Name: Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Keşfedin peptidoglikan bileşiminin sıvı kromatografi, kütle spektrometrisi ve biyoinformatik algoritmalarla yarı kantitatif analizini. Bu yöntem bakteri büyümesi ve antimikrobiyal direnç araştırmalarında yüksek doğruluk sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu protokolün rafine edilmesindeki katkılarından dolayı Dr. Jennifer Geddes-McAlister ve Dr. Anthony Clarke'a teşekkür eder. Bu çalışma, CIHR'den C.M.K'ya (PJT 156111) verilen işletme hibeleri ile desteklendi ve E.M.A. Rakamları'na verilen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, BioRender.com'da oluşturuldu.

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, peptidoglikanı bakteri kültürlerinden arındırmak, LC-MS tespiti için işlem yapmak ve biyoinformatik teknikleri kullanarak kompozisyonu analiz etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Burada, Gram-negatif bakterilere odaklanıyoruz ve Gram-pozitif bakterilerin analizini sağlamak için bazı hafif değişiklikler gerekecektir.
Muropeptitlerin hazırlanması, 1960'larda ilk kez üretildiğinden beri neredeyse aynı kalmıştır 9,11,15....

Peptidoglikan (PG), proteinler ve diğer hücresel bileşenler için yapısal destek sağlarken, hücre morfolojisini korumaya yarayan bakterilerin tanımlayıcı bir özelliğidir 1,2. PG'nin omurgası alternatif β-1,4'e bağlı N-asetil muramik asit (MurNAc) ve N-asetil glukozamin (GlcNAc)1,2'den oluşur. Her MurNAc, bitişik disakkarit bağlantılı peptitlere çapraz bağlanabilen ᴅ-laktil kalıntısına bağlı kısa bir peptide sahiptir (Şekil 1A, B). Bu çapraz bağlama, tüm hücreyi kapsayan ve genellikle sakkül olarak adlandırılan ağ benzeri bir yapı üretir (Şekil 1C). PG sentezi sırasında, öncüller sitoplazmada üretilir ve sitoplazmik membran boyunca flippaslar tarafından taşınır. Öncüller daha sonra sırasıyla glikosidik ve peptid bağlarını üreten transglikozilaz ve transpeptidaz enzimleri tarafından olgun PG'ye dahil edilir3. Bununla birlikte, bir kez monte edildikten sonra, büyüme ve bölünme de dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlemi gerçekleştirmek için PG'yi değiştiren ve / veya bozan bakteriler tarafından üretilen çok sayıda enzim vardır. Ek olarak, PG'nin çeşitli modifikasyonlarının, hücre sinyalizasyonu, antimikrobiyal direnç ve konakçı immün kaçınma4 ile ilişkili olan suş, büyüme koşulları ve çevresel strese özgü adaptasyonlar sağladığı gösterilmiştir. Örnek olarak, yaygın bir modifikasyon, MurNAc üzerine, PG 4,5,6'yı bozan konakçı tarafından üretilen lizozim enzimlerine glikan β-1,4 bağlantılarına erişimi sınırlayarak direnç kazandıran bir C6 asetil grubunun eklenmesidir. Enterokoklarda, peptit yan zincirinin ᴅ-Ala terminalinin ᴅ-Lac ile değiştirilmesi, antimikrobiyal, vankomisin 7,8'e karşı daha büyük bir direnç sağlar.
PG izolasyonu ve saflaştırma için genel prosedür, 1960'larda tanımlandığından beri nispeten değişmeden kalmıştır9. Bakteriyel membranlar SDS ile ısıl işlemle çözülür, ardından bağlı proteinlerin, glikolipidlerin ve kalan DNA'nın enzimatik olarak uzaklaştırılması sağlanır. Saflaştırılmış bozulmamış sakkül daha sonra GlcNAc ve MurNAc arasındaki β-1,4 bağlantısının hidrolizi ile bireysel bileşenlere sindirilebilir. Bu sindirim, herhangi bir yapısal modifikasyon ve / veya çapraz bağ bozulmadan GlcNAc-MurNAc disakkaritleri üretir ve muropeptitler olarak adlandırılır (Şekil 1B).
PG'nin bileşimsel analizi başlangıçta her bir muropeptidi saflaştırmak için yüksek basınçlı sıvı kromatografik separasyonu (HPLC) yoluyla gerçekleştirildi ve ardından muropeptitlerin manuel olarak tanımlanması10,11 yapıldı. O zamandan beri bunun yerini, algılama hassasiyetini artıran ve her bir muropeptidi saflaştırmanın manuel iş yükünü azaltan sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS) almıştır. Bununla birlikte, muropeptitlerin manuel olarak tanımlanmasının zaman alıcı ve karmaşık doğası, yapılan çalışmaların sayısını azaltarak sınırlayıcı bir faktör olarak kalmıştır. Son yıllarda "omik" teknolojilerin ortaya çıkmasıyla birlikte, otomatik LC-MS özellik ekstraksiyonu, çok büyük veri kümelerinden karmaşık örneklerdeki bireysel bileşiklerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikler tanımlandıktan sonra, biyoinformatik yazılım, karmaşık veri kümesi arasındaki minimum farklılıkları bile izole eden ve bunları kullanıcıya grafiksel olarak görüntüleyen diferansiyel analiz kullanarak örnekler arasındaki varyasyonu istatistiksel olarak karşılaştırır. PG kompozisyonunun analizi için özellik ekstraksiyon yazılımının uygulanması daha yeni keşfedilmeye başlanmıştır 12,13,14 ve biyoinformatik analiz 12 ile birleştirilmiştir. Tam otomatik tanımlamaya izin veren peptid parçalanmasını öngören hazır protein veritabanlarından yararlanan proteomik analizin aksine, peptidoglycomics için şu anda parçalanma kütüphanesi yoktur. Bununla birlikte, özellik ekstraksiyonu, muropeptid tanımlamasını tahmin etmek için bilinen ve tahmin edilen yapısal veritabanlarıyla birleştirilebilir12. Burada, PG kompozisyonunun otomatik tanımlanması ve biyoinformatik diferansiyel analizi için bir muropeptid kütüphanesi ile birlikte LC-MS tabanlı özellik ekstraksiyonunun kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz (Şekil 2).

