Name: Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Öğrenin fare seminifer tübüllerinin transillüminasyon destekli mikrodiseksiyonunu ve aşağı akış immünostaining tekniklerini. Bu yöntem spermatogenezin belirli evrelerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Finlandiya Akademisi'nden [315948, 314387'den N.K.'ye] hibelerle desteklendi; Sigrid Jusélius Vakfı [N.K., J.T.'ye]; Emil Aaltonen Vakfı [J.-A.M., T.L.]; Turku Moleküler Tıp Doktora Programı [S.C.-M., O.O.].

Laboratuvar farelerinin bakımı ve tüm hayvan deneyleri Türkü Üniversitesi'nde laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına yönelik ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.
1. Mikrodisseksiyon için seminifer tübüllerin hazırlanması
<ol><li>Co 2 boğulması ve ardından servikal çıkık yoluyla yetişkin bir erkek fareyi (≥8 haftalık, suş ve yaşa bağlı olarak testis80-120 mg) kurban edin. NOT: Fare cinsel olarak olgun ve tercihen en az 8 haftalık olmalıdır. Yavru farelerin transilluminasyon deseni yetişkinden farklıdır, çünkü seminifer epitel dalgası henüz tam olarak belirlenmemiştir ve ilk spermatogenez dalgasının zamanlaması21,22 'dir. <4 haftalık erkek farelerde uzun süreli spermatid eksikliği, transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon için kullanımlarını engeller. Normal spermatogenez içeren tüm fare suşları kullanılabilir.</li>
	<li>Ventral karına% 70 etanol püskürtün. Abdominopelvic boşluğunu steril makas kullanarak açın, V şeklinde bir açıklık açın.</li>
	<li>Epididimal yağ yastığını steril epekslerle çekerek testisleri bulun, makas kullanarak parçalara ayırın ve PBS içeren steril 100 mm Petri kabına yerleştirin. NOT: Steriliteyi korumak için tüm labware ve cerrahi aletlerin steril olduğundan emin olun.</li>
	<li>İnce uçlu makas kullanarak testisleri kapsülleyen kalın lifli levha olan tunica albuginea'dabir yarık keserek testislerin başını koparın. Sonra bir çift yaban arısı kullanarak tunicayı yırtın. Tübülleri tokalarla bastırarak dışarı çıkmaya zorlayın ve tunicayı atın. NOT: Tunica atılırken, arteri testislerinin tunica ile birlikte çıkarılması bazı aşağı akış uygulamaları için yararlı olabilir. Seminifer tübüllere zarar vermekten kaçının.</li>
	<li>Seminifer tübülleri yeni bir Petri kabına taşıyın ve Petri kabının altını kaplayacak kadar steril PBS dökün. Daha sonra, tübülleri yavaşça ayırın, ancak tübüllere zarar vermekten kaçının. NOT: Çok fazla mekanik stres transilluminasyon paternini etkileyecek ve dokunun canlılığını ve hücresel mimarisini etkileyecektir. Tübüller ayrıca bu noktadan itibaren tüm montajlı immünostainingler için evreleme olmadan işlenebilir (3B). Bazen SALL4, c-KIT ve DNMT3A18,23gibi spermatogonianın ayırt edilmesinde ifade edilen proteinlere karşı antikorları dahil ederek aşamayı retrospektif olarak tanımlamak yeterlidir. Spermatogonia yoğunluğu nispeten güvenilir bir aşama göstergesidir (Şekil 2).</li>
</ol>2. Transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon
<ol><li>Petri kabını sahneye bantlayarak sıkıca bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. NOT: Toplanan kademeli seminifer tübül segmentlerinin karıştırılmasına neden olabilecek hareketini önlemek için Petri kabını iyi bantlamak önemlidir.</li>
	<li>Odak altındaki seminifer tübüllerin ışık emme desenini ortaya çıkarmak için, numunenin aşağıdan aydınlatıldığından ve ışığın numuneden geçtiğinden, yanitransilüme olduğundan emin olun. NOT: Emilen / saçılan ışık miktarı, uzun spermatidlerdeki kromatin yoğuşma seviyesine ve seminifer tübül içindeki tomurcuklanmalarına göredir: ne kadar yoğun olursa, o kadar fazla ışık emilir, yanidaha koyu görünür.</li>
	<li>İnce tokalar kullanarak tübül demetlerini dikkatlice hareket ettirerek Şekil 2, Şekil 5A ve Şekil S1'de açıklandığı gibi farklı aşamaların ışık emme desenini tanıyın. NOT: Aşamalar her zaman birbirini mantıksal bir düzende takip ederek seminifer epitel dalgasını oluşturur. Bununla birlikte, spermatojenik dalganın yönünün zaman zaman tersine döndüğünü ve daha sonra tekrar geri döndüğünü bilmek önemlidir (modülasyonlar olarak da bilinir4,9), bazen prosedürü zorlaştırır. Ayrıca, her aşamanın uzunluğu, kaç mm tübül açısından önemli ölçüde değişir.</li>
