Name: Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerin plazma membranında moleküler difüzyonu svFCS mikroskobu ile nasıl ölçülür. Bu yöntem, kolesterolün lipid raft organizasyonu üzerindeki etkisini incelemek için yüksek çözünürlük sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SB, SM ve DM, CNRS, Inserm ve Aix-Marseille Üniversitesi'nden kurumsal fonlar ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı'ndan (ANR-17-CE15-0032-01 ve ANR-18-CE15-0021-02) ve Fransız "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM) program hibeleriyle desteklenmiştir. KW, Biyoteknoloji ve Nanoteknoloji alanında BİLİNEN disiplinlerarası çevre doktora çalışmaları programı olan "BioTechNan" ı kabul etmektedir. EB, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nin (NCN) 2016/21/D/NZ1/00285 proje no'lu proje kapsamında Fransız Hükümeti ve Polonya'daki Fransa Büyükelçiliği'nin mali desteğini kabul eder. MŁ, Polonya Kalkınma Bakanlığı'nın (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) ve Ulusal Araştırma ve Geliştirme Merkezi'nin (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17) mali desteğini kabul eder. TT, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/21/B/NZ3/00343 proje no'lu proje kapsamında ve Wroclaw Biyoteknoloji Merkezi'nden (KNOW) mali destek aldığını kabul etmektedir.

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ABC+kinases+by+phosphorylation%3A+protein+kinase+C+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm.</a> The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: From model membranes to cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+as+a+membrane-organizing+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts as a membrane-organizing principle.</a> Science. , (2010).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+cell+membrane%3A+Do+proteins+rule+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).</li>
<li>Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluid+-+Mosaic+Model+of+Membrane+Structure%3A+Still+relevant+to+understanding+the+structure%2C+function+and+dynamics+of+biological+membranes+after+more+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).</li>
<li>Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+undergo+hop+diffusion+in+compartmentalized+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Destainville, N., Salomé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. , (1976).</li>
<li>Petrášek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2008).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((40+Years+of+FCS%3A+How+it+all+began%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">40 Years of FCS: How it all began.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Elson, E. L., Magde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+I.+Conceptual+basis+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+II.+An+experimental+realization%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+in+living+cells+observed+by+fluorescence+correlation+spectroscopy+with+one-+and+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation.</a> Biophysical Journal. , (1999).</li>
<li>Bouchaud, J. P., Georges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffusion+in+disordered+media%3A+Statistical+mechanisms%2C+models+and+physical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Reports%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications.</a> Physics Reports. , (1990).</li>
<li>Yechiel, E., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+domains+in+fibroblast+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes.</a> Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).</li>
<li>Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+domains+by+FRAP+experiments+at+variable+observation+areas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas.</a> European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).</li>
<li>Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+K-Ras+and+H-Ras+display+different+interactions+with+saturable+nonraft+sites+at+the+surface+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+corralation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence corralation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ruprecht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contractility+triggers+a+stochastic+switch+to+fast+amoeboid+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Billaudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+plasma+membrane+organization+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).</li>
<li>Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+for+characterizing+plasma+membrane+subdomains+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).</li>
<li>Rege, T. A., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%2C+a+versatile+modulator+of+signaling+affecting+cellular+adhesion%2C+proliferation%2C+survival%2C+and+cytokine%2Fgrowth+factor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).</li>
<li>Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCahuzac%2C+N+%22Blood%22">Blood</a>. , (2006).</li>
<li>Guia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+of+activating+receptors+at+the+plasma+membrane+controls+natural+killer+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance.</a> Science Signaling. 4 (167), 21(2011).</li>
<li>Blouin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation-dependent+IFN-%CE%B3R+partitioning+in+lipid+and+actin+nanodomains+is+critical+for+JAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation.</a> Cell. 166 (4), 920-934 (2016).</li>
<li>Chouaki-Benmansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+regulate+the+TCR%2FCD3+complex+membrane+dynamics+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation.</a> Scientific Reports. , (2018).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+to+determine+diffusion+laws%3A+application+to+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Micro-+and+Nano-Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes.</a> Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).</li>
<li>Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescence+correlation+spectroscopy+enabling+direct+observation+of+spatiotemporal+dependence+of+diffusion+constants+as+an+evidence+of+anomalous+transport+in+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Humpolíčková, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2006).</li>
<li>Benda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+diffusion+coefficients+in+planar+phospholipid+systems+by+confocal+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy.</a> Langmuir. , (2003).</li>
<li>Ganguly, S., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+mimics+the+effect+of+cytoskeletal+destabilization+on+membrane+dynamics+of+the+serotonin1A+receptor%3A+A+zFCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li>
<li>Wenger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+analysis+within+single+nanometric+apertures+reveals+the+ultrafine+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).</li>
<li>Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+intact+living+cell+membranes+with+NSOM+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes.</a> Biophysical Journal. , (2011).</li>
<li>Regmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+optical+nanoantennas+resolve+cholesterol-dependent+nanoscale+heterogeneities+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells.</a> Nano Letters. , (2017).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+in+STED+microscopy%3A+Studying+the+nanoscale+of+lipid+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nanoscale+diffusion+dynamics+in+cellular+membranes+with+super-resolution+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+STED-background+corrected+fitting+model+for+unbiased+STED-FCS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Veerapathiran, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+imaging+FCS+diffusion+law+in+the+presence+of+multiple+diffusive+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+hop+or+not+to+hop%3A+exceptions+in+the+FCS+diffusion+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law.</a> Biophysical Journal. , (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, svFCS modülünün standart bir floresan mikroskop üzerinde uygulanmasını, FCS difüzyon yasası analizi sayesinde canlı hücrelerdeki plazma membran organizasyonunun dinamiklerini deşifre etmek için güçlü bir deneysel yaklaşımı açıkladık. Kavramsal olarak, svFCS basit bir ilkeye dayanmaktadır: aydınlatma alanının boyutunu değiştirirken zaman alanındaki floresanın korelasyon ölçümleri23. Bu strateji, mikroskobik ölçümlerden nanoskopik bilgi çıkarmada etkili olmuştur, bu da plazma zarı organizasyonuna kararlı halde 25 ve fizyolojik süreçlerde 30,31,32,33'te katkıda bulunan ana fizikokimyasal elementlerin deşifre edilmesine yardımcı olmaktadır. Toplamda, bu svFCS analizleri, çeşitli hücre tiplerinde lipite bağımlı nanodomainlerin varlığını ve farklı sinyal olaylarının ayarlanmasında doğrudan etkilerini açıkça göstermektedir.
