Name: Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin, Salmonella enteritidis'te micC geni silme mutantı oluşturma yöntemini. λ-Red aracılı recombination sistemi kullanarak virülans genleri inaktive edilir ve aşı adayları geliştirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 31972651 ve 31101826), Jiangsu Yüksek Öğretim Bilim Vakfı (No.14KJB230002), Veteriner Biyoteknoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı (No.SKLVBF201509), Yangzhou Doğa Bilimleri Vakfı Hibesi (No.YZ2014019), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi. Yangzhou Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, hayvanlar üzerinde uygulanan tüm deney ve prosedürleri onayladı (SYXK2016-0020).
1. Bakteriyel suşlar, plazmidler ve kültür koşulları
<ol><li>Tablo 1'de listelenen bakteri ve plazmidleri kullanın.</li>
	<li>LB suyunda veya LB agar plakalarında 37 °C'de, uygun olduğunda 50 μg / mL ampisilin (Amp) varlığında kültür bakterileri.</li>
	<li>Sıcaklığa duyarlı plazmidler içeren kültür suşları, 30 °C'de mutant yapımının silinmesi için kullanılır.</li>
</ol>2. S'nin klon micC geni. Enteritidis suşu 50336
<ol><li>S'nin micC geninin yukarı ve aşağı akış dizisine dayanır.Typhimurium suşu SL1344, SE50336 genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak PCR ile micC geni içeren bir parçayı büyütmek için vmicC-F ve vmicC-R primerlerini tasarlar.</li>
	<li>PCR için sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP karışımı (2,5 mM), 1 μL vmicC-F ve vmicC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μLddH2O karıştırın.</li>
	<li>Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.</li>
	<li>MicC gen dizisini elde etmek için PCR ürününü dizileyin.</li>
</ol>3. MicC silme mutantının yapımı
NOT: Salmonella Enteritidis suşu 50336'nın micC-negatif mutantı, daha önce 13,14'te tarif edildiği gibi λ-Kırmızı aracılı rekombinasyon kullanılarak oluşturulmuştur. Kullanılan astarlar Tablo 2'de listelenmiştir.
<ol><li>MicC geninin homoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini güçlendirin.<ol><li>micC geninin 5' ve 3' lerinden 50 bp homoloji uzantıları da dahil olmak üzere plazmid pKD3'ten kloramfenikol (Cm) kasetini yükseltmek için micC-F ve micC-R primerlerini tasarlayın.</li>
		<li>pKD3 plazmidini PCR şablonu olarak ayıklayın.</li>
		<li>PCR reaksiyon karışımı olarak sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL micC-F ve micC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μLddH2O karıştırın</li>
		<li>Cm kasetini aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarıyla güçlendirin: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 52 °C, 10 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 63 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.</li>
		<li>Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin. DNA jel geri kazanım kiti ile PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın ve spektrofotometre ile DNA konsantrasyonunu belirleyin. DİKKAT: PCR iki kez yapılmalıdır. İlk PCR ürünü 1:200 oranında seyreltildi ve pKD3 plazmid tarafından daha fazla rekombinasyonun girişimini ortadan kaldırmak için ikincil PCR için bir şablon olarak kullanıldı.</li>
	</ol></li>
	<li>Yapı 1st rekombinant gerinim 50336ΔmicC::cat
	<ol><li>100 μL SE50336 yetkin hücreleri 5 μL pKD46 plazmid ile eşit şekilde karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Yukarıdaki karışımı 42 ° C'de 90 s boyunca ısıtın ve pKD46 plazmidini SE50336'ya dönüştürmek için karışımı 2 dakika boyunca hızla buza aktarın. Pozitif kolonileri, Amper (50 μg / mL) dirençli bir plaka üzerinde 30 ° C'de gece boyunca kültürleyerek tarayın.</li>
		<li>SE50336/pKD46 sıvı kültürüne 30 mM L-arabinoz ekleyin ve 1 saat boyunca 30 °C'lik bir çalkalama kültürü ile rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Sonra yetkili hücreler hazırlayın.</li>
		<li>100 ng saflaştırılmış PCR ürünü (adım 3.1) ve 40 μL SE50336/pKD46 yetkin hücreleri bir elektrik çarpması kabına (örneğin, Bio-Rad) karıştırın. Voltaj 1.8 kV, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametreleri ile elektrik şoku dönüşümü gerçekleştirin.</li>