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C18 ters faz sütunu - AdvanceBio Peptide sütunu (100 mm x 2,1 mm 2,7 ve mikro; m)</td> <td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS veri toplama</td></tr><tr><td>Isıtma mantosu kontrolörü, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>%4 SDS kaynatma</td></tr><tr><td>Isıtma Mantosu için, 1000mL Yarım</td> küre <td>Fisher</td><td>CG1000008</td><td>%4 SDS kaynatma</td></tr><tr><td>İnkübatörü için, 37 & derece; Acculi</td><td>saflaştırma ve MS numune hazırlama için</td>C <td></td><td></td></tr><tr><td>Leibig kondansatör, 300MM 24/40,</td> %<td>4 SDS kaynatma için</td> <td>Fisher</td><td>CG121805</td></tr><tr><td>Sacculi'nin liyofilizasyonu için</td><td>Liyofilizatör</td><td>Labconco</td><td></td></tr><tr><td>%</td><td>4 SDS kaynatma</td>kütle spektrometresi için <td>Fisher</td><td>90-691-18</td></tr><tr><td>Q-Tof model UHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>LC-MS veri toplama</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj filtreleri, Nanosep MF 0.2 ve mikro; m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>MS enjeksiyonundan önce numunenin temizlenmesi</td></tr><tr><td>İmbik standı</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>%4 SDS kaynatma için</td></tr><tr><td>İmbik kelepçesi</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>%4 SDS kaynatma</td></tr><tr><td>yuvarlak tabanlı şişe için - 1 litre pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>%4 SDS kaynatma için</td></tr><tr><td>Sonikatör model 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>sacculi saflaştırma için</td></tr><tr><td>Sonikatör - mikro uçlu</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>sacculi saflaştırma için</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td></td><td>sacculi yıkama adımları</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj şişeleri, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>sacculi yıkama adımları</td></tr><tr><td>Su temini Su soğutmalı</td><td>kondenser için</td> <td>şehir</td><td></td></tr>Software<<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/ strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>Cambridgesoft</td><td></td><td>muropeptid parçalanma tahmini için moleküler düzenleyici</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>, açıklamalı muropeptidlerin, bolluğun, izotopik desenlerin vb. listelerini görüntüleme</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Aglient</td><td></td><td>çalışan QTOF cihazı</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Aglient</td><td></td><td>biyoinformatik diferansiyel analiz</td></tr><tr><td>MassHunter Kişisel Bileşik Veritabanı ve Kütüphane Yöneticisi</td><td>Aglient</td><td></td><td>muropeptid m/z MS veritabanı</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>özyinelemeli özellik çıkarma</td></tr><tr><td>MassHunter Kalitatif analiz</td><td>Aglient</td><td></td><td>görüntüleme MS ve MS / MS kromatogramları</td></tr><tr><td>Prizma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Grafik yazılımı</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Biyokimya</td><td></td> Enstitüsü <td>1D açıklama</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzeme < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amilaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS ayar karışımı - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces globisporus'tan mutanolizin ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazı (%>99 saflıkta)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Fosforik asit</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E'den Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borohidrür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat (dibazik)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat (monobazik)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Tüm Lekeler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

peptidoglikanın sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi ve biyoinformatik ile yarı kantitatif analizi