Bu çerçevede, foton bütçesini optimize etmek ve optik sapmaları en aza indirmek için svFCS kurulumunu oluştururken göz önünde bulundurulması gereken bazı optik hususlar vardır. Bu nedenle, svFCS ölçümü yapıldığında tüp lensin çıkarılabileceği bir mikroskop kullanmanızı öneririz. Dahası, tek bir iris, svFCS kurulumunda önemli bir rol oynar: hedefin arka açıklığındaki ışın boyutunu değiştirir, böylece etkili bel boyutunu (yani etkili uyarma hacmini) doğrudan değiştirir. Kiriş çapı, en küçük bel boyutu34'ü elde etmek için objektif arka göz bebeğine uymalıdır. Bel ölçüsünün ayarlanmasına yardımcı olan bu seçenek, foton bütçesinin optimizasyonunu sağlar ve uygulanması kolaydır. Son olarak, ışık yolu boyunca minimum sayıda optik parça kullanılır; sistem ne kadar az karmaşık olursa, kaybolan fotonlar o kadar az olur. Tüm bu seçenekler svFCS deneylerinin sağlamlığını önemli ölçüde artırır.
Protokolün kendisi ile ilgili olarak, birkaç kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. En önemlisi, başarılı svFCS ölçümleri için çok önemli olan optik yolların uygun bir şekilde hizalanmasıdır (protokol, bölüm 2). 300 μW lazer aydınlatma altında ~ 200 kHz olması gereken 2 nM Rh6G çözeltisinden gelen floresan sinyalini analiz ederek bunu kontrol etmek kolaydır. Tüm süsenler açılmalı ve ACF'ler önemli bir genliğe sahip olmalıdır (tipik olarak G0 ~ 1.5-2.0). Bir diğer kritik nokta ise hücreler ve bunların svFCS analizine hazırlanması ile ilgilidir (protokol, bölüm 4-8). Yoğunlukları, gözlemlenecek izole hücrelerin analiz için mevcut olması için uyarlanmalıdır. Yapışkan olmayan hücreler, poli-L-lizin çözeltisi kullanılarak odacıklı bir kapak camı üzerinde hareketsiz hale getirilmelidir. Hücre etiketlemesinden gelen floresan sinyali çok güçlü olmamalıdır, aksi takdirde sığması zor olan çok düz ACF'lere neden olur ve uyum parametreleri önemli bir hatayla yüklenir. Ek olarak, hücrelerdeki homojen olmayan etiketleme ve floresan agregaları, svFCS ölçümlerinin yorumlanmasını son derece zorlaştırır. Son olarak, kolesterol oksidaz tedavisi hücre canlılığını etkiler ve svFCS analizi tedaviden bir saat sonra geçmemelidir. Desteğe bağlı olmadığı için üst plazma zarından floresan dalgalanmalarını kaydetmek de daha iyidir ve destekle fiziksel etkileşimler nedeniyle moleküllerin difüzyonunun engellenmesi riski yoktur.
svFCS tekniğinde, algılama hacmini ayarlamak için kullanılan yöntemlerin çeşitliliği nedeniyle farklı yaklaşımlarda kullanımı için yeterli ilerleme kaydedilmiştir ve bu da canlı hücrelerdeki çeşitli biyolojik süreçleri incelemeyi mümkün kılmaktadır. Uyarma hacminin boyutunu ayarlamaya bir alternatif, değişken bir ışın genişletici35 kullanmaktır. Plazma zarının z yönü36 boyunca kesişmesinden gelen floresan sinyalini kaydederek aydınlatma alanının boyutunu modüle etmek de mümkündür. Bu, difüzyon yasası37,38'i türetmek için teorik bir çerçevenin geliştirildiği standart bir konfokal mikroskopta yapılabilir.
svFCS yöntemi, plazma zarının homojen olmayan yanal organizasyonunun karakterizasyonu için gerekli olan mekansal-zamansal çözünürlük sunsa da, geometrik hapsetme modları birbirini dışlamaz. Bir yönde veya diğerinde t0'lık bir sapma, yalnızca baskın bir hapsetme modunu ortaya çıkarır25. Ayrıca, mevcut svFCS yönteminin bir diğer önemli sınırlaması, klasik optik kırınım sınırından (~ 200 nm) kaynaklanmaktadır. Bu, hücre plazma zarı içindeki molekülleri sınırlayan alanlardan tartışmasız daha büyüktür. Bu nedenle, hapsedilmenin analizi, difüzyon yasasından çıkarılan t0 değerinden çıkarılır.
