Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi
12 Kasım 2020
Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Plazma zarı yanal organizasyonunun mevcut görünümü eksik kalmaktadır. Bu nedenle, spot varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi gibi bazı yeni yenilikçi tekniklerin uygulanması önemlidir. Bu, mükemmel zaman ve uzamsal çözünürlük ile karakterize edilen çok güçlü bir tekniktir.
Ayrıca, non-invazivdir ve fizyolojik koşullar altında hücre zarlarını incelemeyi mümkün kılar. Her gün bir deney yapmadan önce, tüm iris diyaframlarını açın ve ilk iris tamamen açıkken lazer gücünü ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Maksimum gücü bulmak için yarıya kadar plakayı çevirin.
Lazer gücü normalden düşükse, hizalamayı kontrol etmek için irisleri kullanın ve dönüşümlü olarak L1 ve M1'i gerektiği gibi hareket ettirin. Ardından bir laboratuvar not defterindeki güç değerini not edin. Algılama yolunu kontrol etmek için, objektife su, bir lamel ve iki nanomolar rodamin 6G çözeltisinden oluşan bir damla yerleştirin.
Ardından ilişkilendirici yazılımını başlatın ve verileri kaydedin. Otomatik korelasyon fonksiyonu, düşük miktarda gürültü, küçük bir atık boyutu ve saniyede molekül başına yüksek bir sayım oranı göstermelidir. Nokta boyutunu kalibre etmek için, suya daldırma hedefine hücre kültürü kodlu bir örtü fişi yerleştirin ve örtü kızağına 200 mikrolitre iki nanomolar rodamin 6G çözeltisi ekleyin.
488 nanometre lazer ışını gücünü 300 mikrowatt'a ayarlayın ve yazılımda svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını seçin. APD'yi açın ve minimum atık boyutunu elde etmek için bir sinyal düşene kadar irisi açın veya daha büyük bir atık boyutu için kapatın. İstatistiksel tekrarlanabilirliği artırmak ve APD'yi kapatmak için yaklaşık 10, 20 saniyelik otomatik korelasyon fonksiyonlarını kaydedin.
Uygun bir veri analizi programında, moleküler agregalar nedeniyle güçlü dalgalanmalara sahip çalışmaları kontrol edin ve atın, ardından tutulan otomatik korelasyon fonksiyonunun ortalamasını bir 3d difüzyon modeliyle eşleştirin, uydurma parametrelerinden ortalama difüzyon süresini çıkarın ve verileri bir TXT dosyası olarak kaydedin. SvFCS analizi için, iki ila dört mikrowatt arasında çalışan 488 nanometre ışınını ayarlayın ve numuneleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca dengeleyin. svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını ve APD'yi seçin.
Ardından, seçilen hücrenin bir XY taraması ve bir Z taraması gerçekleştirin. Maksimum floresan yoğunluğunda konfokal noktayı bulmak için hücrenin üst kısmındaki plazma zarını seçin ve veri toplamayı başlatın. İlişkilendirici yazılımda, 20'lik bir seri, beş saniyelik çalışma kaydedin.
Son çalıştırmadan sonra, APD'yi kapatın ve gösterildiği gibi beklenmeyen çalıştırmaları atın. Ortalama otomatik korelasyon fonksiyonunu iki tür 2d difüzyon modeliyle eşleştirin ve montaj parametrelerini önceden kaydedilmiş TXT dosyasına kaydedin. İlgilenilen tüm hücreler kaydedildiğinde, tek bir difüzyon yasası oluşturmak için 200 ila 400 nanometre arasında değişen en az dört atık boyutunu analiz edin.
Daha sonra MATLAB'da, en az dört atık boyutu deneyine karşılık gelen tüm TXT dosyalarını içeren bir klasör seçin ve kare atığa karşı difüzyon süresini çizin. Bu şekilde, Cos7 hücrelerinde ifade edilen Thy1-GFP için bir difüzyon yasası gözlemlenebilir. Difüzyon yasası, Thy1-GFP'nin plazma zarının nano alan yapıları içinde sınırlı olduğunu gösteren pozitif bir zaman sıfır değerine sahiptir.