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikan, bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşenidir ve antimikrobiyaller için ortak bir hücresel hedeftir. Peptidoglikan yapısının yönleri tüm bakterilerde oldukça korunmuş olsa da, Gram-pozitifler / negatifler arasında ve türler arasında da önemli farklılıklar vardır. Ek olarak, büyüme fazına ve / veya çevresel uyaranlara yanıt olarak bir bakteri türünde meydana gelebilecek peptidoglikan için bilinen çok sayıda varyasyon, modifikasyon veya adaptasyon vardır. Bu varyasyonlar, büyüme / bölünme, antibiyotik direnci ve konakçı savunmasından kaçınma dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyona katıldığı bilinen oldukça dinamik bir yapı üretir. Peptidoglikan içindeki varyasyonu anlamak için, genel yapı kurucu parçalarına (muropeptitler olarak bilinir) ayrılmalı ve genel hücresel kompozisyon için değerlendirilmelidir. Peptidoglycomics, peptidoglikan kompozisyonunu ince ayrıntılarla incelemek için yüksek güçlü biyoinformatik veri analizi ile birlikte gelişmiş kütle spektrometresi kullanır. Aşağıdaki protokol, peptidoglikanın bakteri kültürlerinden saflaştırılmasını, bir sıvı kromatograf - kütle spektrometresi aracılığıyla muropeptid yoğunluk verilerinin elde edilmesini ve biyoinformatik kullanılarak peptidoglikan bileşiminin diferansiyel analizini açıklamaktadır.

MS makinelerinin artan algılama hassasiyeti, yüksek güçlü tepe tanıma yazılımı ile birleştiğinde, karmaşık numunelerin madde bileşimlerini çok küçük ayrıntılarla izole etme, izleme ve analiz etme yeteneğini geliştirmiştir. Bu teknolojik gelişmeleri kullanarak, peptidoglikan bileşimi üzerine yapılan son çalışmalar, eski HPLC tabanlı metodoloji 11,25,26,27,28,29,30,31 üzerinde otomatik LC-MS özellik ekstraksiyon teknikleri <sup class="xref"...

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Peptoglycomics, peptidoglikan bileşimini ince ayrıntılarla incelemek için yüksek güçlü biyoinformatik veri analizi ile birleştirilmiş gelişmiş kütle spektrometresi kullanır. Biyoinformatik algoritmaların kullanılması, toplu spesifikasyon verilerinin bir veri dosyası koleksiyonunda aynı anda analizini, çıkarılmasını ve karşılaştırılmasını sağlayarak iş yükünü azaltır ve doğruluğu artırır. Peptidoglikanın çeşitli varyasyonlarını ve modifikasyonlarını anlamak, büyüme ve bölünme, konakçı bağışıklık kaçışı ve antimikrobiyal direnç dahil olmak üzere hücresel süreçleri anlamada etkilere sahiptir.Protokole aşina olmak ve deneysel parametreleri değerlendirmek için bir pilot proje olarak hareket etmek için önce küçük bir numune alt kümesini hazırlamanızı ve analiz etmenizi öneririz. Kütle spektrometresi veri analizi yazılımı, özellikleri ve işlevleri tanımlarken kullanılan tanımlarda sıklıkla farklılık gösterdiğinden, görsel gösterim, kullanıcıların bu protokolü platformlar arasında uygulamasına yardımcı olacaktır. Peptidoglikan sakkül ekstraksiyonu için, hücre süspansiyonunu 20 milimolar sodyum fosfat içinde 20 milimolar sodyum fosfat içinde %8 SDS'ye damla damla eklemeden önce, dört santig

semi-quantitative-analysis-peptidoglycan-liquid-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.

Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Kütle spektrometresi tabanlı phyloproteomics (MSPP) Campylobacter jejuni ssp bir koleksiyon yazın kullanıldı. Doylei multilokus dizisi yazarak (MLST) kıyasla gerilme seviyesinde izole eder.

alt türlerinin<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Kütle Spektrometre tabanlı PhyloProteomics kullanma izolatlar (MSPP)

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bir iletişim kuralı oligo-peptoids dizi analizi tarafından takip manuel sentezi için kütle spektrometresi tarafından açıklanmıştır.

Sentez ve kütle spektrometresi analizleri Oligo-peptoids

Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Hücre duvarı bozulmasını hedefleyerek Bacillus subtilis ve Streptococcus pneumoniae'nin büyümesini engelleyen küçük moleküllü bir prob olan bakteriyostatik diamide masarimycin'in hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Kimyasal bir prob olarak uygulanması, sinerji / antagonizma tahlillerinde ve B. subtilis ve S. pneumoniae ile morfolojik çalışmalarda gösterilmiştir.

Gram-pozitif bakteriyel büyümenin küçük moleküllü bir inhibitörü olan masarimisinin sentezi

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Keşfedin peptidoglikan bileşiminin sıvı kromatografi, kütle spektrometrisi ve biyoinformatik algoritmalarla yarı kantitatif analizini. Bu yöntem bakteri büyümesi ve antimikrobiyal direnç araştırmalarında yüksek doğruluk sağlar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Daha fazla video keşfet