Bu dezavantaj, alternatif yöntemler uygulanarak aşılmıştır. Başlangıçta, nanodiyaframlarla delinmiş metalik filmlerin kullanılması, çok küçük bir membran alanını aydınlatma imkanı sundu (yani, 75 ila 250 nm arasında değişen yarıçaplı tek nanometrik açıklıkların optik kırınım sınırının altında)39. İzole etki alanı organizasyonu için teorik difüzyon yasasından öngörülen geçiş rejimi böylece rapor edildi ve nanometrik membran heterojenitelerinin karakteristik boyutunun iyileştirilmesine ve lipit bağımlı nanodomainler tarafından işgal edilen yüzey alanının nicel bir tahminine izin verdi39. Alternatif olarak, nanometrik aydınlatma, yakın alan taramalı optik mikroskopi40 veya düzlemsel optik nanoantenler41 kullanılarak da geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve FCS'yi birleştirmek, difüzyon yasasını çok yüksek uzamsal çözünürlükle belgelemek için güçlü ve hassas bir araç sağlamıştır. Bu STED-FCS, kısa bir süre içinde meydana gelen nano ölçekte moleküler difüzyon özelliklerine erişim sağlar ve plazma zarı42,43'teki lipit problarının dinamik organizasyonunun incelenmesine izin verir. Bununla birlikte, STED prosesinde floresanın eksik baskılanması, FCS'deki oto-korelasyon eğrilerinin analizini zorlaştırmaktadır.
Bu zorluğun üstesinden gelmek, difüzyon sürelerinin ve ortalama molekül sayısı ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için yeni bir montaj modeli geliştirilmiştir44. Son olarak, plazma zarında yavaş moleküler difüzyon için, svFCS prensibi görüntü korelasyon spektroskopisi45 ile kaydedilen verilere uygulanabilir. Son zamanlarda, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) görüntüleme toplam iç yansıması-FCS (ITIR-FCS) ile birleştirilmesinin, plazma zarında moleküler difüzyonu engelleyen mekanizmanın doğasının iyileştirilmesine katkıda bulunduğu, özellikle de nanodomainlerin yüksek yoğunluğu nedeniyle perkolasyon eşiği membran konfigürasyonunun yakınında46 olduğu gösterilmiştir.
Sonuç olarak, svFCS tarafından difüzyon yasasının oluşturulması, dinamik kolektif lipitler ve membran proteinlerinin ilişkilerinin yarattığı yerel heterojenliği çıkarmak için deneysel kanıtlar sağlamıştır. Wohland ve iş arkadaşları46 tarafından belirtildiği gibi, "FCS difüzyon yasası analizi, dinamik bilgilerden çözünürlük sınırının altındaki yapısal ve organizasyonel özellikleri çıkarmak için değerli bir araç olmaya devam etmektedir". Yine de, plazma zarında meydana gelen moleküler olayların dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak difüzyon yasasının yorumlanmasını iyileştirmek için yeni modeller geliştirmemiz gerekiyor.

Plazma membran organizasyonunun karmaşıklığı Hücre zarı organizasyonunun mevcut anlayışı birkaç yönü dikkate almalıdır1. İlk olarak, karmaşık bir lipit bileşimi sadece hücre tipleri arasında değil, aynı zamanda tek bir hücre içinde (membran organelleri / plazma zarı) da değişir. Ayrıca, ilişkili veya içsel membran proteinleri çoğunlukla dinamik multimerik komplekslerde organize edilir, büyük alanlar membranın dışına uzanır ve tek başına transmembran alanlarından önemli ölçüde daha büyük bir alanı oluşturur. Ayrıca, membranla ilişkili proteinler, protein fonksiyonunun düzenlenmesinde rol oynayan spesifik lipit bağlayıcı veya lipit etkileşimi kapasiteleri sergiler. Bunlar doğrudan lipitlerin yerel bileşimine ve erişilebilirliğine bağlıdır2.
Son olarak, membran proteinlerinin içsel asimetrik yapısı ve lipitlerin dağılımı nedeniyle iki membran broşürü arasında önemli düzeyde asimetri gözlenmektedir. Gerçekten de, sentez ve hidroliz arasındaki lipit metabolik dengesi, broşürler arasındaki lipit flip-flop ile birleştiğinde, böyle asimetrik bir dağılım oluşturur. Çift katmanlı herhangi bir taşıma, kutupsal kafa grubunu membranların hidrofobik iç kısmından hareket ettirmek için gereken serbest enerji tarafından kısıtlandığından, genellikle seçici taşıyıcılar tarafından desteklenir. Her hücre tipi için, asimetri sıkıca korunma eğilimindedir. Toplamda, bu faktörler plazma membranının lateral homojensizliğine veya bölümlenmesine katkıda bulunur 3,4.
