Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi
November 12th, 2020
Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Plazma zarı yanal organizasyonunun mevcut görünümü eksik kalmaktadır. Bu nedenle, spot varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi gibi bazı yeni yenilikçi tekniklerin uygulanması önemlidir. Bu, mükemmel zaman ve uzamsal çözünürlük ile karakterize edilen çok güçlü bir tekniktir.
Ayrıca, non-invazivdir ve fizyolojik koşullar altında hücre zarlarını incelemeyi mümkün kılar. Her gün bir deney yapmadan önce, tüm iris diyaframlarını açın ve ilk iris tamamen açıkken lazer gücünü ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Maksimum gücü bulmak için yarıya kadar plakayı çevirin.
Lazer gücü normalden düşükse, hizalamayı kontrol etmek için irisleri kullanın ve dönüşümlü olarak L1 ve M1'i gerektiği gibi hareket ettirin. Ardından bir laboratuvar not defterindeki güç değerini not edin. Algılama yolunu kontrol etmek için, objektife su, bir lamel ve iki nanomolar rodamin 6G çözeltisinden oluşan bir damla yerleştirin.
Ardından ilişkilendirici yazılımını başlatın ve verileri kaydedin. Otomatik korelasyon fonksiyonu, düşük miktarda gürültü, küçük bir atık boyutu ve saniyede molekül başına yüksek bir sayım oranı göstermelidir. Nokta boyutunu kalibre etmek için, suya daldırma hedefine hücre kültürü kodlu bir örtü fişi yerleştirin ve örtü kızağına 200 mikrolitre iki nanomolar rodamin 6G çözeltisi ekleyin.
488 nanometre lazer ışını gücünü 300 mikrowatt'a ayarlayın ve yazılımda svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını seçin. APD'yi açın ve minimum atık boyutunu elde etmek için bir sinyal düşene kadar irisi açın veya daha büyük bir atık boyutu için kapatın. İstatistiksel tekrarlanabilirliği artırmak ve APD'yi kapatmak için yaklaşık 10, 20 saniyelik otomatik korelasyon fonksiyonlarını kaydedin.
Uygun bir veri analizi programında, moleküler agregalar nedeniyle güçlü dalgalanmalara sahip çalışmaları kontrol edin ve atın, ardından tutulan otomatik korelasyon fonksiyonunun ortalamasını bir 3d difüzyon modeliyle eşleştirin, uydurma parametrelerinden ortalama difüzyon süresini çıkarın ve verileri bir TXT dosyası olarak kaydedin. SvFCS analizi için, iki ila dört mikrowatt arasında çalışan 488 nanometre ışınını ayarlayın ve numuneleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca dengeleyin. svFCS aydınlatma algılama mikroskobu bağlantı noktasını ve APD'yi seçin.
Ardından, seçilen hücrenin bir XY taraması ve bir Z taraması gerçekleştirin. Maksimum floresan yoğunluğunda konfokal noktayı bulmak için hücrenin üst kısmındaki plazma zarını seçin ve veri toplamayı başlatın. İlişkilendirici yazılımda, 20'lik bir seri, beş saniyelik çalışma kaydedin.
Son çalıştırmadan sonra, APD'yi kapatın ve gösterildiği gibi beklenmeyen çalıştırmaları atın. Ortalama otomatik korelasyon fonksiyonunu iki tür 2d difüzyon modeliyle eşleştirin ve montaj parametrelerini önceden kaydedilmiş TXT dosyasına kaydedin. İlgilenilen tüm hücreler kaydedildiğinde, tek bir difüzyon yasası oluşturmak için 200 ila 400 nanometre arasında değişen en az dört atık boyutunu analiz edin.
Daha sonra MATLAB'da, en az dört atık boyutu deneyine karşılık gelen tüm TXT dosyalarını içeren bir klasör seçin ve kare atığa karşı difüzyon süresini çizin. Bu şekilde, Cos7 hücrelerinde ifade edilen Thy1-GFP için bir difüzyon yasası gözlemlenebilir. Difüzyon yasası, Thy1-GFP'nin plazma zarının nano alan yapıları içinde sınırlı olduğunu gösteren pozitif bir zaman sıfır değerine sahiptir.
Bu analizde, Thy1-GFP'yi eksprese eden hücrelerin kolesterol oksidaz muamelesi, difüzyon yasası zaman sıfır değerinin 7.36 artı veya eksi 1.34 milisaniyeye kaymasıyla sonuçlandı. Thy1-GFP hapsinin doğasının kolesterol içeriğine bağlı olduğunu ve lipid sal nano alanlarıyla ilişkili olduğunu doğrulamak. Kolesterol oksidaz tedavisi üzerine toplam kolesterol içeriğinde küçük ama önemli bir azalma da gözlenmiştir.
