Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptoglycomics, peptidoglikan bileşimini ince ayrıntılarla incelemek için yüksek güçlü biyoinformatik veri analizi ile birleştirilmiş gelişmiş kütle spektrometresi kullanır. Biyoinformatik algoritmaların kullanılması, toplu spesifikasyon verilerinin bir veri dosyası koleksiyonunda aynı anda analizini, çıkarılmasını ve karşılaştırılmasını sağlayarak iş yükünü azaltır ve doğruluğu artırır. Peptidoglikanın çeşitli varyasyonlarını ve modifikasyonlarını anlamak, büyüme ve bölünme, konakçı bağışıklık kaçışı ve antimikrobiyal direnç dahil olmak üzere hücresel süreçleri anlamada etkilere sahiptir.

Protokole aşina olmak ve deneysel parametreleri değerlendirmek için bir pilot proje olarak hareket etmek için önce küçük bir numune alt kümesini hazırlamanızı ve analiz etmenizi öneririz. Kütle spektrometresi veri analizi yazılımı, özellikleri ve işlevleri tanımlarken kullanılan tanımlarda sıklıkla farklılık gösterdiğinden, görsel gösterim, kullanıcıların bu protokolü platformlar arasında uygulamasına yardımcı olacaktır. Peptidoglikan sakkül ekstraksiyonu için, hücre süspansiyonunu 20 milimolar sodyum fosfat içinde 20 milimolar sodyum fosfat içinde %8 SDS'ye damla damla eklemeden önce, dört santigrat derecede orijinal kültür hacminin yaklaşık bir ila 10'unda donmuş hücre peletlerini yeniden süspanse edin ve nihai bire bir hacme getirin.

Tam membran ayrışmasını sağlamak için karıştırarak 30 dakika ila üç saat arasında hafifçe kaynatın. Elde edilen karışım, kalan hücre kümeleri veya viskozite olmadan tamamen berrak olmalıdır. Çözelti oda sıcaklığına soğuduğunda, sakpili ultra santrifüjleme ile toplayın, ardından yıkama tamponu kolorimetrik boya ile belirlendiği gibi yaklaşık% 0.001'lik bir SDS konsantrasyonuna sahip olana kadar yıkama başına yaklaşık 50 mililitre oda sıcaklığında 20 milimolar sodyum fosfat beş ila yedi yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, sakpili 5 ila 10 mililitre oda sıcaklığında 20 milimolar sodyum fosfatta yeniden süspanse edin ve numuneyi 10 milimolar magnezyum sülfat içinde mililitre başına 50 mikrogram amilaz, DNaz ve RNaz ile 37 santigrat derecede çalkalama veya nütasyon ile bir saatlik inkübasyon için destekleyin. Kuluçka süresinin sonunda, reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede mililitre pronaz başına 100 mikrogram ile sindirin. Ertesi sabah ultra santrifüjlemeden sonra, numuneyi bir buharlı pişiricide 25 mililitre% 2 SDS ve 20 milimolar sodyum fosfat içinde bir saat kaynatın.

İnkübasyonun sonunda, numuneyi gösterildiği gibi 50 mililitre oda sıcaklığında çift damıtılmış su ile beş ila yedi kez yıkayın. SDS konsantrasyonu yaklaşık% 0.001'e ulaştığında, bir sacculi süspansiyonu elde etmek için peleti yeterli miktarda çift damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin ve kabı yıkayın. Eksi 80 santigrat derecede gece boyunca saklandıktan sonra, sakpili mililitre çift damıtılmış su konsantrasyonu başına 10 miligram peptidoglikana seyreltmeden önce donmuş numuneyi liyofilize edin.

LC-MS analizi için, cihaz yazılımında yeni bir proje başlatın ve uygun LC-MS QTOF veri dosyalarını ilgilenilen deneysel duruma atayın. Veri işleme sihirbazı toplu özyinelemeli özellik çıkarımını çalıştırın ve tek tek muropeptitleri temsil eden kütle-yük tepe noktalarını doğru bir şekilde tanımlamak, gruplandırmak ve doğrulamak için veri işleme filtrelerini LC-MS koşullarının ve enstrümantasyonun parametreleriyle eşleşecek şekilde ayarlayın. Özellik ayıklama işleminin sonundaki sonuçları gözden geçirin.

Bir grupta önemli sayıda özellik hizalanamadıysa, algılama penceresini gerektiği gibi genişletmek veya kısıtlamak için özyinelemeli filtreleme parametrelerini ayarlayın. Ardından verileri bileşik bir değişim dosyası olarak dışa aktarın. Diferansiyel spektral özellik analizi için, sistem yazılımında yeni bir proje başlatın ve veri içe aktarma talimatlarını izleyin.