	<li>Kancalı uçlu önseçimleri kullanarak ilgi borularını dikkatlice kaldırın ve ardından mikrodiseksiyon makası kullanarak uygun uzunlukta bir segment kesin (bkz. Ek Video 1). Yabanatı ucundaki bir kanca, bir tübül kaldırmayı ve tutmayı kolaylaştırır ve sıkmaktan kaçınmaya yardımcı olur. NOT: Kesilecek parçaların uzunluğu aşağı akış uygulamalarına bağlıdır. Protein veya RNA analizi12 , 13(II–V, VII–VIII ve IX–XI, Şekil 5B)için belirli bir aşamanın havuzlu tübüle parçalarının toplanması için uzunluk tipik olarak 2-5 mm'dir. Standart fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanıldığında, 1 mm tübülden yaklaşık 200 ng RNA elde edilebilir. Kademeli tübül parçalarının tam montajlı boyanması için, parçaların uzunluğu >5 mm olmalıdır. Kabak preparatları için segmentlerin uzunluğu 1-2 mm'yi geçmemelidir, çünkü segmentin ortasındaki hücreler çok uzunsa çıkamayabilir. Boru uzunluğunun doğru ölçümü için Petri kabının altında bir mm ölçek kullanın.</li>
</ol>3. Farklı preparatların immünostaining
<ol><li>Kabak hazırlama: aşama doğrulaması ve immünostaining NOT: Aşamaya özgü tübül parçaları, faz kontrastlı mikroskopi ve sonraki immünostaining ile canlı hücrelerin morfolojik analizini yapmak için bir kapak camı ile mikroskop kaydırağı üzerinde ezilebilir. Transillumination destekli mikrodiseksiyon yöntemi ile tanışırken aşamaları doğrulamak için yeni başlayanların bu yaklaşımı kullanması önerilir.<ol>
<li>Segmenti pipet kullanarak 10 μL hacimde toplayın ve mikroskop slaydına taşıyın.</li>
		<li>Tübül üzerine dikkatlice bir kapak camı (20 mm x 20 mm) yerleştirerek tübülleri ezin. Sonuç olarak, hücreler tübülden akacak ve canlı hücreli bir monolayer oluşturacaktır. Hücrelerin yayılmasını kolaylaştırmak için kapak camının kenarına bir filtre kağıdı yerleştirin. Hücreleri hayatta tutmak için çok fazla ezmekten kaçının.</li>
		<li>Mikroskop altında yayılan hücreyi izleyin. Mevcut hücre tiplerini inceleyerek sahne tanımayı doğrulamak için 40x hedefinde bir faz kontrastı mikroskobu kullanın (Şekil 2, Şekil S2).</li>
		<li>Hücreler tübüllerin her iki ucundan yuvarlak bir monolayer oluşturmak için yayıldıktan sonra, kaydırağı forsepsle tutarken sıvı azot içeren bir kaba batırın. 10 sn su altında tutun. Alternatif olarak, kaydırağı donmak için kuru bir buz plakasına yerleştirin.</li>
		<li>Kapak camını neşter kullanarak kapatarak çıkarın.</li>
		<li>Gecikmeden, sabitleme işlemine devam edin ve slaydı 2-5 dakika boyunca% 90 etanol içeren bir kaba hızlı bir şekilde yerleştirin. NOT: % 90 etanol'e yerleştirmeden önce kabak hazırlığının çözülmediğinden emin olun. Aseton gibi diğer fiksatifler de 10 dakika boyunca kullanılabilir.</li>
		<li>Hava kurutun ve oda sıcaklığında (RT) (bazı günlere kadar) veya -80 °C'de (uzun süreli) saklayın.</li>
		<li>İmmün yetinme için, örnekleri RT'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) düzeltin.</li>
		<li>PBS'de durulayın ve PBS'de %0,1 Triton X-100 ile 5 dakika geçirgenlik sağlar.</li>
		<li>PBS'de durulayın ve her kabak örneğinin etrafına bir gres halkası çizin.</li>
		<li>Gres halkasının içine PBS'de (PBST) %0,1 Araya %10 BSA (sığır serum albümini) 50–100 μL ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca örnekleri engelleyin.</li>
		<li>BSA çözeltisini çıkarın ve PBST'de % 10 BSA'da seyreltilmiş birincil antikorla RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PBST ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
		<li>PBST'de %10 BSA'da seyreltilmiş ikincil bir antikor ile kuluçkaya yatır. NOT: Acrosomes leke için, örnekler rhodamin etiketli Yer fıstığı agglutinin antikoru (PNA, 1:1000) ile pbst%10 BSA'da 1 saat rt(Şekil S3)yerine spesifik primer ve sekonder antikorlar yerine inkübe edilebilir.</li>
		<li>PBST ile her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın, PBS ile durulayın ve DAPI içeren bir montajcı ile monte edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Seminifer tübüllerin tüm montajlı immünostainingi NOT: Aşağıdaki protokol, aşamalı (adım 2.4'ten itibaren) tübül segmentleri için tam montajlı boyamayı açıklar. Bir araştırmacı evreleme yapmadan tam montajlı boyama yapmak istiyorsa (adım 1.5'ten itibaren), 3.2.1 ve 3.2.7'deki notlara dikkat edin.<ol>