Plazma zarının bu temsilini, çift katmanın içinde ve boyunca içsel moleküler difüzyonu dikkate alarak zenginleştiriyoruz, bu da dinamik yanal heterojenliğe onda biri ila yüzlerce nanometre ve mikrosaniyeler ila saniyeler arasında bir ölçekte katkıda bulunuyor. Örneğin, lipite bağımlı membran nanodomainleri - kolesterol olarak tanımlanan lipit salları ve sfingolipid bakımından zengin sinyal platformları - plazma zarının bölümlenmesine katkıda bulunur 5,6. Bununla birlikte, membran organizasyonunun mevcut görünümü sadece lipit salları ile sınırlı değildir. Membran nanodomainleri bileşim, köken ve fonksiyon bakımından daha karmaşık ve heterojendir. Yine de, plazma zarındaki varlıkları sıkı bir şekilde koordine edilmelidir ve proteinler ve lipitler arasındaki dinamik etkileşimler, membran nanoalanlarınınmekansal dağılımında ve kimyasal modifikasyonunda önemli görünmektedir 1,3,7,8.
svFCS prensibi ve plazma membranının organizasyonunu araştırmak için uygulanması Membran alanlarının analizinde, esas olarak biyofiziksel tekniklerle çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, plazma zarının yerel organizasyonunu belirleyen determinantların uygun mekansal ve zamansal çözünürlükle rafine edilmesi gerekir. Tek tek molekülleri izlemeye dayanan determinantlar, mükemmel uzamsal hassasiyet sağlar ve farklı hareket modlarınınkarakterizasyonuna izin verir 9,10,11,12, ancak klasik düşük kamera kare hızlarıyla sınırlı bir zamansal çözünürlüğe sahiptir ve önemli sayıda yörüngeyi kaydetmek için daha fazla deneysel çaba gerektirir. Alternatif olarak, membran bileşenlerinin difüzyon katsayısı, Fotobeyazlatma Sonrası Floresan Geri Kazanımı (FRAP)13 veya Floresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS)14 ile değerlendirilebilir. İkincisi, esas olarak yüksek hassasiyeti ve seçiciliği, mikroskobik algılama hacmi, düşük invazivliği ve geniş dinamik aralığı15 nedeniyle daha fazla dikkat çekmiştir.
FCS'nin kavramsal temeli, Magde ve meslektaşları tarafından yaklaşık 50 yıl önce16,17 tanıtıldı. Floresan emisyonunun dalgalanmasının yüksek zamansal çözünürlükle (μs'den s'ye)18 kaydedilmesine dayanır. Modern versiyonunda, canlı hücrelerdeki ölçümler, bir ilgi alanına (örneğin, plazma zarında) yerleştirilmiş küçük bir konfokal uyarma hacmi (~ 0.3 femtolitre) ile gerçekleştirilir; Gözlem hacmine giren ve çıkan floresan moleküllerinin yayılmasıyla üretilen floresan sinyali, çok yüksek zamansal çözünürlükle (yani, her fotonun dedektöre varış zamanı) toplanır. Daha sonra, sinyal, bir molekülün odak hacmi içinde kaldığı ortalama td (difüzyon süresi), ACF'nin genliği ile ters orantılı olan gözlem hacminde bulunan ortalama parçacık sayısı (N) ile birlikte çıkarıldığı otokorelasyon fonksiyonunu (ACF) üretmek için hesaplanır. Bu son parametre, gözlem hacmi içindeki molekül konsantrasyonu hakkında yararlı bilgiler olabilir.
O zamandan beri, biyofotonikte hızla gelişen enstrümantasyon sayesinde giderek artan sayıda FCS modalitesi uygulanmakta ve canlı sistemlerde meydana gelen dinamik olayların tanımlanmasına izin verilmektedir. Yine de, moleküler bir tür, genellikle moleküllerin19. zamanda doğrusal olmayan bir ilişkiyle yayıldığı anormal bir difüzyon karakteristiği tarafından yansıtılan difüzyon katsayısı değerlerinin daha örtüşen bir dağılımını ve bu anormal subdifüzyonun biyolojik anlamını tanımlamada zorluk çekecektir. Geçmişte, bu zorluk, FRAP tarafından moleküler difüzyonun sadece bir alandan değil, çeşitli boyutlardaki alanlardan kaydedilmesiyle bir şekilde aşılmış ve böylece ek mekansal bilgi sağlanmıştır. Bu, örneğin, membran mikrodomainleri20,21,22'nin kavramsallaştırılmasını sağladı.
Bu stratejinin FCS ölçümlerine çevirisi (yani, spot varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS)), gözlemin odak hacminin boyutunu değiştirerek floresandaki dalgalanmanın farklı uzamsal ölçeklerde kaydedilmesine izin vererek kurulmuştur23. Bu nedenle, svFCS yaklaşımı, incelenen moleküllerin moleküler difüzyon modlarının ve membran bölümleme tipinin (izole ve bitişik alanlar24) tanımlanmasına ve belirlenmesine izin veren dolaylı mekansal bilgi sağlar. Difüzyon süresi td'yi, bu durumda23,25 numaralı algılama ışını yarıçapı boyutuna karşılık gelen bel (ω) değeri tarafından tanımlanan çeşitli uzamsal ölçeklerin bir fonksiyonu olarak çizerek, belirli bir fizyolojik durumda belirli bir molekülün difüzyon yasasını karakterize edebilir. Bu nedenle svFCS, zaman alanı26'da tek parçacık izlemenin mükemmel bir analogudur. Brownian difüzyon kısıtlaması altında, difüzyon zamanı td ile bel ω arasında kesinlikle doğrusal bir ilişki beklenmelidir (Şekil 1)23,25. Difüzyon yasasının bu şemadan sapmasının kökeni, sitoiskelet ağı, moleküler kalabalıklaşma, nanodomainlerde dinamik bölümleme veya bunların ve diğer etkilerin herhangi bir kombinasyonu gibi münhasır olmayan nedenlere bağlanabilir (Şekil 1) ve deneysel olarak test edilmesi gerekir25.