Bu analizde, Thy1-GFP'yi eksprese eden hücrelerin kolesterol oksidaz muamelesi, difüzyon yasası zaman sıfır değerinin 7.36 artı veya eksi 1.34 milisaniyeye kaymasıyla sonuçlandı. Thy1-GFP hapsinin doğasının kolesterol içeriğine bağlı olduğunu ve lipid sal nano alanlarıyla ilişkili olduğunu doğrulamak. Kolesterol oksidaz tedavisi üzerine toplam kolesterol içeriğinde küçük ama önemli bir azalma da gözlenmiştir.
Bu enzim sadece plazma zarının dış broşüründe erişilebilen kolesterol havuzuna etki ettiğinden, bu veriler kolesterolde gözlenen düşüşün sadece plazma zarı ile ilişkili olduğunu ve lipid sal nano alanlarının dengesizleşmesine neden olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken en önemli şey, svFCS sisteminin uygun şekilde kalibre edilmesi ve analiz için hücrelerin hazırlanmasıdır. svFCS, hücre zarı organizasyonunu incelemek için mükemmel bir araçtır.
Bununla birlikte, hücre içi moleküllerin difüzyonunu analiz etmek için de kullanılabilir. Bu teknik, potansiyel ilaçların kanser hücreleri gibi canlı hücreler üzerindeki etkisini belirlemek için biyotıpta başarıyla uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, canlı hücrelerin plazma membranındaki moleküler difüzyonu ölçmek için bir nokta varyasyonlu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobu kurmaya yönelik bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, invaziv olmayan bir yöntem olmasının yanı sıra mükemmel zaman ve uzaysal çözünürlük sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Mikroskopi
Arka Plan
- Plazma membranının lateral organizasyonu henüz tam olarak anlaşılamamıştır.
- Daha iyi içgörüler elde etmek için svFCS gibi yenilikçi tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır.
- svFCS, hücre membranlarının fizyolojik koşullar altında incelenmesine olanak tanır.
- Doğru sonuçlar elde etmek için uygun kalibrasyon ve hücre hazırlığı kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- svFCS mikroskopisi için bir protokol geliştirmek.
- Plazma membranındaki moleküler difüzyonu ölçmek.
- Kolesterolün membran organizasyonu üzerindeki etkisini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Rhodamine 6G solüsyonu kullanılarak svFCS sisteminin kalibrasyonu.
- Seçili hücrelerin XY ve Z taramaları yoluyla veri toplama.
- MATLAB kullanılarak difüzyon yasalarının analizi.
- Kolesterol oksidaz işlemi öncesi ve sonrası difüzyon parametrelerinin karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Thy1-GFP difüzyonu nano alan yapıları içerisinde sınırlıdır.
- Kolesterol oksidaz uygulaması, difüzyon yasasının sıfırıncı zaman değerini kaydırır.
- Toplam kolesterol içeriğinde bir azalma gözlemlenmiştir.
- Çalışma, kolesterolün lipid sal stabilitesini etkilediğini göstermektedir.
Sonuçlar
- svFCS, hücre membranı organizasyonunu incelemek için etkilidir.
- Bu teknik, hücre içi molekül difüzyonunu da analiz edebilir.