<li>Pipet kullanarak, tübül parçalarını (adım 2.4'ten itibaren) buz gibi PBS'deki 15 mL konik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tortulanmalarını sağlar. NOT: 1,5.'den itibaren etiketlenmemiş tübüller kullanıyorsanız, bir Petri kabındaki tübülleri birkaç kez eğik bir tabağa borulayarak ayırın. Kesik uçlu 1 mL pipet kullanın. Bu adım, dokunun yapısını açmak için tasarlanmıştır. Ancak, tübüllere zarar verebileceğinden çok fazla pipetlemeden kaçının. Tübüllerin çökeltilmesi birkaç saniye sürecektir. Küçük tübül parçaları, interstisyel hücreler ve hücre kalıntıları süpernatantta kalır.</li>
		<li>Borulama veya aspiratör ile süpernatant (SN) dikkatlice çıkarın. 10 mL buz gibi PBS ekleyin ve ters çevrilerek karıştırın.</li>
		<li>Tortuya izin verin ve daha önce olduğu gibi SN'yi çıkarın.</li>
		<li>%4 PFA'nın 5 mL'sini ekleyin ve +4 °C'de dönen bir masaya (20-30 rpm) 5 saat sabitleyin. NOT: Fiksasyon süresi, ilgi çekici proteinlere ve bunların hücre altı lokalizasyonuna bağlıdır. Nükleer ve sitoplazmik proteinler için, 2 saat fiksasyon tipik olarak yeterlidir, ancak GFRα1 (GDNF aile reseptörü alfa 1; Şekil 6A,B), 6 saate kadar daha uzun bir fiksasyondan yararlanın.</li>
		<li>Tortuya izin verin, SN'yi (PFA) daha önce olduğu gibi çıkarın ve 10 mL PBS ekleyerek ve tüpü ters çevirerek kısa bir süre durulayın.</li>
		<li>Tortuya izin verin, SN'yi daha önce olduğu gibi çıkarın ve PBS yıkama adımını +4 °C'de dönen bir masada her biri en az 10 dakika boyunca üç kez tekrarlayın ve boyamaya devam edin veya +4 °C'de saklayın. NOT: Çalışma koşulları sterilse ve temizlenirse numuneler en az birkaç hafta saklanabilir ve kullanılabilir. Alternatif olarak, +4 °C'de depolamadan önce tübüllerin korunmasına yardımcı olmak için% 2 stok çözeltisinden% 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona Sodyum Azide ekleyin.</li>
		<li>1 mL pipet kullanarak, 10-20 sabit boru segmentini 2 mL yuvarlak tabanlı bir tüpe taşıyın. Tortuya izin verin ve SN'yi çıkarın. NOT: Sahnelendirilmemiş uzun tübüllerle çalışıyorsanız, tübülleri bir Petri kabına dökün ve mikrodiseksiyon makası ve yaklaşık 5-20 mm'lik kesme parçaları kullanarak. Boyama işlemi sırasında çok uzun segmentler karışırken, çok kısa segmentler kolayca kaybolur.</li>
		<li>PBS'de (PBSX) %0,3 Triton X-100'e %2 BSA + %10 FBS (fetal sığır serumu) 1 mL ekleyin. RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) en az 1 saat boyunca bloklayın.</li>
		<li>1 mL PBSX ile durulayın, pipetleme ile SN'yi çıkarın ve PBSX'te % 1 BSA'da seyreltilmiş 250 μL birincil antikor ekleyin (1:100–1:2000 seyreltme). RT'de 2 saat veya dönen bir masada (20-30 rpm) +4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Antikor çözeltisini pipetleme ile çıkarın ve tübülleri yukarıdaki gibi 1 mL PBSX ile durulayın. PBSX'te RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) 1 saat boyunca üç kez yıkayın. NOT: Bu ilk yıkamadan sonra numune gerekirse gece boyunca +4 °C'de bırakılabilir.</li>
		<li>SN'yi çıkarın ve PBSX'te % 1 BSA'da seyreltilmiş 250 μL ikincil antikor ekleyin (tipik olarak floresan etiketli bir antikorun 1:500 seyreltilmesi). Folyoya örtün ve 1 saat boyunca RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>3.2.10'ı tekrarlayın.</li>
		<li>Son olarak SN'yi çıkarın ve tübülleri bir mikroskop slaydına dökün. Jel yükleme uçlarını kullanarak tübülleri doğrusal şeritler halinde hafifçe ayırın ve düzenleyin. Fazla tamponu boşaltın ve montaj ortamı ve kapak kılıfı ekleyin. NOT: Tübülleri düzenlerken kurutmaktan kaçının. Çekirdeklerin DAPI ile karşı lekelenmesi çoğu durumda gerekli değildir. Numunenin kurumasını ve bozulmasını önlemek için kapak kapağının kenarını oje ile kapatın. Slaytlar görüntülemeden önce +4 °C'de 1-2 hafta saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+Physiology%3A+Seminiferous+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).</li>
<li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li>
<li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals%3A+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li>