Burada, sıfırdan inşa edilmiş özel yapım bir svFCS optik sisteminin günlük kullanımı için gerekli tüm kontrol noktalarını sağlıyoruz, bu da bu deneysel yaklaşımla ilgili önceki protokol incelemelerimiz27,28'i tamamlıyor. Ayrıca, kavramın bir kanıtı olarak, kurulumun kalibrasyonu, hücrelerin hazırlanması, veri toplama ve lipid-sal nanodomainlerinde lokalize olduğu bilinen bir plazma zarı glikozilfosfatidilinositol ile implante edilmiş bir protein olan Thy1-GFP için svFCS difüzyon yasasının (DL) oluşturulması için analiz ile ilgili kılavuzlar veriyoruz29. Son olarak, kolesterol oksidaz tedavisi ile lipid-sal nanodomainlerinin kısmi destabilizasyonunun Thy1-GFP'nin difüzyon özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz. Ek olarak, sıfırdan bir svFCS kurulumu oluşturmanın ayrıntılı bir açıklaması Ek materyalde verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>SM1 Dişli Tutma Halkaları için</td> <td>Aligment aracı</td> Anahtar <td>Anahtarı Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Çığ Fotodiyot ve Tek Foton Sayma Modülü (SPCM)</td> <td>Tek Foton Sayma Modülü, Çığ Fotodiyot</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 & Omega; 50 & Omega'ya takın; fiş ucu 2 m</td><td>RS Bileşenleri</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Koaksiyel kablo 415 Cinch Konnektörler, RG-316, 50 ve Omega; Konnektörlü, 1,22 m, RoHS2</td><td>RS Bileşenleri</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega; RF Adaptörü BNC Fişi BNC Soketine 0 & 1GHz</td><td>RS Bileşenleri</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2,5 m, 8 Soket Tipi E &ndash; Fransız Uzatma Kablosu, 230 V</td><td>RS Bileşenleri</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Maskot, 6W Fişli Güç Kaynağı 5V dc, 1.2A, 1 Çıkış Anahtarlamalı Mod Güç Kaynağı, C Tipi</td><td>RS Bileşenleri</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Referans Osilatör Güç Kablosu RF Adaptörü</td><td>RS Bileşenleri</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Floresan filtreleme</td><td>535/70 ET Bant Geçişi, AOI 0 ve derece; Renk Çapı 25 mm</td><td>AHF filtre</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Lazer Işın Ayırıcı zt488 RDC, AOI 45 derece; Chroma 25,5 x 36 x 1 mm</td><td>AHF filtre</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Uzun Geçiren Filtre, AOI 0&derece; Renk Çapı 25</td><td>AHF filtresi</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Donanım korelasyonu</td><td>80 MHz Dijital Korelatör</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Lazer</td><td>LAZER LASOS LDM-XT fiber bağlantılı, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Lazer güvenliği</td><td>Yüksek Performanslı Siyah Maskeleme Bandı, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Rulo</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Lens Mendilleri, Kitapçık Başına 25 Yaprak, 5 Kitapçık</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>Lazer Güvenlik Gözlükleri, Açık Turuncu Lensler, %48 Görünür Işık İletimi</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Axiovert 200M Motorlu Ters Floresan Mikroskobu İnce ve kaba odaklama, reflektör taret dönüşü, objektif burunluk dönüşü, kamera portlarını değiştirme ve dahili ışık panjurları</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm, D=0,17 mm'de), UV-VIS-IR için C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected Carl</td><td>Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adaptör W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Orta halka W0.8 - W0.8 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Optik yol</td><td>D25.4mm Ayna, Korumalı Gümüş</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr> Serisi<tr><td></td><td>D25,4 mm, F=60,0 mm, Görünür Akromatik</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25,4 mm, F=35,0,0 mm, Görünür Akromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &mikro; m montajlı iğne deliği</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Montajlı Sıfır, Sipariş 1/2 Dalga Plakası 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polarize Işın Ayırıcı Küp 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Dönme Aşaması 56 mm x 26 mm Dişli</td> ID <td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Kinematik Platform Montajı</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Ayarlanabilir Prizma Kelepçesi</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Işın bloğu - aktif alan 19 mm x 38 mm Thorlabs</td><td></td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>İris Diyafram 1 mm - 25 mm Diyafram Açıklığı</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Solak Kinematik Silindirik Lens Montajı</td><td></td><td>Thorlabs</td> KM100CL</tr><tr><td></td><td>1" Optik Tutucu, M4 Tap</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1" İstiflenebilir Lens Tüpü</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>1" optik kullanılabilir derinlik ve frak12 için İstiflenebilir Lens Montajı;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>1 "Optik Kullanılabilir Derinlik 2" için İstiflenebilir Lens Yuvası</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Küçük Optik Raylar 600mm, metrik</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600 / M</td></tr><tr><td></td><td>Küçük Optik Raylar 75mm, metrik</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075 / M</td></tr><tr><td></td><td>Küçük Optik Raylar 150mm, metrik</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150 / M</td></tr><tr><td></td><td>Ray Taşıyıcı, Havşa Delikli 1 "x 1"</td> <td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Ray Taşıyıcı, Dikey Kırlangıç Kuyruğu</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td> 1 inç <td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td><td></td></tr><tr><td></td> & frac12 için Yüksek Hassasiyetli Çeviri Lens Dağı<td>; " (12mm) Kırlangıç Kuyruğu Çeviri Aşaması</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Ray Kelepçeleri</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Metrik XYZ Çeviri