		<li>Elektrotransformasyondan sonra, karışımı 1 mL SOC ortamına ve 1 saat boyunca 150 rpm ve 30 ° C'de bir sallama kültürüne aktarın. Daha sonra pozitif koloni taramak için karışımı Cm (34 μg / mL) dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 ° C'de sürün.</li>
		<li>Yukarıdaki pozitif koloni 2 saat boyunca 42 ° C'de kültürlendirin. Amp'ye (50 μg/mL) duyarlı, ancak Cm'ye (34 μg/mL) dirençli koloniyi, pKD46 olmadan 1. rekombinant suşu elde etmek için gece boyunca 37 °C'de tarayın.</li>
	</ol></li>
	<li>1. rekombinant suşu 50336ΔmicC::Cat'i tanımlayın.<ol><li>PCR şablonu olarak 50336ΔmicC::Cat genomik DNA'sını ayıklayın. Adım 2.1'deki PCR reaksiyonu bileşenlerinin aynısını kullanın. PCR reaksiyonunu adım 2.1'deki gibi aynı koşullarla gerçekleştirin.</li>
		<li>Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin ve PCR ürününü sıralayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yapı silme mutantı 50336ΔmicC.
	<ol><li>100 ng plazmid pCP20'yi 40 μL'lik 50336ΔmicC::Cat yetkili hücrelerine 1,8 kV gerilim, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametrelerine sahip hücreler, 30 °C'de hem Amper (50 μg/mL) hem de Cm (34 μg/mL) dirençli plaka üzerinde pozitif transformantları elekler.</li>
		<li>Pozitif transformantların üzerinde dirençli olmayan LB'ye aktarın ve gece boyunca 42 ° C'de kültüre alın ve daha sonra 37 ° C'de bir LB plakası üzerindeki tek kolonileri izole edin. Hem Amp hem de Cm'ye duyarlı olan koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE50336Δ micC'dir.</li>
		<li>50336ΔmicC'yi PCR ile doğrulayın.<ol><li>50336ΔmicC genomik DNA'yı PCR şablonu olarak ayıklayın. PCR için 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μL ddH2O karıştırın.</li>
			<li>Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. MicC kompleman geriniminin yapımı
<ol><li>NheI ve SalI kısıtlama bölgelerine sahip pBR-micC-F ve pBR-micC-R astarları tasarlayın.<ol><li>Şablon olarak 5 μL SE50336 genomik DNA, primer olarak 1 μL pBR-micC-F ve 1 μL pBR-micC-R, 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM), 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM) ve 35 μL ddH2O içeren PCR reaksiyon karışımını kullanarak tam uzunlukta micC genini yan dizilerle güçlendirin.</li>
		<li>Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 50 s için 52 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma. PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kısıtlama enzimi NheI ve SalI kullanarak sırasıyla PCR ürününü ve plazmid pBR322'yi sindirin ve plazmid pBR322-micC'yi elde etmek için gece boyunca 16 ° C'de T4 ligaz kullanarak bunları bağlayın.</li>
	<li>pBR322-micC'yi SE50336ΔmicC yetkin hücrelerine dönüştürün ve tamamlanmış SE50336ΔmicC/pmicC suşunu elde etmek için pozitif dönüştürücüyü elin. Plazmid pBR322-micC'yi tamamlanmış suştan çıkarın ve kısıtlama enzimi sindirimi ve dizilimi ile doğrulayın.</li>
</ol>5. RNA izolasyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR
<ol><li>Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC , LB ortamında gece boyunca 24 ° C'de 180 rpm ile 2.0'lık bir OD600'e kadar sallanır. 2 dakika boyunca 13000 rpm'de santrifüjleme yoluyla bakteri kültürü toplayın.</li>
	<li>TRIzol reaktifini kullanarak toplam RNA'yı ekstrakte edin. DNA'yı çıkarmak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de 2 μL DNaseI ve 6 μL 10x tampon ile 50 μL izole RNA'yı inkübe edin. 1 μL RNA örneğini bir mikro spektrofotometreye pipetleyerek RNA miktarını belirleyin.</li>
	<li>cDNA sentezi<ol><li>20 μL ters transkripsiyon reaksiyon sisteminde cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın (4 μL 5x tampon, 1 μL RT Enzim karışımı, 1 μL RT primer karışımı, 10 μL toplam RNA ve 4 μL ddH2O). Reaksiyon sisteminin üzerinde 37 ° C'de 15 dakika ve daha sonra 85 ° C'de 5 s boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef genlerin ompA, ompC ve ompD dizisine dayalı primerler tasarlayın. Bir RT reaktif kiti kullanarak ters transkripsiyon-PCR gerçekleştirin. PCR reaksiyon bileşenleri 2.5 μLof 10x PCR reaksiyon tamponu, 1 μL dNTP karışımı (2.5 mM), 1 μL hedef gen (ompA, ompC veya ompD) primerleri, 2.5 μL şablon, 0.5 μL Taq DNA polimeraz ve 17.5 μL ddH2O içerir.<ol><li>Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika boyunca 60 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.</li>