<li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li>
<li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+Physiology-Overview+and+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).</li>
<li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li>
<li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).</li>
<li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+LD+%22Histological+and+histopathological+evaluation+of+the+testis%22">Histological and histopathological evaluation of the testis</a>. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).</li>
<li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+%22in+situ%22+analyses+of+DNA+polymerase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li>
<li>Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).</li>
<li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li>
<li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li>
<li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li>
<li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li>
<li>Mäkelä, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).</li>
<li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827(2018).</li>
<li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li>
<li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).</li>
<li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li>
<li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375(2020).</li>
<li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis+physiology%3A+Spermatogenic+cell+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+The+commitment+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li>
<li>Mäkelä, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+of+the+Testis+and+Male+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li>
<li>Parvinen, M., Söderström, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yukarıda açıkladığımız transilluminasyon destekli mikrodispeksiyon yöntemi spermatogenez çalışması için aşama odaklı bir yaklaşım sağlamaktadır. Spermatogenez son derece senkronize bir süreçtir, ve spermatojenik farklılaşma sırasındaki tüm önemli adımlar, farklılaşma taahhüdü (VII-VIII aşamalarında), meiosis başlangıcı (VII-VIII), meiotik bölünmeler (XII), spermatid uzama (VIII) başlangıcı ve spermiasyon (VIII) 1,26,27gibi aşamaya bağlı bir şekilde düzenlenir ve yürütülür. Aşama odaklı analiz, spermatogenezin belirli adımlarıyla sınırlı olan ve bu nedenle sadece seminifer epitel döngüsünün tanımlanmış aşamalarında bulunan bu özel olayları incelemek için güçlü bir araç sağlar. Yöntemde ustalaşmak biraz pratik gerektirir ve kaliteli bir diseksiyon mikroskobu ve uygun aydınlatıcı koşulların kullanılması başarının anahtarıdır. Bu yöntemin günlük araç setinin bir parçası olarak uygulanması, spermatogenez sırasında moleküler olayların daha doğru bir şekilde parçalanmasına izin vererek araştırmaların erkek üreme fonksiyonları üzerindeki etkisini ve biyolojik alaka düzeyini büyük ölçüde iyileştirme kapasitesine sahiptir.
Üzerinde incelediğimiz tüm WT fare suşları benzer bir transilüminasyon deseni gösterir ve seminifer epitel döngüsünün aşamalarında korunmuş hücre ilişkileri sergiler. Mikrop hücrelerinin spermiojenik farklılaşması WT farelerinden çok farklı olmamak koşuluyla, aynı şey incelediğimiz tüm nakavt fare modelleri için de geçerlidir. Ayrıca, seminifer epitel döngüsünün aşamalarının boyuna segmental düzenlemesini sergileyen diğer türlere uygulanabilir7. Bununla birlikte, segmental olmayan aşamalara sahip türler (insan gibi) kullanılamaz. Kromatin yoğuşmasının transilluminasyon desenini tanımlamada spermatidlerin uzamasındaki temel rolü göz önüne alındığında, bu sürecin herhangi bir yanlış tanımlanmasının kaçınılmaz olarak bu yöntemin uygulanmasına engel olacağı açıktır. Genç farelerde ve genç yetişkinlerde (5-6 hafta) transilluminasyon deseni henüz tam olarak belirlenmemiştir ve bu nedenle sadece 8 haftadan büyük fareler kullanılmalıdır. Tübülleri sıkmanın ve çekmenin kaçınılmaz olarak transilluminasyon desenini engelleyeceğini akılda tutulması da önemlidir, çünkü seminifer epitel içindeki hücresel mimariyi bozar.