Veri analizi sırasında, diferansiyel analiz için anlamlılık ve katlama değişikliğini seçin ve temel verileri tüm veri dosyalarındaki medyan yoğunluğa ayarlayın. Analiz tamamlandıktan sonra, test edilen deney koşulları arasında önemli bir bolluk değişikliği gösteren muropeptidleri belirlemek için ortaya çıkan grafiksel ve istatistiksel analizleri inceleyin. Proje gezgini altında, çeşitli analizlere sağ tıklayın ve özellik ayrıntılarını bir tsv dosyası olarak kaydetmek için bir dışa aktarma seçeneği belirleyin.

İlgili tüm verileri elde etmek için birden fazla analizi kaydettiğinizden emin olun. Diferansiyel analiz yazılımı içinde, sonuçların yorumlanması altında, kimlik tarayıcısını seçin, beklenen muropeptid yapılarının bir kitaplığını ekleyin ve tanımlanan her özellik için tahmin edilen bir muropeptid açıklaması üretmek üzere özellik ekstraksiyonu için gösterildiği gibi benzer parametreleri seçin. Tahmin edilen muropeptid açıklamasını manuel olarak doğrulamak için, tandem kütle spektrometresi kromatogramının kütle-yük oranı tepe noktalarını, bilinen bir muropeptid yapısının tüm olası parçalanmalarının tahmin edilen kütle-yük oranıyla karşılaştırın.

Her bir bağ ayrı ayrı veya kombinasyon halinde kırıldığında kütle spektrometrisi parçalarının kütle-yük oranını göstermek için kütle parçalanma aracını kullanarak tahmin edilen muropeptid yapısını çizmek için bir moleküler düzenleyici kullanın, ardından muropeptid yapısının tüm olası parçalanmalarını tandem kütle spektrometresi kromatogramı ile karşılaştırın. Muropeptit açıklamasını doğrulamak için, birden fazla parçanın kütle-yük oranı tepe noktaları, çok minimal bir kütle-yük oranı hizalama penceresi ile tandem kütle spektrometresi kromatogramında bulunmalıdır. Muropeptit modifikasyonlarındaki global değişiklikleri değerlendirmek için, istatistiksel olarak anlamlı yüksek katlı değişim muropeptidlerinin tsv dosyasını, her muropeptid modifikasyonu için tek bir sütun içerecek şekilde düzenleyin.

Bu sütunu, açıklamalı her muropeptid için bir atama ile doldurun ve değiştirilmiş tsv dosyasını Perseus'a yükleyin. Satırlara açıklama ekle'nin altında, Satırlara kategorik olarak açıklama ekle'yi tıklatın ve her deneysel parametreye veri dosyaları ekleyin. Ardından test altında, bir öğrencinin T testini gerçekleştirmek için iki örnek teste tıklayın ve 1D ek açıklama yapmak için 1D'ye tıklayın.

Kütle spektrometresi makinelerinin artan algılama hassasiyeti, yüksek güçlü tepe tanıma yazılımı ile birleştiğinde, karmaşık numunelerin madde bileşimlerini çok küçük ayrıntılarla izole etme, izleme ve analiz etme yeteneğini geliştirmiştir. Kütle spektrometresi verilerinden ekstrakte edilen her bir kütle-yük tepe noktasının belirli bir muropeptid ile ilişkilendirilmesi, bilinen ve tahmin edilen muropeptid yapılarının bir veri tabanı ile çapraz referanslama ile kolaylaştırılır. Ekstrakte edilen her özellik için parçalanma tandem kütle spektrometresi kromatogramı, veri tabanı kullanılarak önerilen murorepeptidin parçalanma profili ile karşılaştırılabilir.

Volkan grafikleri, test edilen koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek büyüklükte bolluk değişikliği gösteren muropeptidleri vurgulamak için kullanılabilir. Birlikte incelendiğinde, aynı modifikasyona sahip birden fazla muropeptid, tek bir deneysel duruma doğru bir eğilim açısından incelenebilir ve tüm grup anlamlılık açısından değerlendirilebilir. Bir muropeptid modifikasyonunun bu şekilde izlenmesi, deneysel parametreden etkilenen belirli bir enzimatik aktiviteyi tanımlayabilir.

Ek olarak, bu eğilimden kaynaklanan aykırı değerler, belirli bir özgüllük veya biyolojik işleve sahip enzimatik aktiviteleri ortaya çıkarabilir. Bu prosedür, polimerlerdeki biyokimyasal değişiklikleri ve biyolojik varyasyonları inceler, böylece in vivo olarak PG üzerinde çalışan enzimatik aktivite hakkında bilgi sağlar. PG bileşimini ayrıntılı olarak doğrulamak, birçok kritik fizyolojik süreç için etkileri olan karmaşık hücresel yapıların anlaşılmasına yardımcı olacaktır.