimlere karşı daha yüksek bir spor duyarlılığı gözlenmiştir. Buna karşılık, karbendozim, bu maddenin düşük uçuculuğuna uygun olarak mantar ilacından uzak bir yere yerleştirildiğinde trichoderma üzerinde hiçbir antifungal etkiye sahip değildi. Thymus vulgaris esansiyel yağı antifungal bir bileşik olarak kullanıldığında,% 0.025 esansiyel yağda miselyum büyüme inhibisyonuna kıyasla sporlar ve erken hifler için daha yüksek bir duyarlılık gözlenmiştir.

Beklendiği gibi, thymus vulgaris esansiyel yağı, mantar ve yağ arasındaki mesafeden bağımsız olarak aynı antifungal aktiviteyi göstermiştir. Sarımsak tozu kullanıldığında, spor çimlenmesine ve erken hif uzamasına karşı miselyum büyümesine göre daha yüksek bir etkinlik gözlenmiştir. Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için sporların agar plakasının yüzeyine eşit olarak dağıldığından emin olmak için mantar plakasının hazırlanması sırasında özellikle dikkat edilmelidir.