İzole seminifer tübül segmentleri, meiosis de dahil olmak üzere spermatogenez bağlantılı süreçlerin ek vivo gözlem ve manipülasyonu sağlayan kültüre edilebilir. Dokunun canlılığını sağlamak ve RNA ve protein bozulmasını önlemek için, örnekler toplanması ve fareden ödün verdikten en fazla 2 saat sonra işlenmesi gerekir. Seminifer tübüllerin ex vivo kültürü için, fedakarlıktan kültürün başlangıcına kadar geçen süre 1 saati geçmemelidir. Tübül parçalarının bütünlüğü, uygun şekilde hasat edilirse tipik olarak 72 saate kadar in vitro olarak korunabilir.
Seminifer epitel döngüsünün aşaması, kabak preparatlarının faz kontrastlı mikrokroskopisi kullanılarak doğrulanabilir ve daha da doğru tanımlanabilir16. Mikroskopi, analize ek bir boyut sağlayan ve spermatogenez28 , 29,30'unbelirli aşamalarında organel veya hücre hareketlerinin gözlemlenmesini sağlayan canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Faz kontrastlı mikroskopi, spermatogenez sırasında protein ekspresyolü ve lokalizasyon dinamiklerinin çok ayrıntılı analizini sağlayan, evreye özgü değişiklikler de dahil olmak üzere sonraki immünostaining için tam evreleme sağlar.
Hücreler kabak preparatlarında epitel bağlamından salınırken, tübül segmentlerinin bütün montajlı immünostainleri spermatojenik hücrelerin fizyolojik ortamlarında incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tüm montaj preparatları, seminifer tübül mimarisinin ve hücreler arası temaslarının kesitlerde immünostainlemeden daha iyi bir görselleştirilmesini sağlayabilir. Daha da önemlisi, tübül segmentlerinin immünostainasyondan önce transilluminasyon destekli evrelemesi, belirli bir segmentin belirli aşaması hakkında bilgi vererek yaklaşımı daha da güçlü hale getirir. Tüm montajlı boyama, peritubular miyoid hücreler, peritubuler makrofajlar ve spermatogonia gibi seminifer tübüllerin çevresindeki hücrelerin incelenmesi için özellikle yararlı bir araçtır, ancak meiotik ve postmeiotik mikrop hücreleri hakkındaki araştırmalara yeni içgörüler de açabilir.

Erkek mikrop hücrelerinin diploid spermatogonia'dan olgun haploid spermatozoa, yanispermatogenez'e farklılaşması, cinsel olarak olgunlaşmış bir bireyin testislerinde seminifer tübüllerin epitelinde gerçekleşen karmaşık bir süreçtir1. A1 spermatogonia'nın mitotik torunları, farklılaşmaya bağlı popülasyonu genişletmek için önce beş kez bölünür, daha sonra sonuçta haploid spermatidlere yol açan spermatositler olarak meyoza girerler. Yuvarlak spermatidlerin spermatozoa, yanispermiogenez olarak farklılaştırılması, nükleer sıkıştırma ve akrozom ve flagellum gibi sperme özgü yapıların inşası da dahil olmak üzere hücresel morfolojide karmaşık değişiklikler içerir. Farede, spermatogenezin tüm sürecinin tamamlanması 35 gün sürer2,3.
Herhangi bir lokalde, seminifer epitel, farklılaşan mikrop hücrelerinin beş kohortunun yanı sıra germline kök / progenitör hücreler ve somatik Sertoli hücreleri1'ekadar barındırır. Farklılaşan mikrop hücreleri, bileşimi öngörülebilir olan eşmerkezli katmanlar oluşturur ve belirli bir gelişim adımındaki haploid hücreler her zaman belirli spermatosit türleri ve spermatogonia4,5ile ilişkilendirilir. Bu nedenle, bir tübüllerin herhangi bir kesiti, sabit bir bileşimin mikrop hücrelerinin kohortlarını barındırır. Bu spesifik hücre ilişkileri seminifer epitelyumun evreleri olarak tanımlanır. Kendi başına aşamalar durgun kontrol noktası benzeri durumlar sunmaz, ancak mikrop hücre kohortlarının farklılaşması senkron 1 ,2,6'dailerledikçe sürekli olarak gelişir. Farelerde, seminifer tübülünün boyuna ekseni boyunca segmental bir şekilde düzenlenmiş12 aşama (I-XII) 2 vardır ve birbirlerini mantıksal bir düzende takip ederler, böylece seminifer epitel dalgasını veya spermatojenik dalga 7,8,9 (Şekil 1)oluştururlar. Spermatogenezin tamamlanması dört döngü sürer ve herhangi bir seminifer tübül kesiti içindeki farklılaşan mikrop hücrelerinin hiyerarşik katmanları veya kohortları zamansal olarak birbirinden bir seminifer döngüsüdir. Döngünün uzunluğu türlere bağlıdır ve farede her döngü 8,6 günsürer 10.
