Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

Bu yöntem, tüm in vitro deney setlerini gerçekleştirmek için yeterli miktarlarda tanımlanmış translasyon sonrası modifikasyonlarla saf montaja yetkin tübülin üretilmesine izin verir. Tübülin polimerizasyonu ve de-polimerizasyon döngülerine dayanan bu protokolün herhangi bir hücre biyolojisi laboratuvarında gerçekleştirilmesi kolaydır. Çok az uygulama süresi ile iyi miktarlarda tübülin üretilmesine izin verir.

Tübülini süspansiyon kültürlerinden saflaştırmak için, tübülin hazırlığından dokuz gün önce, altı birleşik 15 santimetrelik tabak elde etmek için istenen hücre tipini canlandırın ve çoğaltın. Tübülin hazırlığından sekiz gün önce, bir hücre kültürü dolabının altındaki her tabak başına her eğirici şişeye bir litre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve döndürücüleri hücre kültürü inkübatörünün içindeki bir karıştırma masasına yerleştirin. Ortamın inkübatörün atmosferine dengelenmesini sağlamak için yanal döndürücü kapakları hafifçe açık bırakın.

Ertesi gün, döner şişeleri aşılamak için birleşen bulaşıklardaki hücreleri kullanın. Döner şişeleri, yanal valfler hafifçe açık olacak şekilde bir hafta boyunca inkübatöre geri koyun. Hücreleri hasat etmek için, kültürleri döndürücü şişelerden bir litrelik santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Her peleti 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri dört santigrat derecede santrifüjleme için 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. 10 mililitrelik bir hücre peleti için, pelete 10 mililitre lizis tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Tübülini yapışık hücre kültürlerinden saflaştırmak için, tübülin hazırlama gününde 10 birleşik 15 santimetrelik tabak elde etmek için istenen hücre tipini canlandırın ve çoğaltın.

Yapışık hücreleri hasat etmek için, bir seferde üç tabağı muamele ederek, ikinci bir kişi hücreleri yedi mililitre PBS-EDTA ile nazikçe yıkarken, ortamı çıkarmak için kültür kaplarını eğin. Yıkamadan sonra, ikinci kişi, üçüncü bir kişinin hücreleri tabağın bir kenarına nazikçe itmek için bir hücre kaldırıcı kullanmasını sağlamadan önce, hücreleri tabak başına beş mililitre PBS-EDTA ile tedavi etmelidir. Hücreler ayrıldığında, hücreleri her üç tabaktan da buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve kalan hücreleri toplamak için her plakayı iki mililitre PBS-EDTA ile durulayın.

Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, hücre peletinin hacmini belirlemek için süpernatanı atın. Lizis tamponunu ekleyin, hücreleri yeniden askıya alın ve bunları 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Hücreleri yaklaşık 45 darbe için sonikasyon.

Fare beyni lizisi için, yetişkin bir fareden toplanan tek bir beyne 500 mikrolitre lisanslı tampon ekleyin ve dokuyu parçalamak için bir doku karıştırıcı kullanın. Lizatı hacminin 1 / 100'ünde eşit hacimde 2X Laemmli tamponuna elde ettikten sonra, çözeltiyi beş dakika kaynatın. Miktar tayinine kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Tübülin hazırlığının her adımında bu şekilde bir numune toplayın. Lizatı berraklaştırmak için, numuneyi santrifüjleyin ve üst yüzer tabakadan kaçınmaya dikkat ederek berrak süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarmak için uzun bir iğne kullanın. Lizat arıtmasından sonra, süpernatant içindeki yüzen malzemenin çıkarılması önemlidir, aksi takdirde tübülin saflaştırmasının verimliliğini olumsuz yönde etkileyebilir.

Arıtılmış lizattan tübülini polimerize etmek için, süpernatan olanın tüm hacmini 1/200 ile karıştırınth hacmi 0.2 molar GTP ve uygun boyutta bir tüpte yarım hacim ılık gliserol ile. Karışımı nazikçe pipetleyin, hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin. Tüpleri parafilm ile kapatın ve 20 dakika boyunca 30 santigrat derece su banyosuna koyun.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Pelet ikide bulunan mikrotübülleri depolimerize etmek için, peleti buz gibi soğuk BRB 80'de buz üzerinde beş dakika boyunca yeniden süspanse edin. Numuneyi önce bir P1000 pipetiyle, ardından bir P200 pipetiyle, her beş dakikada bir, 20 dakika boyunca buz üzerinde pipetleyin.

Numune homojen hale geldiğinde, santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Mikrotübül ile ilişkili proteinleri tübülinden çıkarmak için, süpernatan üçlünün tüm hacmini eşit hacimde önceden ısıtılmış bir molar boru S, aynı hacimde önceden ısıtılmış gliserol ve 1/100 hacim 0.2 molar GTP ile karıştırın. Santrifüjlemeden önce karışımı 30 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Mikrotübül ile ilişkili protein içeren süpernatan dördü yeni bir tüpe aktarın, pelet polimerize mikrotübüller içerir. Üçüncü bir polimerizasyon ve depolimerizasyon gerçekleştirildikten sonra, hasat edilen tübülin miktarı SDS sayfa analizi ile ölçülebilir. Saflaştırma işleminin başarısı, Coomassie lekeli bir SDS sayfasında teyit edilebilir.

Saflaştırılmış tübülinin beklenenden daha düşük bir verimi, ikinci, dördüncü ve altıncı pelet fraksiyonlarında daha düşük tübülin miktarı ve ikinci, dördüncü ve altıncı süpernatan fraksiyonlarında daha yüksek miktar ile kanıtlandığı gibi verimsiz bir tübülin polimerizasyonundan kaynaklanabilir. Saflaştırılmış tübülini ölçmek için, numuneler bilinen miktarlarda sığır serum albümininin yanında çalıştırılabilir. Protein bantlarının kantitatif dansitometrisi daha sonra saflaştırılmış tübülin miktarının hesaplanmasına izin verir.

Tübülinin modifikasyon durumu, numunelerin immüno-blot analizi ile doğrulanabilir. Protokolümüz, kontrollü translasyon sonrası modifikasyonlarla tübülinin izolasyonuna izin verir. Bu tübülin ile, tübülin modifikasyonlarının mikro-tubal özellikler üzerindeki etkisini ve bunların mikrotübül ile ilişkili proteinlerle etkileşimlerini belirlememize izin veren in vitro sulandırma deneyleri yapabiliriz.