- Bulgular, ilaçların canlı hücreler üzerindeki etkilerini anlamak açısından önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Nokta varyasyonlu Floresans Korelasyon Spektroskopisi (svFCS), fizyolojik koşullar altında plazma membranındaki moleküler difüzyonun yüksek çözünürlüklü analizini sağlayarak membran organizasyonu ve lipid sal yapısı dinamikleri hakkında kritik bilgiler sunar. Bu yetenek, membranla ilişkili proteinlerin biyofiziksel bağlamını aydınlatarak hedef doğrulamasını destekler ve erken keşif aşamasında mekanizmaya dayalı risk azaltma süreçlerine veri sağlar. Yöntemin non-invaziv doğası ve canlı hücrelerle uyumluluğu, preklinik taramalardaki ve translasyonel biyobelirteç çalışmalarındaki kullanışlılığını artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nanodomain yapıları içindeki Thy1-GFP gibi membran proteinlerinin difüzyon davranışını nicelleştirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kolesterole bağımlı sınırlamayı ortaya çıkararak lipid raft ilişkilerinin fonksiyonel doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Membran lokalizasyonu lipid ortamı pertürbasyonlarına karşı hassas olan hedefleri belirleyerek portföy elemesine destek olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Fizyolojik koşullar altında temel difüzyon yasalarını belirleyerek, bileşik taraması için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Farklı ışın bel boyutlarında tekrarlanabilir difüzyon süresi ölçümleri üretir ve analiz standardizasyonunu destekler.
- Tarama Uygunluğu: Membran organizasyonundaki değişiklikleri veya hedef etkileşimini belirten, bileşik kaynaklı difüzyon parametresi kaymalarını tespit eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Lipid disregülasyonu ile ilişkili patolojiler için önem taşıyan plazma membran raft nanodomain bozulmasını modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Çevresel perturbasyonların (örneğin, kolesterol modülasyonu) hedef davranışını nasıl değiştirdiğini göstererek, erken keşif gözlemlerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Risk Ayarlı Kararlar: Hedefin membran perturbasyonlarına karşı dayanıklılığına dayalı go/no-go kriterlerini bilgilendiren mekanistik okumalar sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
svFCS, hedef hipotez testlerinden aday bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, biyokimyasal ve fenotipik analizleri tamamlayan biyofiziksel bir karakterizasyon katmanı sunar.
- Keşif Biyolojisi: Difüzyon katsayılarını ölçerek ve kısıtlanmış ile mobil moleküler popülasyonları tanımlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Rhodamine 6G kullanılarak yapılan standartlaştırılmış kalibrasyon ve deteksiyon yolu bütünlüğünün doğrulanması yoluyla analiz hazırlığını sağlar.
- Analitik: Oto korelasyon fonksiyonlarının MATLAB analizi üzerinden kantitatif difüzyon yasaları sunarak, farklı koşullarda moleküler davranışların karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Membran organizasyonundaki değişiklikleri fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirir ve difüzyon kaymaları fenotipik yanıtlarla korele olduğunda biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve hücre hattında membran protein dinamiklerini incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Plazma membranındaki nanölçekli sınırlamayı ve difüzyon heterojenliğini çözerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış lazer gücü kalibrasyonu, deteksiyon yolu kontrolleri ve tekrarlı otokorelasyon fonksiyonu ortalaması ile tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Doğal benzeri membran ortamlarında hedef stabilitesini nicelendirerek, öngörülemeyen biyofiziksel risklerden kaynaklanan geç aşama kayıplarını azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hedeflerin, uygun lokalizasyon ve fonksiyon için lipid raft bütünlüğüne olan bağımlılıklarına göre riskle düzeltilmiş önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Floresans mikroskobisi, lazer güvenliği ve korelasyon spektroskopisi veri analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- APD, korelatör yazılımı ve hassas lazer güç kontrolü (svFCS ölçümleri için 2–4 µW) özelliklerine sahip özelleştirilmiş bir floresans mikroskobuna ihtiyaç duyulur.
- Kalibrasyon protokollerinin (örneğin, rhodamine 6G nokta boyutu doğrulaması) ve veri analizi iş akışlarının (örneğin, 2D difüzyon modellerinin MATLAB ile uydurulması) ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Kolesterol oksidaz dışındaki farklı membran proteinleri, hücre tipleri ve perturbasyon ajanları için adaptasyon değerlendirmelerini kapsar.
- Moleküler agregatları önlemek ve 37°C dengeleme sırasında fizyolojik uygunluğu sağlamak için gereken titiz numune hazırlama ihtiyacı ile sınırlıdır.