Aşamalar histolojik testis bölümleri5 (Şekil 1 ve Şekil 2)üzerinde seminifer epitel hücresel bileşimi ve organizasyonu temelinde tanımlanabilir. Bununla birlikte, histolojik analiz zahmetli, zaman alıcıdır ve sabitleme ve lekeleme gerektirir ve bu nedenle canlı dokuya uygulanamaz. Daha da önemlisi, döngünün farklı aşamaları tarafından sergilenen farklı ışık emme/saçılma desenlerinden yararlanılarak diseksiyon mikroskobu altında canlı doku üzerinde de evreleme yapılabilir (Şekil 2). Her aşamanın ışığı emme ve dağıtma yeteneği, herhangi bir aşama konakçısının geç meyotik spermatidlerin kromatin yoğuşma seviyesine ve bu hücrelerindemetler halinde paketlenmesinegöredir 7,11. Spermatid farklılaşması, yanispermiogenez, 8 adım yuvarlak spermatid (adım 1-8) ve 8 adım spermatid (adım 9-16) farklılaşması (Şekil 1)dahil olmak üzere 16 gelişimsel adıma ayrılmıştır. Adım 9-11 uzamış spermatidler (aşama IX-XI) sadece düşük miktarda kromatin yoğuşması gösterir ve bu da düşük miktarda ışığın emilmesine neden olur. Kromatin yoğuşması adım 11 spermatidlerde (aşama XI) başlar ve adım 15-16 uzun spermatidler (aşama IV-VIII) tamamen yoğun kromatin içerir ve bu nedenle maksimal ışık emilimi sergiler (Şekil 3). Kromatin sperm kafasına sıkıca paketlenmesi için yoğunlaştırılmalıdır. Işık emilim paternine katkıda bulunan ek faktörler, epitel içindeki spermatidlerin uzama yeridir (bazal ve apikal) ve uzun spermatidlerin bundling 'idir (aşama II-V'de telaffuz edilir)11 (Şekil 3). Demetler, tübüllerin ortasında ve bir diseksiyon mikroskobu altında kenarlarda çizgiler olarak görülür ve kromatin ne kadar yoğunlaştıysa, nokta / şerit11daha koyudur.
Bu makalede, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden seminifer tübül segmentlerinin izolasyonu için transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon yönteminin kullanımı açıklanmaktadır. İzole edildikten sonra, aşamalı tübül segmentleri biyokimyasal RNA ve protein analizleri12 , 13,14, 15,akış sitometrisi16, ex vivo tübül kültürü17ve immünostaining18 dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış analizlerine tabi tutulabilir. Burada ayrıca, canlı hücre morfolojik analizi ve sonraki immünostaining için sahnelenmiş tübül segmentlerinin ezilmiş monolayerlerini ve tübül segmentlerinin tam montajlı immünostaininglerini hazırlamak için ayrıntılı aşağı akış protokolleri sunuyoruz. Şekil 4'teaçıklanan özetle iş akışı.
Transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon yöntemi, aşamaların senkronize hücresel bileşimi sayesinde mikrop hücrelerinin belirli farklılaşma adımlarında doğru tanımlanmasını ve izolasyonunu sağlar. Daha da önemlisi, spermatogenez sırasında evreye bağlı olayların canlı doku üzerinde incelenmesini sağlar. Spermatogenez için ölçeklenebilir in vitro modellerin eksikliği göz önüne alındığında, bu yöntem aynı zamanda sahneye özgü tübül segmentleri üzerinde hedeflenen kısa vadeli gelişimsel ve toksikolojik çalışmalara izin vermenin benzersiz bir avantajına sahiptir ex vivo12,17. Burada fare için yöntemi açıklarken, aynı prosedür sıçan 4 , 7,15 , 19,20gibiseminifer epitel aşamalarının boyuna ve segmental düzenlemesine sahip herhangi birmemelitürüne uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>kapak camı 20x20 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Falcon konik tüp 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>gres kalemi (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop lamı Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (100 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>rodamin etiketli Fıstık aglütininin (PNA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

aşağı akış İmmünasyon analizleri için fare seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarının transilluminasyon destekli diseksiyonu

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenez, sonuçta vücudun en farklı hücre türlerinden biri olan sperme yol açan benzersiz bir farklılaşma sürecidir. Mikrop hücrelerinin farklılaşması, 4 ila 5 nesil mikrop hücresine aynı anda ev sahipliği yapan ve gelişimlerini koordine eden ve senkronize eden somatik Sertoli hücrelerinin sitoplazmik ceplerinde gerçekleşir. Bu nedenle, bir kesit içindeki mikrop hücre tiplerinin bileşimi sabittir ve bu hücre ilişkileri seminifer epitel döngüsünün aşamaları (I–XII) olarak da bilinir. Daha da önemlisi, aşamalar, transilüminasyon ile ortaya çıkan diferansiyel ışık emilimi / saçılma özelliklerine ve aşamaların tübül boyunca birbirini sayısal bir sırada takip etmesine bağlı olarak bozulmamış seminifer tübüllerden de tanımlanabilir. Bu makalede, fare seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden seminifer tübül segmentlerinin izolasyonu için transilluminasyon destekli bir mikrodispeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Seminifer tübüllerin ışık emme deseni önce diseksiyon mikroskobu altında incelenir ve daha sonra belirli aşamaları temsil eden tübüle segmentleri kesilir ve aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, aşamaya özgü kabak preparatları ve sağlam tübül segmentleri için immünostaining protokollerini açıklıyoruz. Bu yöntem, bir araştırmacının spermatogenezin belirli aşamalarında gerçekleşen biyolojik olaylara odaklanmasını sağlar, böylece spermatogenez ve alttaki moleküler mekanizmaların gelişimsel, toksikolojik ve sitolojik çalışmaları için benzersiz bir araç sağlar.