Bu enzim sadece plazma zarının dış broşüründe erişilebilen kolesterol havuzuna etki ettiğinden, bu veriler kolesterolde gözlenen düşüşün sadece plazma zarı ile ilişkili olduğunu ve lipid sal nano alanlarının dengesizleşmesine neden olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken en önemli şey, svFCS sisteminin uygun şekilde kalibre edilmesi ve analiz için hücrelerin hazırlanmasıdır. svFCS, hücre zarı organizasyonunu incelemek için mükemmel bir araçtır.
Bununla birlikte, hücre içi moleküllerin difüzyonunu analiz etmek için de kullanılabilir. Bu teknik, potansiyel ilaçların kanser hücreleri gibi canlı hücreler üzerindeki etkisini belirlemek için biyotıpta başarıyla uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, yaşayan hücrelerin plazma zarında moleküler difüzyonu ölçmek için bir spot varyasyonlu Floresans Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobu oluşturma protokolü sunmaktadır. Teknik, istilacı olmayan mükemmel zaman ve uzamsal çözünürlük sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Mikroskopi
Arka Plan
- Plazma zarının yanal organizasyonu tam olarak anlaşılamamıştır.
- Daha iyi anlayışlar için svFCS gibi yenilikçi tekniklere ihtiyaç vardır.
- svFCS, hücre zarlarını fizyolojik koşullar altında incelemeye izin verir.
- Doğru sonuçlar için uygun kalibrasyon ve hücre hazırlığı kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- svFCS mikroskopi protokolü geliştirmek.
- Plazma zarında moleküler difüzyonu ölçmek.
- Kolesterolün membran organizasyonu üzerindeki etkisini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Rhodamine 6G çözeltisi kullanılarak svFCS sisteminin kalibrasyonu.
- Seçilen hücrelerin XY ve Z taraması ile veri alımı.
- MATLAB kullanılarak difüzyon yasalarının analizi.
- Kolesterol oksidaz tedavisi öncesi ve sonrası difüzyon parametrelerinin karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Thy1-GFP difüzyonu nano alan yapıları içerisinde sınırlıdır.
- Kolesterol oksidaz tedavisi, difüzyon yasası zaman sıfır değerini kaydırır.
- Toplam kolesterol içeriğinde bir azalma gözlendi.
- Çalışma, kolestrolün lipid raft stabilitesini etkilediğini öne sürmektedir.
Sonuçlar
- svFCS, hücre zar organizasyonunu incelemek için etkilidir.
- Teknik, hücre içi molekül difüzyonunu da analiz edebilir.
- Bulgular, yaşayan hücreler üzerindeki ilaç etkilerini anlamak için önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) enables high-resolution analysis of molecular diffusion at the plasma membrane under physiological conditions, providing critical insights into membrane organization and lipid raft dynamics. This capability supports target validation by elucidating the biophysical context of membrane-associated proteins, informing mechanistic de-risking in early discovery. The method’s non-invasive nature and compatibility with living cells enhance its utility in preclinical screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of membrane proteins like Thy1-GFP within nanodomain structures.
- Operational Value: Reveals cholesterol-dependent confinement, enabling functional validation of lipid raft associations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets whose membrane localization is sensitive to lipid environment perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline diffusion laws under physiological conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible diffusion time measurements across varying beam waist sizes, supporting assay standardization.
- Screening Relevance: Detects compound-induced shifts in diffusion parameters, indicating alterations in membrane organization or target engagement.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plasma membrane raft nanodomain disruption, relevant to pathologies involving lipid dysregulation.
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical validation by demonstrating how environmental perturbations (e.g., cholesterol modulation) alter target behavior.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic readouts that inform go/no-go criteria based on target resilience to membrane perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
svFCS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a biophysical layer of characterization that complements biochemical and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring diffusion coefficients and identifying confined vs. mobile molecular populations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized calibration using rhodamine 6G and validation of detection path integrity.
- Analytics: Delivers quantitative diffusion laws via MATLAB analysis of auto correlation functions, allowing comparison of molecular behavior across conditions.
- Translational Research: Links membrane organization changes to functional outcomes, supporting biomarker alignment when diffusion shifts correlate with phenotypic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying membrane protein dynamics across multiple targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving nanoscale confinement and diffusion heterogeneity at the plasma membrane.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized laser power calibration, detection path checks, and replicate auto correlation function averaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target stability in native-like membrane environments, reducing late-stage attrition due to unforeseen biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their dependence on lipid raft integrity for proper localization and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, laser safety, and correlation spectroscopy data analysis.
- Needs a customized fluorescence microscope with APD, correlator software, and precise laser power control (2–4 µW for svFCS measurements).
- Demands cross-team standardization of calibration protocols (e.g., rhodamine 6G spot size validation) and data analysis pipelines (e.g., MATLAB fitting of 2D diffusion models).
- Involves adaptation considerations for different membrane proteins, cell types, and perturbation agents beyond cholesterol oxidase.
- Limited by the need for careful sample preparation to avoid molecular aggregates and ensure physiological relevance during 37°C equilibration.
