Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Bu yöntem, evreye özgü seminifer tubal segmentlerin tanımlanmasını ve diseksiyonunu kolaylaştırır ve spermatogenezde çok spesifik adımların incelenmesine olanak tanır. Seminifer epitel döngüsünün aşamaları taze, sabit olmayan tübüllerde tanınabilir ve bu nedenle, aşağı akış analizleri için yalnızca ilgilenilen aşamaları seçebiliriz. Aşamaları transillüminasyon kalıplarına dayanarak tanımayı öğrenmek biraz pratik gerektirir, ancak bu protokol başarınızı sağlamalıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora adayı olan Opeyemi Olotu olacak. En az 8 haftalık yetişkin bir erkek fareyi sırtüstü pozisyona getirerek ve ventral karnı% 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın. Abdominal pelvik bölgede v şeklinde bir kesi yapmak için steril makas kullanın ve testisleri bulmak için epididimal yağ pedini çekmek için steril forseps kullanın.

Testisleri incelemek için makas kullanın, dokuları hasat edilirken PBS ile steril bir 100 milimetre Petri kabına yerleştirin. Testisleri kaplayan kalın lifli tabaka olan tunika albuginea'da bir yarık kesmek için ince uçlu makas kullanın ve tunikayı yırtmak ve tübülleri dışarı çıkarmak için forseps kullanın. Dekapsüle edilmiş seminifer tübülleri yeni bir Petri kabına yerleştirin ve tabağın altını kaplayacak kadar steril PBS ekleyin.

Ardından, dokulara zarar vermeden tübülleri nazikçe ayırmak için forsepsleri kullanın. Tübüllerin diseksiyonu için, çanağı bir diseksiyon mikroskobu aşamasına bantlayın ve transillüminasyonu açın. Farklı aşamaların ışık emilimi ve saçılma desenleri hakkında bilgi sahibi olmak için tübül demetlerini dikkatlice hareket ettirmek için ince forseps kullanın.

Ardından, ilgilenilen bir tübülü kaldırmak için çengelli uçlu forseps kullanın ve uygun uzunlukta bir segmenti kesmek için mikrodiseksiyon makası kullanın. Aşamaya özgü tübül segmentlerini kestikten sonra, 10 mikrolitrelik bir PBS hacminde ilgilenilen bir segmenti toplamak için bir pipet kullanın ve segmenti bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Hücreleri çok fazla ezmeden 20 x 20 milimetrelik bir kapak camını tübül üzerine dikkatlice bastırın ve slaytı bir faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin.

Hücrelerin tek tabakaya yayılmasını kolaylaştırmak için kapak camının kenarına bir filtre kağıdı yerleştirin ve hücre aşamalarını doğrulamak için 40 kez hedefini kullanın. Hücreler, tübülün her iki ucundan yuvarlak bir tek tabaka oluşturduktan sonra, slaytı 10 saniye boyunca bir sıvı nitrojen kabına daldırın. Kapak camını hücrelerden çevirmek için bir neşter kullanın ve slaytı hemen 2 ila 5 dakika boyunca% 90 etanole yerleştirin.

Ardından, havayla kurutun ve slaytı birkaç güne kadar oda sıcaklığında saklayın. Seminifer tübüllerin tam montajlı immün boyaması için, ilgilenilen segmentleri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir buz gibi soğuk PBS tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Segmentlerin çökelmesine izin verdikten sonra, PBS'yi dikkatlice çıkarın.

10 mililitre taze buz gibi soğuk PBS ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Gösterildiği gibi süpernatanı tekrar çıkarmadan önce tübüllerin birkaç dakika oturmasına izin verin. Süpernatantın tamamı çıkarıldığında, tübülleri 5 santigrat derecede dakikada 20 ila 30 devirde beş saat boyunca 4 mililitre paraformaldehit içinde sabitleyin.