	</ol></li>
	<li>Üçlü bir RT-PCT cihazında SYBR yeşil RT-PCR kitini kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.<ol><li>Aşağıdaki PCR reaksiyon bileşenlerini kullanın: sırasıyla 10 μL 2x SYBR tamponu, 0.4 μLof ileri astar ve ters astar, 0.4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA ve 6.8 μL RNaz içermeyenH2O.</li>
		<li>Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: bir döngü için 1 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon; 5 s için 95 °C, 40 döngü için 34 s için 60 °C.</li>
		<li>Tüm verileri endojen referans geni gyrA'ya normalleştirin. Veri ölçümü için 2-ΔΔCT yöntemini kullanın15.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Virülans tahlilleri
<ol><li>Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC, 24 ° C'de LB orta ila erken sabit fazda (2-3'ün OD600'ü), santrifüjleme ile hasat edilir ve steril PBS'de uygun CFU mL-1'e seyreltilir.</li>
	<li>Fare enfeksiyonları için, kültürlenmiş suşları 10 CFU / 200 μL, 102 CFU / 200 μL ve 103 CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına beş 6-8 haftalık Balb / c fareden oluşan grupları enfekte edin. Kontrol grubuna 200 μL fizyolojik salin enjekte edin.</li>
	<li>Tavuk enfeksiyonları için, üç suşun üzerinde 107 CFU / 200 μL, 108 CFU / 200 μL ve 109 CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına yirmi 1 günlük tavuk gruplarını enfekte edin.</li>
	<li>Hastalık belirtilerini ve deney hayvanlarının ölümlerini günlük olarak izleyin. LD50 (medyan ölümcül doz) 14 d enfeksiyon sonrasını daha önce tarif edildiği gibi hesaplayın16. Veri analiz yazılımını kullanarak verileri işleyin.</li>
	<li>Enfeksiyon gruplarında, taze ölü civcivlerin kalbini, karaciğerini, dalağı, akciğerini ve böbreğini toplayın. Yukarıdaki dokuların 0,5 g'ını ayrı ayrı tartın ve steril işlemle öğütün. Öğütme numunelerini kademeli olarak seyreltin, LB plakasına ve kültürüne 37 ° C'de 8-10 saat yayın. Civciv dokularında kolonize edilen Salmonella suşlarının miktarını kaydedin.</li>
</ol>

<ol><li>Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-mediated+control+in+bacteria%3A+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).</li>
<li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea%3A+who+they+are%2C+what+they+do%2C+and+how+they+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+In+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li>
<li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria%3A+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li>
<li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicC%2C+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li>
<li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li>
<li>Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).</li>
<li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li>
<li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin%2C+OmpD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li>
<li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li>
<li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals%3A+Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Veterinary+Journal+La+Revue+Veterinaire+Canadienne%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).</li>
<li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Vaccin+Immunother%22%5BJournal%5D)">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li>
<li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li>
<li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).</li>
<li>Hébrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li>
<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

S. Enteritidis, genç tavukları enfekte edebilen ve enteritten sistemik enfeksiyona ve ölüme kadar semptomlar üreten önemli bir fakültatif hücre içi patojendir17,18. Ek olarak, S. Enteritidis yetişkin tavuklarda gizli enfeksiyonlara neden olur ve kronik taşıyıcılar kümes hayvanı ürünlerini kirleterek insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden olur19. S. Enteritidis'in patojenik mekanizması daha fazla araştırılmaya devam...