Aşaması (PT102 içerir)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>Siyah Lastikli Kumaş</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>Bilyalı Sürücü kiti / 6 araç</td><td>Harici</td> M6 x 1.0 Dişli ve Harici M4 x 0.7 Dişli Thorlabs <td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>Adaptörü</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>Montaj Tabanı, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5'li Paket</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>25,4 mm optik Thorlabs</td><td></td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC Adaptörü</td> için Lens Yuvası <td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>1 inç Optik için Kinematik Ayna Montajı</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Silikon Güç Kafası, 400-1100nm, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm Direk Tutucular, Yaylı Altıgen Kilitli Kelebek Vida L=50 mm, 5'li</td><td>Paket Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Yaylı Altıgen Kilitli Kelebek Vidalı Direk Tutucu, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 50 mm Paslanmaz Çelik Optik Direk, M4 Saplama, M6 Dişli Delik, 5'li Paket</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 75 mm Paslanmaz Çelik Optik Direk, M4 Saplama, M6 Dişli Delik, 5'li Paket</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>USB Güç ve Enerji Ölçer Arayüzü</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 30 mm Paslanmaz Çelik Optik Direk, M4 Saplama, M6 Dişli Delikli</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 20 mm Paslanmaz Çelik Optik Direk, M4 Saplama, M6 Dişli Delikli</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 mm uzunluğunda Yapısal Ray (algılama kutusu)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>350 mm uzunluğunda Yapısal Ray (algılama kutusu)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>25 mm Raylar için Hızlı Köşe Küpü</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>25 mm Raylar için Dik Açılı Braket</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>Siyah poster panosu 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1,6 mm) Kalın, 5 Yaprak</td><td>Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>25 mm Ray Muhafazaları</td> <td>için MenteşeThorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>25 mm Ray Muhafazaları için Kapak Durdurucu</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Kapaklı Vida Takımı</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 Kapaklı Vida Takımı ve Donanım kiti</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td>Masa Kelepçesi, L-Şekli</td><td></td>, 5'li Paket <td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Halka Tahrikli İris Diyaframı (&oslash; 0.8 - &Oslash; 12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash; 1" SM1 Montajlı Buzlu Cam Hizalama Diski w/&Oslash; 1 mm Delik</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>Petek Optik Masa Üstü, Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>Optik Masa desteği, Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>Örnek nano konumlandırma</td><td>Hassas XYZ Nano Konumlandırma</td><td>Fiziği Enstrüman</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>Dijital Çok Kanallı Piezo Co, 3 Kanal, -30 ila 130 V Alt D Konnektör(ler)i, Kapasitif Sensörler,</td> <td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>Sıcaklık odası</td><td>Zeiss 200M Ters Mikroskop İnkübatör Sistemi MATT BLK</td><td>Dijital Piksel</td> Çift Kanallı <td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroişlemci Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>Dijital Piksel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>İki Titreşimsiz Isıtıcı Modülü</td><td>Dijital Piksel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 Sıcaklık</td><td>Sensörü Dijital Piksel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td><güçlü>Biyolojik Reaktifler ve Malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü ve transfeksiyon</td><td>Cos7 hücreleri</td><td>ATCC ve reg;</td><td>CRL-1651 ve ticaret;</td></tr><tr><td></td><td>8 kuyulu Lab-Tek odaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>PBS tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Transfeksiyon Reaktifi</td><td>SignaGen Laboratuvarları</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Kolesterol içeriği ölçümü</td><td>Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Çalışma Çözümü</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Mikroplaka Okuyucu</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS ölçümleri</td><td>HBSS tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Kolesterol oksidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

canlı hücrelerin plazma membranında moleküler difüzyonun analizi için spot varyasyon floresan korelasyon spektroskopisi

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Plazma zarı organizasyonu ile ilişkili olanlar da dahil olmak üzere canlı hücrelerdeki dinamik biyolojik süreçler, sırasıyla nanometrelerden mikrometrelere ve mikrosaniyelerden dakikalara kadar değişen çeşitli mekansal ve zamansal ölçeklerde meydana gelir. Bu kadar geniş bir biyolojik süreç yelpazesi, geleneksel mikroskopi yaklaşımlarına meydan okuyor. Burada, özelleştirilen klasik bir floresan mikroskobu kullanarak nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) ölçümlerini uygulama prosedürünü detaylandırıyoruz. Protokol, svFCS kurulumunun özel bir performans kontrolünü ve fizyolojik koşullar altında canlı hücrelerin plazma zarı üzerinde svFCS tarafından moleküler difüzyon ölçümleri için kılavuzları içerir. Ek olarak, kolesterol oksidaz tedavisi ile plazma membran sal nanodomainlerini bozmak için bir prosedür sunuyoruz ve plazma zarının lateral organizasyonundaki bu değişikliklerin svFCS analizi ile nasıl ortaya çıkarılabileceğini gösteriyoruz. Sonuç olarak, bu floresan bazlı yöntem, plazma zarının lateral organizasyonu hakkında uygun mekansal ve zamansal çözünürlükle benzeri görülmemiş detaylar sağlayabilir.