Bu protokol, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden yetişkin fare seminifer tübüllerinin segmentlerinin transilluminasyon destekli mikroseksiyonunu ve buradaki hücre tiplerini ve daha sonra kabak preparatlarının ve bozulmamış tübül segmentlerinin immünostainasyonunu açıklar.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Bu yöntem, evreye özgü seminifer tubal segmentlerin tanımlanmasını ve diseksiyonunu kolaylaştırır ve spermatogenezde çok spesifik adımların incelenmesine olanak tanır. Seminifer epitel döngüsünün aşamaları taze, sabit olmayan tübüllerde tanınabilir ve bu nedenle, aşağı akış analizleri için yalnızca ilgilenilen aşamaları seçebiliriz. Aşamaları transillüminasyon kalıplarına dayanarak tanımayı öğrenmek biraz pratik gerektirir, ancak bu protokol başarınızı sağlamalıdır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora adayı olan Opeyemi Olotu olacak. En az 8 haftalık yetişkin bir erkek fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve ventral karnı% 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın. Abdominal pelvik bölgede v şeklinde bir kesi yapmak için steril makas kullanın ve testisleri bulmak için epididimal yağ pedini çekmek için steril forseps kullanın.Testisleri incelemek için makas kullanın, dokuları hasat edilirken PBS ile steril bir 100 milimetre Petri kabına yerleştirin. Testisleri kaplayan kalın lifli tabaka olan tunika albuginea'da bir yarık kesmek için ince uçlu makas kullanın ve tunikayı yırtmak ve tübülleri dışarı çıkarmak için forseps kullanın. Dekapsüle edilmiş seminifer tübülleri yeni bir Petri kabına yerleştirin ve tabağın altını kaplayacak kadar steril PBS ekleyin.Ardından, dokulara zarar vermeden tübülleri nazikçe ayırmak için forsepsleri kullanın. Tübüllerin diseksiyonu için, çanağı bir diseksiyon mikroskobu aşamasına bantlayın ve transillüminasyonu açın. Farklı aşamaların ışık emilimi ve saçılma desenleri hakkında bilgi sahibi olmak için tübül demetlerini dikkatlice hareket ettirmek için ince forseps kullanın.Ardından, ilgilenilen bir tübülü kaldırmak için çengelli uçlu forseps kullanın ve uygun uzunlukta bir segmenti kesmek için mikrodiseksiyon makası kullanın. Aşamaya özgü tübül segmentlerini kestikten sonra, 10 mikrolitrelik bir PBS hacminde ilgilenilen bir segmenti toplamak için bir pipet kullanın ve segmenti bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Hücreleri çok fazla ezmeden 20 x 20 milimetrelik bir kapak camını tübül üzerine dikkatlice bastırın ve slaytı bir faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin.Hücrelerin tek tabakaya yayılmasını kolaylaştırmak için kapak camının kenarına bir filtre kağıdı yerleştirin ve hücre aşamalarını doğrulamak için 40 kez hedefini kullanın. Hücreler, tübülün her iki ucundan yuvarlak bir tek tabaka oluşturduktan sonra, slaytı 10 saniye boyunca bir sıvı nitrojen kabına daldırın. Kapak camını hücrelerden çevirmek için bir neşter kullanın ve slaytı hemen 2 ila 5 dakika boyunca% 90 etanole yerleştirin.Ardından, havayla kurutun ve slaytı birkaç güne kadar oda sıcaklığında saklayın. Seminifer tübüllerin tam montajlı immün boyaması için, ilgilenilen segmentleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir buz gibi soğuk PBS tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Segmentlerin çökelmesine izin verdikten sonra, PBS'yi dikkatlice çıkarın.10 mililitre taze buz gibi soğuk PBS ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Gösterildiği gibi süpernatanı tekrar çıkarmadan önce tübüllerin birkaç dakika oturmasına izin verin. Süpernatantın tamamı çıkarıldığında, tübülleri 5 santigrat derecede dakikada 20 ila 30 devirde beş saat boyunca 4 mililitre paraformaldehit içinde sabitleyin.