Kodlamayan küçük RNA'lar (sRNA'lar), genellikle proteinleri kodlamayan, ancak bakteri kromozomları 1,2,3'te bağımsız olarak kopyalanabilen 40-400 nükleotid uzunluğundadır. Çoğu sRNA, gen kodlayan bölgeler arasındaki intergenik bölgelerde (IGR'ler) kodlanır ve baz eşleştirme eylemleri yoluyla hedef mRNA'larla etkileşime girer ve hedef genlerin ekspresyonunu transkripsiyon sonrasıseviye 4,5'te düzenler. Madde metabolizmasında, dış membran protein sentezinde, çekirdek algılamada ve virülans gen ekspresyonunda önemli regülasyon rolleri oynarlar5.
MicC, Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium'da bulunan ve OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ve Omp36 6,7,8,9 gibi çoklu dış zar protein ekspresyonunu düzenleyebilen 109 nükleotid küçük RNA transkriptidir. MicC, in vitro ompC mRNA liderine ribozom bağlanmasını inhibe ederek OmpC ekspresyonunu düzenler ve Escherichia coli6'daki işlevi için Hfq RNA şaperonunu gerektirir. Salmonella Typhimurium'da MicC, ompD mRNA'yı kodlama dizisi içinde bir ≤12-bp RNA dubleks aracılığıyla susturur (kodonlar 23-26) ve daha sonra endonükleolitik mRNA7'nin dengesini bozar. Bu düzenleme süreci şaperon proteini Hfq10 tarafından desteklenir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi besin ve toksin konsantrasyonlarının yüksek olduğu ortamlarda önemli olduğu düşünülen bol miktarda bir dış zar proteinidir6. OmpD porin, Salmonella Typhimurium'daki en bol dış zar proteinidir ve toplam hücre proteini11'in yaklaşık% 1'ini temsil eder. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar12. MicC ayrıca hem OmpC hem de OmpD porinlerinin ifadesini bastırır. MicC'nin virülansı düzenleyebileceği düşünülmektedir. MicC tarafından düzenlenen yeni hedef genleri keşfetmek ve micC'nin virülans düzenleme fonksiyonunu incelemek için, micC genini Salmonella Enteritidis (SE) suşu 50336'da klonladık ve daha sonra mutant 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / p micC'yi inşa ettik. Yeni hedef genler qRT-PCR ile tarandı. 50336ΔmicC'nin virülansı fareler ve tavuk enfeksiyonları tarafından tespit edildi.

<table><tbody><tr>et <td>suyu hazırlama için</td> <td>dekstroz</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610219</td></tr><tr><td>DNA saflaştırma için DNA saflaştırma kiti</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td></td></tr><tr><td>Ex</td><td>Taq TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10017608</td><td>et suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>K2HPO4</td> <td>Et suyu hazırlama için</td> <td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>20032116</td></tr><tr><td>L-Arabinoz</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda;-Kırmızı rekombinasyon</td></tr><tr><td>Mini Plazmid Kiti</td><td>Et</td> suyu hazırlama <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>için TIANGEN DP106 plazmit ekstraksiyonu NaCl Sinopharm Kimyasal Reaktif 10019308(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Et</td><td></td><td>suyu hazırlama için 10002917 Et suyu hazırlama için</td></tr><tr><td>PrimeScriptRRT reaktif Kiti gDNA Silgisi&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premiks Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>Ligasyon</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>15596018</td><td>RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Et suyu hazırlama için</td><td>Tripton</td><td>Oksoit</td><td>LP0042</td></tr><tr><td>Et suyu hazırlama</td>santrifüjü için<td>maya özü</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>santrifüjleme</td></tr><tr><td>Elektroforez cihazı</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Elektroforez</td></tr><tr><td>&nbsp; Bakteriyel dönüşüm için Elektroporasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>BioTek</td><td>Epoch</td><td>Absorbans tespiti</td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>7500 sistemi</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

kodlamayan küçük rna micc, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Kodlamayan küçük RNA (sRNA), transkripsiyon sonrası düzeyde gen ekspresyonunu düzenlemek için yeni bir faktördür. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium'da bilinen bir tür sRNA MicC, dış zar proteinlerinin ekspresyonunu baskılayabilir. Salmonella Enteritidis'te micC'nin regülasyon fonksiyonunu daha fazla araştırmak için, Salmonella Enteritidis suşu 50336'daki micC genini klonladık ve daha sonra λ Kırmızı bazlı rekombinasyon sistemi ve mikC eksprese eden rekombinant plazmid pBR322 taşıyan tamamlanmış mutant 50336Δ micC / p micC ile mutant 50336Δ micC / p micC oluşturduk. qRT-PCR sonuçları, 50336Δ micC'de ompD'nin transkripsiyonunun vahşi tip suşa göre 1.3 kat daha yüksek olduğunu, 50336Δ micC'de ompA ve ompC'nin transkripsiyonunun ise vahşi tip suştakilere göre 2.2 kat ve 3 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunlar, micC'nin ompA ve ompC ekspresyonunu bastırdığını göstermiştir. Aşağıdaki çalışmada, 50336ΔmicC'nin patojenitesi, hem 6 haftalık Balb / c farelerini hem de 1 günlük tavukları enfekte ederek tespit edildi. Sonuç, 6 haftalık Balb / c fareler için vahşi tip suş 50336'nın LD 50'sinin, mutantların 50336ΔmicC ve 50336Δ micC / pmicC'nin sırasıyla 12.59 CFU, 5.01 CFU ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. 1 günlük tavuklar için suşların LD 50'si sırasıyla 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU ve2.54 x 10 8 CFU idi. MicC'nin silinmesinin S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Enteritidis, farelerde ve tavuklarda dış zar proteinlerinin ekspresyonunu düzenleyerek.

Mutant 50336Δ micC ve tamamlanmış gerinim 50336Δ micC /p micC'nin yapımı MicC gen klonu sonucu, bu genin S'ninkiyle 0 özdeşleştiğini gösteren 109 bp'den oluştuğunu gösterdi. Typhimurium. Sekans verilerine dayanarak, silme mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC başarıyla inşa edildi. Ayrıntılı olarak, sıralama ...

Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Bu protokol, gen fonksiyonu çalışması ve bakteriler için mutantları izole etmek üzere kromozomal genleri inaktive etmek için kullanılabilir. Homolog rekombinasyon işlemini basit, hızlı ve son derece verimli hale getirir. Bu tekniği kullanarak, zayıflatılmış aşı için aday olarak kullanılabilecek zayıflatılmış mutantı elde etmek için patojenin virülansla ilişkili genleri silinebilir.MicC geninin hemoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini yükselterek başlayın. MikC geninin beş asal ve üç asal ucundan 50 baz çifti homoloji uzantısı da dahil olmak üzere plazmid PKD3'ten kloramfenikol kasetini yükseltmek için ileri ve geri primerler tasarlayın. Kloramfenikol kasetini yükseltmek için PKD3 plazmidini şablon olarak kullanarak metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirin.Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu belirleyin. Daha sonra ürünü bir DNA jeli geri kazanım kiti ile saflaştırın ve spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu belirleyin. PKD3 plazmidi tarafından daha fazla rekombinasyon girişimini ortadan kaldırmak için ikinci bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.İlk PCR ürününü 1 ila 200 oranında seyreltin ve ikincil PCR için bir şablon olarak kullanın. İlk rekombinant suşu 50336 delta micC nokta kedisini oluşturmak için, 100 mikrolitre SE 50336 yetkin hücreyi beş mikrolitre PKD 46 plazmid ile karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Isı, karışımı 90 saniye boyunca 42 santigrat derecede şoklayın ve plazmidi hücrelere dönüştürmek için iki dakika boyunca hızla buz üzerinde geri aktarın.Hücreleri bir gecede 30 santigrat derecede ampisilin dirençli bir plaka üzerinde kültürleyerek pozitif kolonileri tarayın. Ertesi gün, SE 50336 PKD 46 sıvı kültürüne 30 mili daha fazla L arabinoz ekleyin ve sallanırken 30 santigrat derecede bir saatlik inkübasyonla rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Saflaştırılmış PCR ürününün 100 nanogramını ve 40 mikrolitre SE 50336 PKD 46 yetkin hücreyi bir elektrik çarpması kabında karıştırın.Daha sonra elektrik çarpması dönüşümü gerçekleştirin. Elektro dönüşümden sonra, karışımı bir mililitre SOC ortamına ve bir saat boyunca 150 RPM ve 30 santigrat derecede bir sallama kültürü inkübatörüne aktarın. Pozitif kolonileri taramak için karışımı kloramfenikol dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 santigrat derecede yayın.Pozitif kolonileri iki saat boyunca 42 santigrat derecede kültürleyin. Daha sonra, PKD 46 olmadan ilk rekombinant suşu elde etmek için koloninin ampisilin'e duyarlılık ve kloramfenikol'e karşı direnç açısından gece boyunca 37 santigrat derecede taranması. PCR ve jel elektroforezi kullanılarak 50336 Delta micC nokta kedi genomik DNA'sını çıkardıktan sonra, elektroplaka 100 nanogram plazmid PCP 20, 40 mikrolitre 50336 Delta micC nokta kedi yetkin hücrelerine dönüştürüldü.Hem ampisilin hem de kloramfenikol dirençli plakalardaki pozitif transformantları 30 santigrat derecede tarayın. Pozitif dönüştürücüleri dirençli olmayan LB sıvı ortamına aktarın ve gece boyunca 42 santigrat derecede kültüre alın. Daha sonra tek kolonileri 37 santigrat derecede bir LB plakasında izole edin.Hem ampisilin hem de kloramfenikol'e duyarlı koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE 50336 Delta micC'dir. Metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirerek 50336 Delta micC'yi doğrulayın.Bu protokol, iltifat edilen mutant 50336 Delta micC, pmicC'deki silme mutantı 50336 Delta micC'yi oluşturmak için kullanıldı. İlk rekombinant 50336 Delta micC nokta kedisi, vahşi tip suştaki 279 baz çiftine kıyasla, kloramfenikol yerleştirmeli yaklaşık 1200 baz çift PCR ürününün beklenen bant büyüklüğü ile PCR tarafından doğrulandı. İkinci rekombinasyonda, kloramfenikol kaseti PCP 20 tarafından elimine edildi.Dizileme ile birleştirilen PCR sonuçları, izojenik micC mutantının başarıyla inşa edildiğini doğruladı. 50336, 50336 Delta micC ve 50336 delta micC pmicC suşlarında ompA, ompC ve ompD genlerinin ekspresyonu gerçek zamanlı kantitatif PCR ile analiz edildi. OmpA ve ompC ve 50336 delta micC'nin transkripsiyonu, vahşi tip suşa kıyasla yaklaşık 2.2 kat ve üç kat artmıştır.OmpD'nin transkripsiyonu sadece biraz artarken. LD 50 tahlilleri, altı ila sekiz haftalık BALB / c farelerini üç suşun her biriyle enfekte ettikten sonra, 50336 Delta micC ile enfekte olmuş farelerin çoğunun, enfeksiyondan 48 saat sonra halsizlik, iştahsızlık veya ishal gösterdiğini ve 96 saat sonra öldüğünü göstermiştir. Vahşi tip suş ve 50336 delta micC pmicC ile enfekte olan fareler, enfeksiyondan 72 saat sonra aynı semptomları gösterdi ve 120 saat sonra öldü.Üç suşun LD 50'leri, mutant 50336 Delta micC'nin virülansının vahşi tipe kıyasla 2.5 kat arttığını gösterdi. Bu teknik, araştırmacıların bakteriyel genlerin işlevini incelemelerine ve hedef genleri silerek istenen mühendislik suşunu elde etmelerine yardımcı olur.

a-non-coding-small-rna-micc-contributes-to-virulence-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans.

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi Salmonella enterica Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır...

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Öğrenin, Salmonella enteritidis'te micC geni silme mutantı oluşturma yöntemini. λ-Red aracılı recombination sistemi kullanarak virülans genleri inaktive edilir ve aşı adayları geliştirilir.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Daha fazla video keşfet