Cos-7 hücrelerinde eksprese edilen Thy1-GFP için bir DL ürettik (Şekil 4, siyah kareler). Difüzyon yasası pozitif bir t0 değerine (19.47 ms ± 2 ms) sahiptir, bu da Thy1-GFP'nin plazma zarının nanodomain yapılarında sınırlı olduğunu gösterir. Thy1-GFP'yi eksprese eden hücrelerin kolesterol oksidaz tedavisi, DL t0 değerinin 7.36 ± 1.34 ms'ye kaymasıyla sonuçlanmıştır (Şekil 4, gri kareler). Bu gözlem, Thy1-GFP hapsinin doğasının kolesterol içeriğine bağlı olduğunu ve lipit sal nanodomainleri ile ilişkili olduğunu doğrulamaktadır. Bu iki difüzyon yasasının, yukarıda açıklanan istatistiksel teste göre (bkz. adım 9.1.3) t0 ve Deff değerleri açısından farklı olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, tedavi edilmemiş Cos-7 hücrelerinde toplam hücresel kolesterol konsantrasyonunu, COaz ile tedavi edilen hücrelere karşı değerlendirdik. COaz tedavisi üzerine total kolesterol içeriğinde küçük ama anlamlı bir azalma gözlenir (Şekil 5). Bu enzim sadece plazma zarının dış broşüründe erişilebilen kolesterol havuzuna etki ettiğinden, kolesterolde gözlenen azalmanın sadece plazma zarı ile ilişkili olduğunu ve lipit sal nanodomainlerinin dengesizleşmesine neden olduğunu varsayıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Şekil 1: Farklı membran organizasyonu formları için nokta varyasyonu FCS tarafından oluşturulan simüle edilmiş floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) difüzyon yasaları. (Üst paneller) Membran organizasyonunun şematik gösterimi - (A) serbest difüzyon, (B) örgü bariyerleri ve (C) tuzak / etki alanı hapsedilmeleri - tek bir molekül için çizilen yörünge (kırmızı). Mavi daireler, zarın kesişimini ve bel ω lazer ışınını gösterir. (Alt paneller) FCS difüzyon yasaları, difüzyon zamanının t d'yi ω2 karesinin bir fonksiyonu olarak çizerek temsil edilir. Difüzyon yasası projeksiyonu (yeşil kesikli çizgi), serbest difüzyon durumunda (A) orijinde (t 0 = 0) zaman eksenini keser; (B) örgü bariyerleri olduğunda negatif eksende (t 0 &lt; 0) veya tuzaklar ve alanlar (lipit salları) olduğunda (C) pozitif eksende (t0 &gt; 0) D, Brownian hareketi için yanal difüzyon katsayısıdır; Deff, etkili difüzyon katsayısı; Dmikro, ağ tuzaklarının içindeki mikroskobik difüzyon katsayısı; Diçinde, etki alanları içindeki difüzyon katsayısı; Ddışarı, etki alanları dışındaki difüzyon katsayısı; L, kare bir alanın kenarının boyutu; ve rD, dairesel bir alanın yarıçapı. Bu rakam He ve Marguet6'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Şekil 2: svFCS donanım denetiminin şematik görünümü. Bilgisayar tüm cihazları farklı iletişim protokolleri aracılığıyla kontrol eder: seri (mikroskop, harici deklanşör), USB (XYZ piezoelektrik aşama, korelatör) ve PCI (edinme kartı). DAQ: veri toplama kartı, APD: çığ fotodiyot, SPCM: tek foton sayma modülü, DO: dijital çıkış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Şekil 3: svFCS kurulumunun uyarma ve emisyon optik yollarının şematik görünümü. svFCS kurulumu dört modül içerir: (1) fiberli bir 488 nm lazerin çıkışı harmanlanır, (2) yarım dalga plakası ve polarize edici ışın ayırıcının bir kombinasyonu optik gücü ayarlar, (3) tüp lenssiz motorlu mikroskoptan geçtikten sonra numuneye odaklanan lazer ışını ve (4) floresan, tek bir foton sayma modülüne bağlı bir çığ fotodiyotuna konfokal benzeri bir algılama yolu aracılığıyla tespit edilir, bu da bir donanım korelatörüne sinyal gönderir. Sadelik, sisteme hassasiyetini, sağlamlığını ve kullanım kolaylığını verir ( Ek materyalde yaygın olarak yorumlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Şekil 4: Cos-7'de ifade edilen Thy1-GFP'nin difüzyon analizinden elde edilen svFCS difüzyon yasaları. Cos-7 hücrelerinin tedavi edilmeden (NT, siyah kareler) ve kolesterol oksidaz tedavisinden sonra (COaz, gri daireler) svFCS difüzyon yasaları. Grafikteki ek, sunulan iki svFCS difüzyon yasası arasındaki anlamlı farkın istatistiksel testini temsil etmektedir (Mailfert ve ark.28'e göre). Test değeri (T), her iki difüzyon yasası farklı olduğunda 3.8 olarak ayarlanan eşiğin üzerinde olmalıdır. Ne kadar yüksek olursa, difüzyon yasaları arasındaki fark da o kadar büyük olur. T değeri renk kodludur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Şekil 5: Cos-7 hücrelerinde toplam kolesterol içeriğinin karşılaştırılması. Cos-7 hücreleri ya tedavi edilmedi (NT) ya da 1 saat boyunca 1 U / mL kolesterol oksidaz (COaz) ile tedavi edildi. Veriler, üçlü olarak yapılan bir denemenin bir örneğini temsil eder. İstatistiksel farkı değerlendirmek için iki kuyruklu, eşleşmemiş bir t-testi kullanıldı (α=0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Malzeme tablosu: svFCS kurulumu için gereken optik elemanların listesi.
