Name: Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Öğrenin fare bağırsak villi epitelinden organoid oluşturma yöntemini. Kazıma tekniği ile mezenkim korunarak kök hücre belirteçleri kazanan değişkenleşen hücrelerin 3D kültür potansiyeli incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayın NIH Ulusal Kanser Enstitüsü'nden K22 CA218462-03 ödül numarası ile desteklendi. R-Spondin1'i ifade eden HEK293-T hücreleri Dr. Michael P. Verzi'nin cömert bir hediyesiydi.

Servikal çıkık ile Tamoksifen ve ötanazi kullanımı da dahil olmak üzere yapılan tüm fare deneyleri, Stevens echnology Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayına sahipti.
1. Fareler
NOT: Smad4f/füretimi; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 fareleri daha öncetanımlanmıştır 3. Sekiz ila on iki haftalık yetişkin dişi fareler kullanıldı.
<ol><li>Smad4 f/f'de Smad4 KO:β-cateninGOF mutasyonu indükle; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2, art arda dört gün boyunca mısır yağına tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu ile.</li>
	<li>İlk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra miceby servikal çıkığı feda edin.</li>
	<li>Fare kürkünün periton boşluğuna girmesini önlemek için karnına% 70 etanol püskürtün.</li>
	<li>Bağırsağı açığa çıkarmak için karın boşluğunu diseksiyon makası ile açın. Makas ve kümes sapları yardımıyla bağırsağı izole edin. NOT: Bağırsak epitelinde β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) fonksiyon mutasyonu kazanımı ile birlikte Smad4'ün eşlik edenkaybına Smad4f/fenjekte ederek ulaşılabilir; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 fareler mısır yağını 0.05 g Tamoxifen / kg vücut ağırlığı ile art arda dört gün boyunca her gün. Bu fareler, ayırıcı villide kök hücre ile ilişkili belirteçleri ifade eden hücrelerin varlığını sağlamak için ilk tamoksifen enjeksiyonundan on gün sonra toplanır.</li>
</ol>2. Duodenum izolasyonu ve hazırlanması
<ol><li>Duodenumun proksimal yarısını parçalara bölün.</li>
	<li>Işıltı içeriğini temizlemek için duodenumu 10 mL şırıngamda 5 mL buz gibi PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Duodenumu açılı bir makasla uzunlamasına açın ve duodenumu operatöre bakan duodenumun lümeni ile buz üzerinde 15 cm Petri plakası üzerine düz bir şekilde koyun.</li>
</ol>3. Kazıyarak Villi izolasyonu
<ol><li>Kazımaya başlamadan önce, 6 kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularından birine 70 μm örgü süzgeç yerleştirin. Tüm kuyuları 4 mL 1x PBS ile doldurun ve 6 kuyu doku kültürü plakasını buza yerleştirin (Şekil 1).</li>
	<li>Villiyi iki mikroskobik cam slayt kullanarak aşağıdaki gibi kazıyın: biri duodenumu aşağı tutmak ve diğeri kazımak için (Şekil 1B1).<ol>
<li>Duodenumun ışıklı tarafını yüzeysel olarak iki kez kazıyın ve mukusu çıkarın. Bu adımın mukus tabakasını kaldıracağı, ancak villiyi kaldırmayacağı şekilde basınç uygulayın.</li>
		<li>Duodenumu tekrar kazıyın, 3..1'dekiyle aynı basıncı uygulayarak iki kez dondurun, bu sırada villi slaytlarda toplanırken görülebilir (Şekil 1B2). Bu, villiyi mahzenler bağlı olmadan elde etmek için en uygun basınçtır (operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Villiyi (slaytta 3.2.2.adımdan toplanan) 6 kuyulu bir tabağa yerleştirilmiş 70 μm'lik bir ağ süzgecine aktarmak için PBS içeren 1 mL aktarım pipeti kullanın. Villi böylece toplanır, her kazımadan sonra (Şekil 1B2).</li>
	<li>70 μm süzgeçte toplanan villiyi (adım 3.3'ten itibaren) süzgeci (villi ile birlikte) soğuk PBS (~ 4 mL / kuyu) içeren 6 kuyulu bir tabakta bir dizi kuyudan geçirerek yıkayın. Bu, varsa gevşek mahzenleri kaldırmaktır.</li>
	<li>Bir p1000 pipet kullanarak, PBS'deki villi süspansiyonu (~ 3 mL) 70 μm süzgeçten buz üzerinde yeni bir 15 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Villi süspansiyonun 50 μL hacmini cam bir kaydırağa aspire etmek için % 0,1 BSA kaplamalı künt uçlu p200 pipet ucu kullanın. PBS süspansiyonundaki villi konsantrasyonunun belirlenmesi için 4x büyütme altındaki 50 μL damlacıktaki villi sayısını sayın. Örneğin, incelenen 50 μL süspansiyonda 10 villi varsa, villi konsantrasyonu 0.2 villi / μL'dir. Bu aynı zamanda bağlı mahzenlerin yokluğunu onaylama zamanıdır.</li>
	<li>0,5 villi/μL BME-R1 matrisi konsantrasyonda plakalamak için gereken villi süspansiyonun hacmini hesaplayın. Pipetleme hatasını ve villinin saflığını sağlamak için gereken mikroskobik inceleme için gereken hacmi hesaba katmak için ekstra bir 100 μL ekleyin. DİkKAT: Villi'nin salınacağı sonraki sıyrıklarda, villiyi değil, mukusu gideren ilk iki sıyrıkta kullanılan basınç kullanılmalıdır. Villi salınımı ilk gözlendikten sonra to-and-fro kazıma sayısını iki ile sınırlandırın. Bu önlem, villi'nin bağlı mahzenlerle salınmasından kaçınır. Bağlı mahzenlerin yokluğunu sağlamak için villiyi mikroskobik olarak değerlendirmek önemlidir.</li>
</ol>4. BME-R1 matrisinde villi kaplaması
<ol><li>%0,1 BSA kaplamalı p200 künt uçlu pipet ucu kullanarak, 12,5 μL BME-R1 matrisinde kuyu başına ~ 6 villi yoğunluğunda plakalamak için gereken villi hacmini (adım 3,6'dan itibaren) bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada BSA kaplı künt uç kullanımı, sivri uç için çok büyük olan villinin, ucun kenarlarına sıkışmadan veya kaybolmadan aspire olmasını sağlar.</li>
	<li>Villiyi 2 dakika boyunca 200 x g'da soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) döndürün ve üst düğmeyi çıkarın.</li>
	<li>Kalan PBS'leri kaldırmak için 4.2 adımını yineleyin ve laminer akış başlığı altında bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Villi peletini buz üzerinde çözülen gerekli miktarda soğuk BME-R1'de hafifçe yeniden depolayın.</li>
	<li>Bir p20 pipet kullanarak, önceden ısınmış 96 kuyulu U-alt plakada 3D olarak BME-R1 matrisinde villinin plakası 12,5 μL / kuyu.</li>
	<li>BME-R1 matrisinin katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatöründe 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış ENR (Epidermal büyüme faktörü/ Noggin / R-spondin1) ortamına 125 μL / kuyu ekleyin: 1x Penisilin ile desteklenmiş gelişmiş DMEM F-12 ortamı: Streptomisin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-asetil sistein ve 0.05 mg/mL Primocin ifade eden HEK293-T hücrelerinden %5 şartlandırılmış ortam.</li>
	<li>Kaplamalı villiyi % 5 CO2ile 37 °C'de tutulan bir doku kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve medyayı her gün değiştirin.</li>
	<li>Villi türevi organoidlerin beklendiği en erken zaman noktası iki gün sonra olduğundan, organoidlerin iki günlük kaplamadan önce göründüğü herhangi bir kuyuyu atın. NOT: Villi uzunluğunun yarısı veya yarısından fazla olan herhangi bir villi bir villus olarak sayılır. Kripto türevi organoidlerin aksine, villi türevi organoidlerin kaplamadan sonraki 24 saat içinde beklenmemesi beklenir. Organoid başlatan villi, organoid oluşumundan önce koyulaşıyor ve küçülüyor gibi görünüyor. Bu nedenle, makul kript kontaminasyonundan elde edilmiş olmanın makul olmasını önlemek için, kaplamadan sonraki bir gün içinde gelişen organoidli kuyular atılmalıdır. Koşullandırılmış ortamı üretmek için kullanılan metodoloji istek üzerine kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu yöntem, kök hücre belirteçlerini in vivo edinen villi epitelin farklılaşma kapasitesini doğrulayabilir. Normal bağırsak epitelleri, mahzende kök hücrelerin varlığı nedeniyle 3D olarak kültürlendiğinde, vizipten organoidlere yol açabilir, ancak villi bölmesine yol açamaz1. Bu nedenle, 3D kültürlerde kültüre edilen farklılaşmış villi epitelden organoid oluşumu, hücre kaderinin tersine dönmesinden kök hücre oluşumunu doğrular. Mutasyonlardan ve/veya yaralanmadan kaynaklanan bağırsak epite...

Bağırsak mahzenleri ama villi değil, Matrigel veya BME-R1 matrisinde kültürlendiğinde organoidler oluşturur. Bu organoidler, bağırsak epitel in vivosunda bulunan çeşitli farklılaşmış soyların, ataların ve kök hücrelerin varlığı nedeniyle genellikle "mini bağırsak" olarak adlandırılan kendi kendini organize eden yapılardır. Kriptolardan organoid oluşturma potansiyeli kök hücrelerin varlığına atfedilir1. Öte yandan bağırsak villi sadece farklılaştırılmış hücrelerden oluşur ve bu nedenle organoid oluşturamaz. Bununla birlikte, mutasyonlar2 veya villus epitelinin tahsis edilmesine izin veren durumlar villi2,3'te kök hücrelere yol açabilir. Villi epitelde saplanma ile sonuçlanan bu kader değişikliği, villus epitelinde de-novo saplanma göstergesi olarak organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için 3D matriste ayırıcı villus epitelinin kaplanmasıyla doğrulanabilir. Bu nedenle, bu prosedürün kritik yönü, mahzen kirlenmesinin olmamasını sağlamaktır.
Smad4KO:β-cateninGOF koşullu mutasyonu, villide çoğalma ve kök hücre belirteçlerinin ekspresyumu ile işaretlenen bağırsak epitelinde farklılaşmaya neden olur, ve sonunda ektopik kriptolar olarak adlandırılan villide şifreli benzeri yapıların oluşumu Bu adanmış villi kök hücrelerin varlığı, ektopik mahzenlerdeki kök hücre belirteçlerinin ekspresyözü (in vivo) ve mutant villinin organoidleri oluşturma yeteneği ile belirlendi. en kaplama Matrigel3. Aşağıda belirtilen prosedür, Smad4 KO:β-cateninGOF mutant farelerinde ayırıcı bağırsakepitelinin sapını doğrulamak için kullanılan metodolojiyi detaylandırır. Villi izole etmek için bu metodolojinin önemli bir özelliği, EDTA şelasyon yönteminin aksine bağırsak lümeninin kazınmasıydı4. EDTA şelasyon yönteminin aksine, kazıyarak villi izolasyonu alttaki mezenkimin çoğunu korur ve kazıma basıncını bağlı mahzenler olmadan villi vermek için ayarlamaya izin verir. Kazıma basıncı operatöre özneldir, bu nedenle, şifreli bağlı olmadan villi vermek için en uygun basınç operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Bu prosedürün kritik yönü, Villi'nin BME-R1 matrisinde hem kaplamadan önce hem de sonra mikroskobik incelemesi ile kripto kontaminasyonunun olmamasını sağlamaktır.
Bağırsak villisi, bme-R1 matrisinde kaplamadan önce, varsa gevşek hücrelerden veya mahzenlerden kurtulmak için bağırsak lümenini cam slaytlarla kazınır ve 70 μm filtreye yerleştirilir ve PBS ile yıkanır. Yöntem, kripto kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki kriterlere vurgular: a) villinin en uzun olduğu duodenumun proksimal yarısının villi hasadını sınırlamak, b) villi-verimli sıyrıkların sayısını en aza indirmek, c) Villi içeren filtrenin altı kuyulu bir tabakta bir dizi PBS aracılığıyla yıkanması ve d) BME-R1 matrisinde kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile kripto kontaminasyonunun olmamasını onaylamak. EDTA şelasyonu yerine kazınarak villi izolasyon, villus epitelinden organoid başlatma içingerekirse 5,6,7,8niş sinyallerini sağlayabilecek alttaki mezenkimenin tamamen kaybını önler.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş DMEM F-12 ortamı</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidin</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu U-alt plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABC kiti</td><td>Vektör</td> <td>Laboratuvarları&nbsp; PK4001</td><td></td></tr><tr><td>Açılı makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>Hayvansız Rekombinant İnsan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50X), eksi A vitamini</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA) Proteaz İçermeyen Toz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 antikoru</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>1030001</tr><tr><td>Cdx2 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>Mısır yağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 mikron hücre süzgeci</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Temel Membran Özü, Tip R1</td><td>R& D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293-T RSPO-1 eksprese eden hücreler</td><td>Dr. Michael Verzi'den</td><td></td><td></td>Hediye</tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Ağ filtresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop cam slayt</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 Künt uçlar</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Kalite Biyolojik Inc PBS (10X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Sinyal seyreltici</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

organoidlerin bağırsak villi epitelinden 3d kültasyonu adanmışlık geçiriyor

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Organoidlerin bağırsak epitelinden klonojenikliği, buradaki kök hücrelerin varlığına atfedilir. Fare küçük bağırsak epitelleri mahzenlere ve villilere bölünür: kök ve çoğalan hücreler mahzenlerle sınırlıdır, villi epitel ise sadece farklılaştırılmış hücreler içerir. Bu nedenle, normal bağırsak mahzenleri, ancak villi değil, 3D kültürlerde organoidlere yol açabilir. Burada açıklanan prosedür sadece saplılığa yol açan ayırıcılık geçiren villus epitel için geçerlidir. Açıklanan yöntem, Smad4-fonksiyon kaybı:β-catenin fonksiyon kazancı (Smad4KO:β-cateninGOF)koşullu mutant faresini kullanır. Mutasyon, bağırsak villisinin villide kök hücreleri adamasına ve üretmesine neden olur. Adanmışlık geçiren bağırsak villisi, cam slaytlar kullanılarak bağırsaktan kazınır, 70 μm'lik bir süzgeçe yerleştirilir ve organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için BME-R1 matrisinde kaplamadan önce gevşek hücreleri veya mahzenleri filtrelemek için birkaç kez yıkanır. Elde edilen organoidlerin şifrelerden değil, ayırıcı villus bölmesinden geliştirilmesini sağlamak için iki ana kriter kullanılmıştır: 1) 3D matriste kaplamadan önce ve sonra bağlı herhangi bir mahzenin olmamasını sağlamak için izole edilmiş villinin mikroskobik olarak değerlendirilmesi ve 2) villiden organoid gelişiminin seyrini izlemek. Villiden organoid inisiyonu kaplamadan sadece iki ila beş gün sonra gerçekleşir ve düzensiz şekilli görünürken, aynı bağırsak epitelinden elde edilen kripto kökenli organoidler kaplamadan sonraki on altı saat içinde belirgindir ve küresel görünür. Bununla birlikte, yöntemin sınırlaması, oluşan organoid sayısının ve villiden organoid başlatma için gereken sürenin, ayırma dereceine bağlı olarak değişmesidir. Bu nedenle, mutasyonun özgüllüğüne veya adanmışlığa neden olan hakarete bağlı olarak, villi'nin organoid şekillendirme potansiyellerini test etmek için hasat edilebileceği en uygun aşama ampirik olarak belirlenmelidir.

İşlemin başarısı için belirleyici faktör, mahzen kirlenmesini önlemektir. Villiden organoid gelişimi (ve herhangi bir kontamine edici mahzenden değil) dört ana kriterin doğrulanmasıyla sağlanır: 1) Villi'yi BME-R1'de kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile hasat edilen villinin saflığını sağlamak, 2) tüm kaplama villilerin tek tek görselleştirilmesine izin vermek için kuyu başına sınırlı sayıda villi kaplamak, 3) organoidin günlük gelişimini sürdürmek; zaman seyrinin görüntüleri villiden organoid gelişimini gös...

Prosedür, villinin organoid şekillendirme potansiyellerini belirlemek için adanmışlık geçiren fare bağırsak epitelinden izolasyonunu açıklar.

Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Bu yöntem, kök hücre belirteçlerini in vivo edinen villi epitelin ayrıştırıcı organoid oluşturma kapasitesini doğrulayabilir. Villi koleksiyonu, organoid başlatma için gerektiğinde niş sinyalleri sağlayabilecek alttaki mezenkimlerin tamamen kaybını önleyen EDTA şelasyon yöntemi yerine kazıma yoluyla gerçekleştirilir. Bu yöntem, proliferatif ve farklılaştırılmış bölmelerin fiziksel olarak tanımlandığı ve farklılaşan hücrelerin kök hücre işaretleyicilerini in vivo olarak ifade ettiği epitel dokularda uygulanabilir.Bu protokoldeki bazı faktörlerin ampirik olarak belirlenmesi gerekir, villinin toplanması için en uygun aşama ve villi kazınması için en uygun basınç da dahil olmak üzere, bu zaman ve uygulama alacaktır. Ardışık dört gün boyunca tamoksifen ve mısır yağının intraperitoneal enjeksiyonu ile mutant farelerde Smad4 nakavt ve beta-catenin fonksiyon mutasyonu kazancını teşvik edin. Fareyi ötenazi ettikten sonra, fare kürkünün periton boşluğuna girmesini önlemek için karnına% 70 etanol püskürtün.Bağırsağı açığa çıkarmak için karın boşluğunu diseksiyon makası ile açın ve makas ve tostips kullanarak bağırsağı izole edin. Duodenumun proksimal yarısını parçalara ayırın, ardından ışık içeriğini temizlemek için duodenumu 10 mililitrelik bir şırıngamda beş mililitre buz soğuk PBS ile yıkayın. Duodenumu açılı bir makasla uzunlamasına açın ve duodenumu operatöre bakan duodenumun lümeni ile buz üzerinde 15 santimetrelik bir Petri kabına düz bir şekilde yerleştirin.Kazımaya başlamadan önce, altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularından birine 70 mikrometre ağ süzgeci yerleştirin. Tüm kuyuları dört mililitre 1X PBS ile doldurun ve plakayı buza yerleştirin. Villiyi iki mikroskobik cam slayt kullanarak kazıyın, biri duodenumu aşağı tutmak ve diğeri kazımak için.Duodenumun parlak tarafını villiyi çıkarmadan mukusu çıkarmak için yüzeysel olarak iki kez kazıyın, ardından vilinleri mahzenleri bağlamadan slaytlarda toplamak için duodenumu iki kez daha kazıyın. Villiyi altı kuyulu tabaktaki 70 mikrometre ağ süzgecine aktarmak için PBS içeren bir mililitre transfer pipeti kullanın. Her sıyrıktan sonra villi toplayın.Gevşek mahzenleri çıkarmak için, 70 mikrometre süzgeçle toplanan villiyi, süzgeci kuyu başına dört mililitre buz soğuk PBS içeren altı kuyudaki bir dizi kuyudan aktararak yıkayın. Bir P1000 pipet kullanarak, villi süspansiyonu yaklaşık üç mililitre PBS'de 70 mikrometre süzgeçten buz üzerinde yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Villi süspansiyonun 50 mikroliter hacmini cam bir slayda aktarmak için %0,1 BSA kaplı künt uçlu P200 pipet ucu kullanın.PBS süspansiyonunda villi konsantrasyonunun belirlenmesi ve bağlı mahzenlerin yokluğunu doğrulamak için 4X büyütme altındaki 50 mikroliter damlacıktaki villi sayısını sayın. Villiyi kaplamak için, Villi'yi 12,5 mikrolitre BME-R1 matrisinde kuyu başına altı villi kaplama yoğunluğu için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için% 0,1 BSA kaplı P200 künt uçlu pipet ucu kullanın. Villi'den 200 kat G'de 4 santigrat derecede iki dakika döndürün.Üstnatantı çıkarın ve artık PBS'yi çıkarmak için santrifüjü tekrarlayın. Laminer akış davlumbazında, villi peletini buz üzerinde çözülen gerekli miktarda soğuk BME-R1'de hafifçe yeniden depolayın. Bir P20 pipet kullanarak, 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 96 kuyulu U tabanlı bir plakanın kuyusu başına BME-R1 matrisinde villinin 12,5 mikrolitresi.BME-R1 matrisinin katılaşmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe 15 dakika kuluçkaya yatırın. Her kuyuya, metin el yazmasında açıklandığı gibi eklenmiş 125 mikrolitre önceden ısıtılmış ENR ortamı ekleyin. Kaplamalı villiyi % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve medyayı her gün değiştirin.Organoidlerin iki günden önce göründüğü herhangi bir kuyuyı atın. Mahzenlerden çıkan organoidlerin görünüşünde, aynı fare bağırsaktan farklılaşmış villi epitel ile karşıtlık arasında fark vardır. Crypt türevi organoidler bir gecede iyi tanımlanmış kenarlıklara sahip küresel yapılar olarak görünür.Villi'den başlatılan organoidlerin kinetik ve morfolojik görünümü incelendi, bu da ilk başta düzensiz şekilli göründü ve mikroskop altında görülebilmesi için iki ila beş gün sürdü. İki farklı villiden organoid inisiyonu gösterilir. Organoid oluşturma potansiyeline sahip villi, muhtemelen alttaki mezenkimlerin tutulması nedeniyle yoğun görünür.Villalardan organoid inisiyonu, villilerden birinden ikinci günde belirgindir. Diğer villalardayken, organoid dördüncü günde ortaya çıkar. Villi'yi toplarken ve elde eden organoidleri yetiştirirken mahzen kirlenmesini önlemek için uygun adımları atmak çok önemlidir.Bu prosedürün ardından aynı mutantın mahzenlerinden ve villilerinden çıkan organoidler arasındaki fenotipik farklılıklar gözlendi, bu nedenle ikisi arasındaki moleküler farklılıkları aramak için daha fazla deney yapılabilirdi. Bu protokol, endojen mahzenlerden kaynaklanan organoidler ile de-differentiasyondan kaynaklanan ektopik mahzenler arasındaki farkları incelemek için kullanılabilir, böylece de-differentiation etkileri ele alınabilebilir.

3d-culturing-organoids-from-intestinal-villi-epithelium-undergoing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Protokol, daha önce keşfedilmemiş bağırsak biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlamak için insan bağırsak organoid teknolojisini tek hücreli transkriptomik analizle birleştirir.

Tek Hücreli Transkripsiyonel Seviyede İnce Bağırsak Epitelini Anlamak için İnsan Bağırsak Organoidlerini Kullanma

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Öğrenin fare bağırsak villi epitelinden organoid oluşturma yöntemini. Kazıma tekniği ile mezenkim korunarak kök hücre belirteçleri kazanan değişkenleşen hücrelerin 3D kültür potansiyeli incelenir.

Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

Daha fazla video keşfet