İnkübasyonun sonunda, numuneyi taze PBS'de 4 santigrat derecede üç kez rotasyonla yıkama başına 10 dakika boyunca yıkamadan önce tübüllerin birkaç dakika çökmesine izin verin. Son yıkamadan sonra, 10 ila 20 sabit tübül segmentini 2 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın. Segmentler yerleştiğinde, süpernatanı oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon ve dakikada 20 ila 30 devir için PBSX'te 1 mililitre% 2 BSA ve% 10 FBS ile değiştirin.

Bloke edici inkübasyonun sonunda, numuneleri 1 mililitre PBSX ile yıkayın. Tübülleri 250 mikrolitre birincil antikor ile etiketlemeden önce, oda sıcaklığında dakikada 20 ila 30 devirde iki saat boyunca PBSX'te% 1 BSA ile seyreltin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri bir saat boyunca 250 mikrolitre uygun ikincil antikorlarla etiketlemeden önce, oda sıcaklığında ışıktan ve dakikada 20 ila 30 devirden korunarak tübülleri PBSX'te gösterildiği gibi üç kez yıkayın.

İnkübasyonun sonunda, tübülleri küçük bir hacimde süpernatan içinde bir mikroskop lamı üzerine boşaltmadan önce tübülleri üç kez yıkayın. Ardından, tübülleri doğrusal şeritler halinde düzenlemek ve fazla tamponu boşaltmak için jel yükleme uçlarını kullanın. Ardından, sürgüyü bir lamel ile monte etmeden önce 1 ila 2 damla montaj ortamı ekleyin.

Transillüminasyon altında, 7'den 8'e kadar olan aşamalar homojen bir şekilde karanlık görünür, çünkü epitelin apikal yüzeyinde hizalanmış çok sayıda tamamen yoğunlaştırılmış uzamış spermatid içerirler. Spermasyon sırasında olgun spermatozoalar lümene salındıktan sonra, epitel içinde yoğunlaştırılmış uzamış spermatidlerin olmaması nedeniyle tübül 9 ila 10. aşamalarda çok soluk görünür. Bu soluk bölgeyi, sivilceli görünümü, demetler halinde yoğunlaştırılmış kromatin ile uzayan spermatidlerin organizasyonundan kaynaklanan zayıf nokta bölgesi takip eder.

Bu demetler, sonraki güçlü nokta bölgesinde çok belirgin hale gelir. Spermatid demetleri, bazal laminaya yakın bulunan Sertoli hücre çekirdeklerine doğru göç eder ve bu, transilluminasyon yapıldığında evre 2 ila 5 tübüllerin çizgili bir görünümü olarak yansır. Demetler nihayet 6. aşamada dağılır ve yoğunlaşan uzayan spermatidler, 8. aşamada epitelden salınmak üzere lümene yaklaşır.

Tübül segmentinin tam aşaması, kabak preparatlarının faz kontrast mikroskobu ile doğru bir şekilde doğrulanabilir. Aşamalı kabak preparatlarının immün boyama, seminifer epitelde ilgilenilen proteinlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Seminifer tübül tam montajlı boyama tipik olarak, tübüler veya interstisyel tarafta seminifer epitelin bazal zarı ile temas halinde olan hücre tiplerini incelemek için kullanılır.

Yöntem ayrıca, kan-testis bariyeri veya mayotik sonrası germ hücreleri gibi epitel içinde daha derinde bulunan hücreleri veya yapıları incelemek için de kullanılabilir. İmmün boyamaya ek olarak, biyokimyasal RNA ve protein analizleri, akış sitometrisi ve ex vivo tubal kültür dahil olmak üzere diğer birçok aşağı akış analizi için aşama tubal segmentleri kullanabiliriz. Bu yöntem spermatogenezin çok ayrıntılı bir analizine izin verdiği için, sperm üretimi ve erkek doğurganlığı için gerekli tüm önemli süreçleri incelemek için gerçekten yararlı bir araç sağlar.