Ek materyal: Bu belgede, svFCS kurulumunun sıfırdan oluşturulması açıklanmaktadır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Plazma zarı yanal organizasyonunun mevcut görünümü eksik kalmaktadır. Bu nedenle, spot varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi gibi bazı yeni yenilikçi tekniklerin uygulanması önemlidir. Bu, mükemmel zaman ve uzamsal çözünürlük ile karakterize edilen çok güçlü bir tekniktir.Ayrıca, non-invazivdir ve fizyolojik koşullar altında hücre zarlarını incelemeyi mümkün kılar. Her gün bir deney yapmadan önce, tüm iris diyaframlarını açın ve ilk iris tamamen açıkken lazer gücünü ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Maksimum gücü bulmak için yarıya kadar plakayı çevirin.Lazer gücü normalden düşükse, hizalamayı kontrol etmek için irisleri kullanın ve dönüşümlü olarak L1 ve M1'i gerektiği gibi hareket ettirin. Ardından bir laboratuvar not defterindeki güç değerini not edin. Algılama yolunu kontrol etmek için, objektife su, bir lamel ve iki nanomolar rodamin 6G çözeltisinden oluşan bir damla yerleştirin.Ardından ilişkilendirici yazılımını başlatın ve verileri kaydedin. Otomatik korelasyon fonksiyonu, düşük miktarda gürültü, küçük bir atık boyutu ve saniyede molekül başına yüksek bir sayım oranı göstermelidir. Nokta boyutunu kalibre etmek için, suya daldırma hedefine hücre kültürü kodlu bir örtü fişi yerleştirin ve örtü kızağına 200 mikrolitre iki nanomolar rodamin 6G çözeltisi ekleyin.488 nanometre lazer ışını gücünü 300 mikrowatt'a ayarlayın ve yazılımda svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını seçin. APD'yi açın ve minimum atık boyutunu elde etmek için bir sinyal düşene kadar irisi açın veya daha büyük bir atık boyutu için kapatın. İstatistiksel tekrarlanabilirliği artırmak ve APD'yi kapatmak için yaklaşık 10, 20 saniyelik otomatik korelasyon fonksiyonlarını kaydedin.Uygun bir veri analizi programında, moleküler agregalar nedeniyle güçlü dalgalanmalara sahip çalışmaları kontrol edin ve atın, ardından tutulan otomatik korelasyon fonksiyonunun ortalamasını bir 3d difüzyon modeliyle eşleştirin, uydurma parametrelerinden ortalama difüzyon süresini çıkarın ve verileri bir TXT dosyası olarak kaydedin. SvFCS analizi için, iki ila dört mikrowatt arasında çalışan 488 nanometre ışınını ayarlayın ve numuneleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca dengeleyin. svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını ve APD'yi seçin.Ardından, seçilen hücrenin bir XY taraması ve bir Z taraması gerçekleştirin. Maksimum floresan yoğunluğunda konfokal noktayı bulmak için hücrenin üst kısmındaki plazma zarını seçin ve veri toplamayı başlatın. İlişkilendirici yazılımda, 20'lik bir seri, beş saniyelik çalışma kaydedin.Son çalıştırmadan sonra, APD'yi kapatın ve gösterildiği gibi beklenmeyen çalıştırmaları atın. Ortalama otomatik korelasyon fonksiyonunu iki tür 2d difüzyon modeliyle eşleştirin ve montaj parametrelerini önceden kaydedilmiş TXT dosyasına kaydedin. İlgilenilen tüm hücreler kaydedildiğinde, tek bir difüzyon yasası oluşturmak için 200 ila 400 nanometre arasında değişen en az dört atık boyutunu analiz edin.Daha sonra MATLAB'da, en az dört atık boyutu deneyine karşılık gelen tüm TXT dosyalarını içeren bir klasör seçin ve kare atığa karşı difüzyon süresini çizin. Bu şekilde, Cos7 hücrelerinde ifade edilen Thy1-GFP için bir difüzyon yasası gözlemlenebilir. Difüzyon yasası, Thy1-GFP'nin plazma zarının nano alan yapıları içinde sınırlı olduğunu gösteren pozitif bir zaman sıfır değerine sahiptir.Bu analizde, Thy1-GFP'yi eksprese eden hücrelerin kolesterol oksidaz muamelesi, difüzyon yasası zaman sıfır değerinin 7.36 artı veya eksi 1.34 milisaniyeye kaymasıyla sonuçlandı. Thy1-GFP hapsinin doğasının kolesterol içeriğine bağlı olduğunu ve lipid sal nano alanlarıyla ilişkili olduğunu doğrulamak. Kolesterol oksidaz tedavisi üzerine toplam kolesterol içeriğinde küçük ama önemli bir azalma da gözlenmiştir.Bu enzim sadece plazma zarının dış broşüründe erişilebilen kolesterol havuzuna etki ettiğinden, bu veriler kolesterolde gözlenen düşüşün sadece plazma zarı ile ilişkili olduğunu ve lipid sal nano alanlarının dengesizleşmesine neden olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken en önemli şey, svFCS sisteminin uygun şekilde kalibre edilmesi ve analiz için hücrelerin hazırlanmasıdır. svFCS, hücre zarı organizasyonunu incelemek için mükemmel bir araçtır.Bununla birlikte, hücre içi moleküllerin difüzyonunu analiz etmek için de kullanılabilir. Bu teknik, potansiyel ilaçların kanser hücreleri gibi canlı hücreler üzerindeki etkisini belirlemek için biyotıpta başarıyla uygulanabilir.

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Öğrenin, canlı hücrelerin plazma membranında moleküler difüzyonu svFCS mikroskobu ile nasıl ölçülür. Bu yöntem, kolesterolün lipid raft organizasyonu üzerindeki etkisini incelemek için yüksek çözünürlük sunar.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet