Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü
25 Ekim 2021
Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.
Fare primer hepatositleri karaciğer çalışmalarında önemlidir. Özellikle glikoz metabolizması ve hepatik ilaç testi için. Zaman açısından izolasyon işlemi zaman alıcı ve enerji maliyetli olabilir.
Bu protokol, fare primer hepatositlerini izole etmek için etkili bir yol sağlayabilir. Zaman ve emek dostudur. Ticari olarak temin edilebilen tüm bölgelerle çok az adım gerektirir.
Isıtılmış çift damıtılmış suyu dakikada 4 mL hızda, beş dakika boyunca pompalamaya başlamak için peristaltik pompayı kullanarak başlayın. Ardından pompalama tüpünü sudan ısıtılmış perfüzyon ortamına değiştirin. Su ve perfüzyon ortamı arasındaki hava kabarcığının izlenmesi.
Perfüzyon ortamının sistemdeki akışını izlemeye yardımcı olacaktır. Daha sonra anestezi uygulanan sekiz haftalık C57 siyah 6J dişi farenin karnını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir makas kullanarak, karaciğeri, portal veni ve inferior vena kavayı açığa çıkarmak için karnı kesin.
Ardından peristaltik pompayı durdurun. Pompalama borusunun su değil perfüzyon ortamı içerdiğinden emin olduktan sonra. İnferior vena kavaya 24 gauge kateter yerleştirin.
Pompayı tekrar açın ve portal damarı kesin. Perfüzyon ortamı pompalanırken, sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Yaklaşık üç ila beş dakika boyunca veya yıkanan sıvı temizlenene kadar pompalamaya devam edin.
Daha sonra pompalama tüpünü perfüzyon ortamından kollajenaz dispase ortamına değiştirin. Ve sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Kollajenaz dispase ortamının 25 mL'sinin tamamı tükenene kadar pompalamaya devam edin.
Daha sonra safra kesesi olmadan tüm karaciğeri izole edin. Ve buz üzerinde bir Petri kabında 30 mL yıkama ortamına yerleştirin. Forseps kullanmak, primer hepatositleri çözeltiye salmak için karaciğeri parçalara ayırır.
Bu aşamada, yıkama ortamı, serbest bırakılan birincil hepatositleri ve küçük karaciğer parçalarını içeren bulutlu bir çözeltiye dönüşür. Bu bulutlu çözeltiyi 70 mikronluk bir hücre süzgeciyle, buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpte HBSS çağrısı başına 20 mL 1X'e filtreleyin. Ve tüpü 20 kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.
Daha sonra çözümü santrifüj edin. Daha sonra doku kültürü başlığında, süpernatanı aspire edin. Peleti 30 mL soğuk yıkama ortamı ile yıkayın.
Santrifüjleme ile hücreleri bir kez daha pelet edin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 25 mL kültür ortamında tekrar askıya alın. Hücreleri sayın ve istediğiniz kültür plakalarına yerleştirin.
Deneysel tasarıma göre. Kaplamadan sonra, izole edilmiş primer hepatositler bir saat sıkıca tutturuldu ve 12 saat sonra tamamen genişletildi. İzole hepatositlerde, transtiretin, CD95, ASGR1 ve ASGR2 gibi hepatosit belirteçlerinin mRNA düzeyleri tüm karaciğere kıyasla anlamlı derecede artmıştır.
Buna karşılık, bağışıklık hücrelerinin, yıldız hücrelerinin ve endotel hücrelerinin varlığı daha düşüktü. CD45, kollajen tip 1 alfa 1 ve endotel hücresi 2 kinaz 2 mRNA seviyelerinde keskin bir azalma ile kanıtlandığı gibi. Bu protokolün diğer hepatik hücrelerden gelen paraziti büyük ölçüde azaltabileceğini düşündürmektedir.
Kaplamadan sonra ASGR1 ve ASGR2 seviyeleri zamanla azaldı, ancak 12 saatlik zaman noktasına kadar tüm karaciğerle karşılaştırılabilir kaldı. Özellikle ASGR1 için. Membrana bağlı CD81'in ekspresyon seviyesi 48 saate kadar tutarlıydı.
Buna karşılık, toll-like reseptör 4 ekspresyonu genellikle artmış ve 48 saat sonra in vivo seviyelerden daha yüksek hale gelmiştir. İnsülin duyarlılık testleri, insülinin serin 473'te her iki AKT'nin fosforilasyonunu önemli ölçüde desteklediğini göstermiştir. Ve hepatositlerde serin 256'da çatal kafalı kutu 01.
Primer hepatositlerin insüline duyarlılığını gösterir. Fosfoenolpiruvat karboksikinaz protein seviyeleri glukagon tedavisinden sonra anlamlı derecede artmıştır. Glikoz üretim yolunun aktive edildiğini düşündürmektedir.
Bu aktivasyon, artan glikoz üretimi ile daha da doğrulandı. Ve Forskolin + IBMX gibi diğer glikoz üretim uyarıcıları ile. Bu protokol, fare primer hepatositlerini kullanan çalışmalar için hem zamandan hem de enerjiden tasarruf sağlayabilir.
Bu protokolü takiben, varsayımsal glikoz metabolizması ve farmasötik biyobelirteç testleri gibi ilgili deneyler yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, karaciğer fonksiyonu ve metabolizması araştırmaları için kritik öneme sahip olan fare primer hepatositlerinin izolasyonu için iş gücü ve zaman açısından verimli bir protokol sunmaktadır. Yöntem, verimi artırmak ve non-parenkimal hücrelerden kaynaklanan etkileşimleri minimize etmek için ticari olarak mevcut reaktifleri kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hepatik metabolizma
- Glikoz metabolizması
- İlaç testi
Arka Plan
- Fare primer hepatositleri, karaciğer biyolojisini incelemek için gereklidir.
- Geleneksel izolasyon yöntemleri genellikle zaman alıcı ve emek yoğundur.
- İzolasyon süresinin kısaltılması, biyolojik deneylerin daha verimli gerçekleştirilmesini sağlayabilir.
Kullanılan Yöntemler
- Peristaltik pompa ve kollagenaz dispaz medyumu kullanılarak gerçekleştirilen izolasyon protokolü.
- Fare modeli: C57BL/6J dişi fareler.
- Hücre kültürü ve gen ekspresyonu ölçüm teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Tüm karaciğere kıyasla hepatosit markerlarının artmış mRNA seviyeleri.
- İzolasyon sonrası immün ve endotelyal hücre varlığında azalma.
- Kanıtlanmış insülin duyarlılığı ve aktive edilmiş glikoz üretim yolakları.
Sonuçlar
- Bu protokol, primer hepatositlerin izole edilme verimliliğini önemli ölçüde artırır.
- Karaciğer çalışmalarında glikoz metabolizması ve ilaç yanıtının daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Primer hepatositlerin verimli izolasyonu, zaman ve emek kısıtlamalarının keşif iş akışlarındaki kapasiteyi etkilediği karaciğer metabolizması ve ilaç testi çalışmaları için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, hepatosit verimini ve saflığını korurken izolasyon süresini ~35 dakikaya indirerek preklinik modellerde hızlı hipotez testlerini destekler. Yöntem, hedef doğrulama ve öncü bileşik tanımlama hatlarında mekanistik risk azaltma için hastalıkla ilgili sistemlerin ölçeklenebilir hazırlanmasına olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Glukoz metabolizması ve hepatik ilaç yanıt yolaklarında terapötik hipotezlerin sorgulanması için saflaştırılmış hepatositler sağlar.
- Operasyonel Değer: Zaman ve emek yükünü azaltarak hedef doğrulama analizlerinde daha yüksek işlem hacmine imkan tanır.
- Öngörücü Değer: İnsülin duyarlılığı ve glukoneogenez aktivasyonu kanıtlanmış hepatositler üreterek, karaciğer hedeflerinin mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik tarama için analiz özgüllüğünü artıran, düşük non-parenkimal hücre girişimi içeren hepatositler sağlar.
- Operasyonel Değer: Ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve standartlaştırılmış adımlar kullanarak, tarama kampanyaları genelinde tekrarlanabilirliği artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Yüksek içerikli veya fenotipik tarama platformlarına uygun, valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Karaciğer hedefli bileşiklerin preklinik doğrulaması için hastalıkla ilgili sistemleri destekler.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Glukoz üretimi ve insülin yanıtı doğrulanmış hepatositler üreterek devam/durdur kararlarına veri sağlar.
- Biyobelirteç Uyumu: Hepatosit belirteç ekspresyonunu (ASGR1, ASGR2, CD81) 12 saate kadar koruyarak biyobelirteç analiz uyumluluğu sağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik çalışmalara kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, karaciğer metabolizma analizleri için güvenilir bir primer hepatosit kaynağı sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Onaylanmış marker ekspresyonuna ve fonksiyonel yanıtlara sahip hepatositler sağlayarak hepatik yolakların hipotez testlerini mümkün kılar.
- Tarama: Azaltılmış stromal hücre kontaminasyonu ve tutarlı insülin duyarlılığı sayesinde bileşik değerlendirmesi için uygun hepatositler üretir.
- Analitikler: Glukoz üretimi, fosforilasyon assayleri ve hepatosit markerlarının mRNA ekspresyonu gibi kantitatif okumaları destekler.
- Translasyonel Araştırma: Temel metabolik fonksiyonlarını 48 saate kadar koruyan hepatositler sağlayarak keşif aşamasını preklinik çalışmalarla bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler ve ekipler arasında hepatosit hazırlığını standardize eden, yeniden kullanılabilir bir izolasyon kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücresel girişimin azaltılması ve fonksiyonel doğrulama aracılığıyla karaciğer metabolizması çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Minimum adım ve ticari olarak temin edilebilen reaktiflerle iş akışını kolaylaştırarak laboratuvar verimliliğini artırır.
- Stratejik Değer: İzolasyon süresini saatlerden ~35 dakikaya indirerek keşif takvimlerini hızlandırır ve analiz sıklığını artırır.
- Portföy Etkisi: Mekanizma doğrulaması için güvenilir preklinik modeller sağlayarak, karaciğer hedeflerinin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare cerrahisi ve perfüzyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Peristaltik bir pompaya ve steril doku kültürü ortamına erişime bağlıdır.
- Standartlaştırılmış reaktif hazırlığı (perfüzyon ortamı, kollajenaz dispaz, yıkama ve kültür ortamları) gereklidir.
- Kullanılan C57BL/6J dişi modelinin dışındaki farklı fare suşları veya yaşları için adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Marker ekspresyonu 12 saat sonra azaldığından, fonksiyonel bütünlüğü korumak için izole hepatositlerin hemen kullanılması gerekliliği ile sınırlıdır.