İnkübasyonun sonunda, numuneyi taze PBS'de 4 santigrat derecede üç kez rotasyonla yıkama başına 10 dakika boyunca yıkamadan önce tübüllerin birkaç dakika çökmesine izin verin. Son yıkamadan sonra, 10 ila 20 sabit tübül segmentini 2 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın. Segmentler yerleştiğinde, süpernatanı oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon ve dakikada 20 ila 30 devir için PBSX'te 1 mililitre% 2 BSA ve% 10 FBS ile değiştirin.Bloke edici inkübasyonun sonunda, numuneleri 1 mililitre PBSX ile yıkayın. Tübülleri 250 mikrolitre birincil antikor ile etiketlemeden önce, oda sıcaklığında dakikada 20 ila 30 devirde iki saat boyunca PBSX'te% 1 BSA ile seyreltin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri bir saat boyunca 250 mikrolitre uygun ikincil antikorlarla etiketlemeden önce, oda sıcaklığında ışıktan ve dakikada 20 ila 30 devirden korunarak tübülleri PBSX'te gösterildiği gibi üç kez yıkayın.İnkübasyonun sonunda, tübülleri küçük bir hacimde süpernatan içinde bir mikroskop lamı üzerine boşaltmadan önce tübülleri üç kez yıkayın. Ardından, tübülleri doğrusal şeritler halinde düzenlemek ve fazla tamponu boşaltmak için jel yükleme uçlarını kullanın. Ardından, sürgüyü bir lamel ile monte etmeden önce 1 ila 2 damla montaj ortamı ekleyin.Transillüminasyon altında, 7'den 8'e kadar olan aşamalar homojen bir şekilde karanlık görünür, çünkü epitelin apikal yüzeyinde hizalanmış çok sayıda tamamen yoğunlaştırılmış uzamış spermatid içerirler. Spermasyon sırasında olgun spermatozoalar lümene salındıktan sonra, epitel içinde yoğunlaştırılmış uzamış spermatidlerin olmaması nedeniyle tübül 9 ila 10. aşamalarda çok soluk görünür. Bu soluk bölgeyi, sivilceli görünümü, demetler halinde yoğunlaştırılmış kromatin ile uzayan spermatidlerin organizasyonundan kaynaklanan zayıf nokta bölgesi takip eder.Bu demetler, sonraki güçlü nokta bölgesinde çok belirgin hale gelir. Spermatid demetleri, bazal laminaya yakın bulunan Sertoli hücre çekirdeklerine doğru göç eder ve bu, transilluminasyon yapıldığında evre 2 ila 5 tübüllerin çizgili bir görünümü olarak yansır. Demetler nihayet 6. aşamada dağılır ve yoğunlaşan uzayan spermatidler, 8. aşamada epitelden salınmak üzere lümene yaklaşır.Tübül segmentinin tam aşaması, kabak preparatlarının faz kontrast mikroskobu ile doğru bir şekilde doğrulanabilir. Aşamalı kabak preparatlarının immün boyama, seminifer epitelde ilgilenilen proteinlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Seminifer tübül tam montajlı boyama tipik olarak, tübüler veya interstisyel tarafta seminifer epitelin bazal zarı ile temas halinde olan hücre tiplerini incelemek için kullanılır.Yöntem ayrıca, kan-testis bariyeri veya mayotik sonrası germ hücreleri gibi epitel içinde daha derinde bulunan hücreleri veya yapıları incelemek için de kullanılabilir. İmmün boyamaya ek olarak, biyokimyasal RNA ve protein analizleri, akış sitometrisi ve ex vivo tubal kültür dahil olmak üzere diğer birçok aşağı akış analizi için aşama tubal segmentleri kullanabiliriz. Bu yöntem spermatogenezin çok ayrıntılı bir analizine izin verdiği için, sperm üretimi ve erkek doğurganlığı için gerekli tüm önemli süreçleri incelemek için gerçekten yararlı bir araç sağlar.

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, testislerin bir bileşeni olan fare seminifer tübüllerinden Sertoli hücrelerinin izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim ve tekrarlanan yıkamalar, Sertoli hücrelerinin çözeltiye salınmasını teşvik eder, bu da çoğalma ve büyüme için daha fazla kültürlenebilir.

Fare Seminifer Tübüllerinden İmmün Düzenleyici Sertoli Hücrelerinin İzolasyonu

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.

Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Öğrenin fare seminifer tübüllerinin transillüminasyon destekli mikrodiseksiyonunu ve aşağı akış immünostaining tekniklerini. Bu yöntem spermatogenezin belirli evrelerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal

Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet