Name: Tubulinin Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Keşfedin, polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri kullanarak kültür hücreleri veya fare beyinlerinden tübülin saflaştırma yöntemini. Bu protokol, belirli posttranslasyonel modifikasyonlara sahip saf, montaj yetenekli tübülin üretmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 ve Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 tarafından desteklenmiştir. CJ, Institut Curie tarafından desteklenmektedir, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) ANR-12-BSV2-0007 ve ANR-17-CE13-0021 ödüllerini, Institut National du Cancer (INCA) hibe 2014-PL BIO-11-ICR-1 ve Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) hibe DEQ20170336756. MMM, Fondation Vaincre Alzheimer hibeSI FR-16055p ve Fransa Alzheimer hibesi AAP SM 2019 n°2023 tarafından desteklenmektedir. JAS, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 675737 ve FRM hibe FDT201904008210 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı tarafından desteklenmiştir. SB, FRM hibesi FDT201805005465 tarafından desteklenmiştir.
Janke laboratuvarının tüm üyelerine, özellikle J. Souphron'a, G. Lakisic'e (Institut MICALIS, AgroParisTech) ve A. Gautreau'ya (Ecole Polytechnique) protokolün kurulması sırasında yardımları için teşekkür ederiz. Institut Curie hayvan tesisine fare yetiştiriciliği ve bakımı konusunda yardımları için teşekkür ederiz.
J. Frankel ve M. Nelson tarafından geliştirilen 12G10 antikor, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankası'ndan elde edildi.

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+Molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Margolis, R. L., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+end+assembly+and+disassembly+of+microtubules+at+steady+state+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro.</a> Cell. 13 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Borisy, G. G., Olmsted, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleated+assembly+of+microtubules+in+porcine+brain+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts.</a> Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).</li>
<li>Kirschner, M. W., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Supramolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The mechanism of microtubule assembly in vitro.</a> Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).</li>
<li>Baas, P. W., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooks+and+comets%3A+The+story+of+microtubule+polarity+orientation+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron.</a> Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).</li>
<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+motility+of+isolated+intracellular+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes.</a> Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).</li>
<li>Dogterom, M., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization in vitro.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+assembly+purification+of+microtubules+without+assembly-promoting+agents+and+further+purification+of+tubulin%2C+microtubule-associated+proteins%2C+and+MAP+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments.</a> Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Uchimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flipped+ion+pair+at+the+dynein-microtubule+interface+is+critical+for+dynein+motility+and+ATPase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).</li>
<li>Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structured+core+of+human+beta+tubulin+confers+isotype-specific+polymerization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties.</a> Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).</li>
<li>Vemu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+single-isoform+recombinant+neuronal+Human+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).</li>
<li>Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-tubulin+isotypes+can+regulate+microtubule+protofilament+number+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability.</a> Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).</li>
<li>Barisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+detyrosination+guides+chromosomes+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis.</a> Science. 348 (6236), 799-803 (2015).</li>
<li>Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tubulin+tyrosination+and+CLIP-170+phosphorylation+regulate+the+initiation+of+dynein-driven+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons.</a> Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).</li>
<li>Guedes-Dias, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+responds+to+local+microtubule+dynamics+to+target+synaptic+cargo+delivery+to+the+presynapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse.</a> Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+dynamic+protein+interactions+involving+human+microtubules+using+solid-state+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 18(2020).</li>
<li>Even, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAT1-enriched+vesicles+promote+microtubule+acetylation+via+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport.</a> Science Advances. 5 (12), 2705(2019).</li>
<li>Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+selective+promotion+of+tubulin+polymerization+by+alkali+metal+chlorides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides.</a> Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).</li>
<li>Magiera, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+tubulin+polyglutamylation+causes+neurodegeneration+and+perturbs+neuronal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport.</a> EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).</li>
<li>Lacroix, B., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+differentially+polyglutamylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of differentially polyglutamylated microtubules.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Magiera, M. M., Janke, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagiera%2C+MM+%22Methods+in+Cell+Biology+Vol.+115+Microtubules%2C+in+vitro%22">Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro</a>. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).</li>
<li>Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-+and+beta-tubulin+isotypes+are+differentially+expressed+during+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylase+enzymes+are+members+of+the+TTL+domain+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family.</a> Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).</li>
<li>Newton, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+slow+dynamic+instability+of+HeLa+cell+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).</li>
<li>Belvindrah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+alpha-tubulin+Tuba1a+leads+to+straighter+microtubules+and+perturbs+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration.</a> Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).</li>
<li>Breuss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+murine+homologue+of+TUBB5+cause+microcephaly+by+perturbing+cell+cycle+progression+and+inducing+p53+associated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis.</a> Development. , (2016).</li>
<li>Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal-specific+TUBB3+is+not+required+for+normal+neuronal+function+but+is+essential+for+timely+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration.</a> Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).</li>
<li>Morley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylated+tubulin+is+essential+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice.</a> Elife. 5, (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem, hücre çizgilerinden ve tek fare beyinlerinden orta-büyük miktarlarda hızlı bir şekilde yüksek kaliteli, montaj yetkin tubulin üretmek için bir platform sağlar. Uzun yıllardır sahada kullanılan sığır beyinlerinden tübulin saflaştırmanın altın standart protokolüne dayanmaktadır16,17. Yaklaşımın özel bir avantajı, kurulduktan sonra çok az uygulamalı zaman gerektirirken büyük miktarlarda hücre üreten HeLa S3 hücrelerinin süspansiyon kültürler...

Mikrotübüller birçok hücresel işlemde kritik roller oynar. Hücrelere şekillerini verirler, kromozom ayrımı için meiotik ve mitotik iğler oluştururlar ve hücre içi taşıma için izler görevi ederler. Bu farklı işlevleri yerine getirmek için mikrotübüller kendilerini farklı şekillerde düzenlerler. Alandaki merak uyandırıcı sorulardan biri, yapısal ve evrimsel olarak korunmuş mikrotübüllerin bu organizasyon ve işlev bolluğuna uyum sağlamasını sağlayan moleküler mekanizmaları anlamaktır. Potansiyel mekanizmalardan biri, 'tübulin kodu'1,2,3olarak bilinen kavram tarafından tanımlanan mikrotübüllerin çeşitlendirilmesidir. Tubulin kodu iki ana bileşen içerir: α ve β-tubulin gen ürünlerinin (tubulin izotipleri) mikrotübüllere ve tübulin posttranslational modifikasyonlara (PTM' ler) diferansiyel olarak dahil edildi.
1970'lerden bu yana, in vitro rekonstrüs deneyleri, gelişen ışık mikroskopi teknikleri ile birlikte, mikrotübüllerin özellikleri hakkında önemli keşiflerin önünü açmıştır: dinamik dengesizlik4 ve koşu bandı5ve diğer mekanizmaları ve işlevleri 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Şimdiye kadar yapılan hemen hemen tüm in vitro deneyler, tekrarlanan polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak beyin dokusundan saflaştırılmış tübulin bazlıdır16,17. Beyin dokusundan arınma, yüksek kaliteli tübulin elde etmenin avantajını büyük miktarlarda (genellikle gram miktarlar) sağlasa da, beyin dokusundan saflaştırılmış tübulin farklı tubulin izotiplerinin bir karışımı olduğu ve birçok tübulin PTM'si ile zenginleştirilmiş olması nedeniyle önemli bir dezavantaj heterojenliktir. Bu heterojenlik, mikrotübül özelliklerinin ve işlevlerinin kontrolünde belirli bir tübulin PTM'nin veya izotipin rolünü tanımlamayı imkansız kılar. Bu nedenle, tübulin kodunun moleküler mekanizmalarını ele almak için kontrollü tübulin PTM'leri ve homojen izotip bileşimi ile montaja yetkin tubulin üretmek esastır.
Son zamanlarda, maya Stu2p'in mikrotübül bağlayıcı TOG (tümör aşırı ekspresyonlu gen) etki alanını kullanarak tubulin'i benzeşim kromatografisi ile arındırmak için bir yaklaşım geliştirilmiştir18. Bu yöntemde, hücrelerin veya dokunun kabalyatlarındaki tübulin, matris immobilize TOG etki alanına bağlandığı bir sütundan geçirilir, bu da belirli bir, hatta çok küçük bir örneğin tüm tübulin havuzunun analizini sağlar. Rekombinant tübulin saflaştırmak için uzun zamandır beklenen bir yaklaşım da son yıllarda tanımlanmıştır. α ve β-tubulin genleri içeren iki cistronic vektörün böcek hücrelerinde ifade edildiği baculovirüs sistemine dayanmaktadır19. Bununla birlikte, bu yöntem çok hantal ve zaman alıcıdır ve bu nedenle çoğunlukla tubulin mutasyonları20 ve tubulin izotipleri21 , 22,23in vitro etkisini incelemek için kullanılır.
Mevcut protokolde, hücre çizgilerinden veya fare beyin dokusundan farklı modifikasyon seviyelerine sahip tübulin oluşturmak için köklü ve yaygın olarak kullanılan polimerizasyon-depolimerizasyon yaklaşımını kullanan bir yöntemi bir plan olarak tanımlıyoruz24. Bu prosedürde, tübulin çözünür (4 °C'de tübulin dimer) ve polimerize form (guanosin 5'-trifosfat [GTP] varlığında 30 °C'de mikrotübül) arasında döngüye girer. Her form ardışık santrifüjleme adımlarıyla ayrılır: tübulin dimerler soğuk (4 °C) bir dönüşten sonra süpernatanta kalırken, mikrotübüller 30 ° C'de peletlenecektir. Ayrıca, mikrotübül ilişkili proteinlerin mikrotübüllerden ve böylece son olarak saflaştırılmış tübulinden uzaklaştırılmasını sağlayan yüksek piperazin-N,N′-bis(2-etanesülfonic asit) (PIPES) konsantrasyonda bir polimerizasyon adımı gerçekleştirilir. Süspansiyon veya yapışık kültürler olarak yetiştirilen HeLa S3 hücrelerinden arındırılmış Tubulin, herhangi bir tübulin PTM'sinden neredeyse ücretsizdir ve son in vitro reconstitution deneylerindekullanılmıştır 25,26,27,28. Tubulin izotiplerinde ve PTM'lerde değişikliklerle çok sayıda fare modeli için kullanılabilecek tubulin'i tek fare beyinlerinden arındırma yöntemini daha da uyarladık.
Protokolde, ilk olarak kaynak materyalin (hücre kütlesi veya beyin dokusu), lizizinin(Şekil 1A)neslini ve ardından tübulini arındırmak için tübulin polimerizasyonu ve depolimerizasyonunun ardışık adımlarını açıklıyoruz (Şekil 1B). Saflaştırılmış tübulinin saflığını (Şekil 2A,B) ve miktarını (Şekil 3A,B) değerlendirmek için süreci daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Yöntem, tübulin saflaştırmadan önce hücrelerde bir modifiye enzimi aşırı ifade ederek seçilen bir PTM ile zenginleştirilmiş tübulin üretmek için uyarlanabilir (Şekil 4B). Alternatif olarak, saflaştırma işlemi sırasında tübulin modifiye edici enzimler tubulin eklenebilir. Son olarak, spesifik izotiplerden veya PTM'lerden yoksun tübulini, ilgili tübulin değiştirici enzimlerde eksik olan farelerin beyinlerinden arındırabiliriz (Şekil 4B)29.
Burada tarif ettiğimiz yöntemin iki temel avantajı vardır: (i) nispeten kısa sürede yeterince büyük miktarlarda tübulin üretimine izin verir ve (ii) spesifik tubulin izotip bileşimi veya PTM'leri ile yüksek kaliteli, saf tubulin üretir. Bu makalenin ilişkili videosunda, bu prosedürde yer alan bazı kritik adımları vurguluyoruz.

<table><tbody><tr><td>1&nbsp; M MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L hücre kültürü kapları</td><td>Techne F7610&nbsp;</td><td></td><td>Eğirme kültürleri için kullanılır. Boş döner şişelerini asla karıştırmayın. Döndürücü şişeler hücre kültürü inkübatöründeyken, ortamın inkübatörle dengelenmesini kolaylaştırmak için döner şişelerin yan valflerini her zaman hafifçe açık tutun. s atmosferi. Kullandıktan sonra, şişe duvarlarında kalan hücrelerin kurumasını önlemek için döner şişeleri hemen musluk suyuyla doldurun. Şişeleri deiyonize su ile yıkayın, yaklaşık 200 ml deiyonize su ekleyin ve otoklav yapın. Steril bir hücre kültürü başlığı altında suyu çıkarın ve şişelerin birkaç saat boyunca hala kaputun altında tamamen kurumasını bekleyin. Döner şişeleri temizlemek için asla deterjan kullanmayın, çünkü eser miktarda deterjan hücrelere zararlı olabilir.</td></tr><tr><td>1,5 ve 2 ml'lik</td><td></td><td></td><td></td>tüpler</tr><tr><td>14 ml'lik yuvarlak tabanlı tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm çapında steril kültür kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml'lik vidalı kapaklı tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-merkaptoetanol toksiktir ve kaputun altında kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>4-(2-aminoetil)-benzensülfonil florür&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#A8456 %40 Akrilamid&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td># 161-0140</td><td></td></tr><tr><td>5, 10- 20 ml şırıngalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml steril pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml vidalı kapaklı tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td> <td>Sigma</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-tubulin antikoru, 12G10&nbsp;</td><td>J. Frankel ve M. Nelson tarafından geliştirilen, Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edilen, NICHD'nin himayesinde geliştirilen ve Iowa</td><td></td> Üniversitesi tarafından <td>sürdürülen seyreltme: 1/500</td></tr><tr><td>Anti-glutamillenmiş tübülin antikoru, GT335 ve nbsp;</td><td>AdipoGen&nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td><td>seyreltme: 1 / 20.000</td></tr><tr><td>Aprotinin ve nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A1153</tr><tr><td>Terazi (0,1 &ndash; 10 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 1-l polipropilen şişeler&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Eğirme kültürlerini toplamak için</td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-26 XP santrifüj</td><td></td><td></td><td>Eğirme kültürlerini toplamak için</td></tr><tr><td>Biyolojik karıştırıcı&nbsp;</td><td>Techne MCS-104L&nbsp;</td><td></td><td>Hücre kültürü inkübatörüne (spinner kültürleri için), Hela S3 ve HEK 293 hücreleri için 25 rpm</td></tr><tr><td>Bis N,N'-Metilen-Bis-Akrilamid&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Blender IKA Ultra-Turrax&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Beyin dokusunu parçalamak için, makine 6 veya 7 gücüne ayarlıyken 5 mm'lik prob kullanın. Beyin dokusunu buz üzerinde 15 saniye boyunca 2-3 kez karıştırın.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A7906</tr><tr><td>Bromofenol mavisi&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td># 1.08122</td><td></td></tr><tr><td>Karboksipeptidaz A (CPA)</td> <td>Sigma</td><td>#C9268</td><td>Konsantrasyonu: 1.7 & nbsp; U/&mikro; l</td></tr><tr><td>Hücre kültürü davlumbazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü 37 ° C'de ayarlanmıştır; C,% 5 CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>&nbsp; Sigma&nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSO, diğer bileşiklerin hücre ve cilt geçirgenliğini artırabilir. Temastan kaçının ve cilt ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>DMEM ortamı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>DTT, DL-Ditiyotreitol&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#D9779</tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td><td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#E3889</tr><tr><td>Etanol mutlak&nbsp;</td><td>Fisher Kimya&nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#F7524</tr><tr><td>Fransız basınç hücresi presi&nbsp;</td><td>Termo elektron şirketi</td> <td>& nbsp; #FA-078A</td><td>, bir #FA-032 hücreli; büyük miktarlarda hücreleri parçalamak için. Orta orana ayarlayın ve 1.000 psi'lik gösterge basıncı (bozulma odasının içindeki 3.000 psi'ye karşılık gelir).</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>&nbsp; VWR Kimyasalları&nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#G8877</tr><tr><td>Isıtma bloğu&nbsp;</td><td>Stuart&nbsp;</td><td></td><td></td>#SBH130D</tr><tr><td>Hela hücreleri&nbsp;</td><td></td><td>ATCC&reg; CCL-2 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td>Hela S3 hücreleri&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-2.2 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl) VWR</td><td></td> <td># 20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Floresan ile hücre transfeksiyonu doğrulanacaksa</td></tr><tr><td>İzopropanol&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus&nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 rotor&nbsp;</td><td></td><td></td><td>İplikçi kültürleri toplamak için</td></tr><tr><td>KOH&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOH aşındırıcıdır ve yanıklara neden olur; göz ve cilt koruması kullanın.</td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>50 ml'lik tüpler için laboratuvar santrifüjü</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı azot ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro pipetler p2.5, p10, p20, p100, p200 ve p1000 ve karşılık gelen uçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropestles</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>Fare beyin dokusu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bu çalışma için hayvan bakımı ve kullanımı Avrupa Topluluğu'nun (2010/63/UE) tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel prosedürler, Institut Curie CEEA-IC #118 (Ulusal Otorite tarafından verilen yetki no. 04395.03) etik komitesi tarafından uluslararası yönergelere uygun olarak özel olarak onaylanmıştır.</td></tr><tr><td>İğneler 18G x 1 & frac12; &rdquo; (1,2 X 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 20G x 1 & frac12; &rdquo; (0,9 X 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>İğneler 21G x 4 &frac34; &rdquo; (0,8 X 120 mm</td><td>B.Braun</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pH-metre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>#P7626</td><td>PMSF tozu tehlikelidir. PMSF solüsyonlarını hazırlarken cilt ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>BORULAR&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#P6757</tr><tr><td>Pipet Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotorları</td><td>Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; ve TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE elektroforez ekipmanı&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>#1658001FC</tr><tr><td>SDS, Sodyum dodesil sülfat&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#442444H</td><td>Laemmeli tamponu hazırlamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS, Sodyum dodesil sülfat&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#L5750</td><td>'TUB' SDS-PAGE jelleri hazırlamak için</td></tr><tr><td>Sonicator&nbsp;</td><td>Branson</td> <td># 101-148-070</td><td>Yapışık kültürler olarak yetiştirilen hücreleri parçalamak için kullanılır. 6,5 mm çapında prob kullanın, sonikatörü " konumuna getirin Çıkış kontrolü" 1, " Görev döngüsü" Kullanılan hücre tipine bağlı olarak %10 ve zaman.</td></tr><tr><td>1.5 ml tüpler için masa üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED, N, N, N&prime;, N&prime;-Tetrametiletilendiamin&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td># 9281</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A (TSA)</td> <td>Sigma</td><td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ve nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#T9284</tr><tr><td>Trizma tabanı (Tris)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#T1503</tr><tr><td>Tripsin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj rotorları&nbsp;</td><td></td><td>TLA-55, TLA-100.3 ve 70.1 Ti rotorlar</td><td>4 derece olarak ayarlanmış; C veya 30&deg; Deneyin ihtiyacına göre C&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Beckman</td><td>#357448&nbsp;</td><td>TLA-55 rotor ile kullanım için</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>TLA-100.3 rotorlu</td>Ultrasantrifüj tüpleri ile kullanım için <td>Beckman</td> <td># 349622</td></tr><tr><td>&</td><td>Beckman</td><td>#355631&nbsp;</td><td>70.1 Ti rotor ile kullanım için</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüjler</td><td>Beckman</td><td>Optima L80-XP (veya eşdeğeri) ve Optima MAX-XP (veya eşdeğeri)</td> <td>4 derece olarak ayarlayın; C veya 30&deg; Deneyin ihtiyacına göre C&nbsp;</td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şamandıralar veya tüp tutucular</td><td></td><td></td> ile donatılmış su banyosu <td>30 ° C'ye ayarlayın; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

tubulin'in kontrollü posttranslational modifikasyonlar ve sınırlı kaynaklardan İzotiplerle polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri ile saflaştırılması

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Mikrotübül sitoskeleton çalışmalarının önemli bir yönü, in vitro rekonseptüs deneylerinde mikrotübül davranışının araştırılmasıdır. Dinamikler gibi mikrotübüllerin içsel özelliklerinin ve mikrotübül ilişkili proteinlerle (VIP' ler) etkileşimlerinin analizine izin verirler. "Tübulin kodu", mikrotübül özelliklerinin ve işlevlerinin düzenleyicileri olarak farklı tubulin izotiplerine ve çeşitli posttranslational değişikliklere (PTM' ler) işaret eden gelişmekte olan bir kavramdır. Tübulin kodunun moleküler mekanizmalarını keşfetmek için, belirli izotiplere ve PTM'lere sahip saflaştırılmış tubulin kullanarak in vitro rekonste deneyleri yapmak çok önemlidir.
Bugüne kadar, in vitro deneylerde yaygın olarak kullanılan, birçok PTM'yi barındıran ve tanımlanmış bir izotip bileşimine sahip olan beyin tübulini teknik olarak zordu. Bu nedenle, tübulini farklı kaynaklardan ve farklı izotip bileşimleri ve kontrollü PTM'lerden arındırmak için, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngülerinin klasik yaklaşımını kullanarak bu protokolü geliştirdik. Benzeşim saflaştırmasına dayanan mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım saf, polimerizasyona yetkin tübulin verir, çünkü polimerizasyona veya depolimerizasyona dirençli tübulin ardışık saflaştırma adımları sırasında atılır.
Tübulinin hücre çizgilerinden arındırılmasını, süspansiyonda veya bağlı kültürler olarak ve tek fare beyinlerinden tanımlarız. Yöntem ilk olarak hem süspansiyon hem de yapışık ayarlarda hücre kütlesinin neslini, lizis adımını, ardından polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri ile tübulin saflaştırmanın ardışık aşamalarını açıklar. Yöntemimiz, tübulin kodunun mikrotübüllerin içsel özellikleri ve ilişkili proteinlerle mikrotübül etkileşimleri üzerindeki etkisini ele alan deneylerde kullanılabilecek tübulin verir.

Bu yöntemin temel amacı, saflaştırılmış bileşenlerle tekrarlanan in vitro deneyler yapmak için yeterli miktarlarda yüksek kaliteli, montaja yetkin tubulin üretmektir. Bu tübulinden monte edilen mikrotübüller, dinamik veya kararlı mikrotübüller ile toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tekniğine dayalı rekonstrüt tahlillerinde, mikrotübül dinamiklerini test eden deneylerde, MAP'ler veya moleküler motorlarla etkileşimlerde ve motorlar tarafından kuvvet üretiminde kullanılabilir25. Ayrıca mikr...

Bu protokol, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak kültürlü hücreler veya tek fare beyinleri gibi küçük/orta ölçekli kaynaklardan tübulin saflaştırmayı açıklar. Saflaştırılmış tubulin belirli izotiplerde zenginleştirilmiştir veya spesifik posttranslational modifikasyonlara sahiptir ve mikrotübül dinamiklerini ve etkileşimlerini incelemek için in vitro rekonsiyel testlerinde kullanılabilir.

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Bu yöntem, tüm in vitro deney setlerini gerçekleştirmek için yeterli miktarlarda tanımlanmış translasyon sonrası modifikasyonlarla saf montaja yetkin tübülin üretilmesine izin verir. Tübülin polimerizasyonu ve de-polimerizasyon döngülerine dayanan bu protokolün herhangi bir hücre biyolojisi laboratuvarında gerçekleştirilmesi kolaydır. Çok az uygulama süresi ile iyi miktarlarda tübülin üretilmesine izin verir.Tübülini süspansiyon kültürlerinden saflaştırmak için, tübülin hazırlığından dokuz gün önce, altı birleşik 15 santimetrelik tabak elde etmek için istenen hücre tipini canlandırın ve çoğaltın. Tübülin hazırlığından sekiz gün önce, bir hücre kültürü dolabının altındaki her tabak başına her eğirici şişeye bir litre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve döndürücüleri hücre kültürü inkübatörünün içindeki bir karıştırma masasına yerleştirin. Ortamın inkübatörün atmosferine dengelenmesini sağlamak için yanal döndürücü kapakları hafifçe açık bırakın.Ertesi gün, döner şişeleri aşılamak için birleşen bulaşıklardaki hücreleri kullanın. Döner şişeleri, yanal valfler hafifçe açık olacak şekilde bir hafta boyunca inkübatöre geri koyun. Hücreleri hasat etmek için, kültürleri döndürücü şişelerden bir litrelik santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Her peleti 10 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri dört santigrat derecede santrifüjleme için 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. 10 mililitrelik bir hücre peleti için, pelete 10 mililitre lizis tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Tübülini yapışık hücre kültürlerinden saflaştırmak için, tübülin hazırlama gününde 10 birleşik 15 santimetrelik tabak elde etmek için istenen hücre tipini canlandırın ve çoğaltın.Yapışık hücreleri hasat etmek için, bir seferde üç tabağı muamele ederek, ikinci bir kişi hücreleri yedi mililitre PBS-EDTA ile nazikçe yıkarken, ortamı çıkarmak için kültür kaplarını eğin. Yıkamadan sonra, ikinci kişi, üçüncü bir kişinin hücreleri tabağın bir kenarına nazikçe itmek için bir hücre kaldırıcı kullanmasını sağlamadan önce, hücreleri tabak başına beş mililitre PBS-EDTA ile tedavi etmelidir. Hücreler ayrıldığında, hücreleri her üç tabaktan da buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve kalan hücreleri toplamak için her plakayı iki mililitre PBS-EDTA ile durulayın.Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, hücre peletinin hacmini belirlemek için süpernatanı atın. Lizis tamponunu ekleyin, hücreleri yeniden askıya alın ve bunları 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Hücreleri yaklaşık 45 darbe için sonikasyon.Fare beyni lizisi için, yetişkin bir fareden toplanan tek bir beyne 500 mikrolitre lisanslı tampon ekleyin ve dokuyu parçalamak için bir doku karıştırıcı kullanın. Lizatı hacminin 1 / 100'ünde eşit hacimde 2X Laemmli tamponuna elde ettikten sonra, çözeltiyi beş dakika kaynatın. Miktar tayinine kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.Tübülin hazırlığının her adımında bu şekilde bir numune toplayın. Lizatı berraklaştırmak için, numuneyi santrifüjleyin ve üst yüzer tabakadan kaçınmaya dikkat ederek berrak süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarmak için uzun bir iğne kullanın. Lizat arıtmasından sonra, süpernatant içindeki yüzen malzemenin çıkarılması önemlidir, aksi takdirde tübülin saflaştırmasının verimliliğini olumsuz yönde etkileyebilir.Arıtılmış lizattan tübülini polimerize etmek için, süpernatan olanın tüm hacmini 1/200 ile karıştırınth hacmi 0.2 molar GTP ve uygun boyutta bir tüpte yarım hacim ılık gliserol ile. Karışımı nazikçe pipetleyin, hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin. Tüpleri parafilm ile kapatın ve 20 dakika boyunca 30 santigrat derece su banyosuna koyun.Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Pelet ikide bulunan mikrotübülleri depolimerize etmek için, peleti buz gibi soğuk BRB 80'de buz üzerinde beş dakika boyunca yeniden süspanse edin. Numuneyi önce bir P1000 pipetiyle, ardından bir P200 pipetiyle, her beş dakikada bir, 20 dakika boyunca buz üzerinde pipetleyin.Numune homojen hale geldiğinde, santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Mikrotübül ile ilişkili proteinleri tübülinden çıkarmak için, süpernatan üçlünün tüm hacmini eşit hacimde önceden ısıtılmış bir molar boru S, aynı hacimde önceden ısıtılmış gliserol ve 1/100 hacim 0.2 molar GTP ile karıştırın. Santrifüjlemeden önce karışımı 30 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.Mikrotübül ile ilişkili protein içeren süpernatan dördü yeni bir tüpe aktarın, pelet polimerize mikrotübüller içerir. Üçüncü bir polimerizasyon ve depolimerizasyon gerçekleştirildikten sonra, hasat edilen tübülin miktarı SDS sayfa analizi ile ölçülebilir. Saflaştırma işleminin başarısı, Coomassie lekeli bir SDS sayfasında teyit edilebilir.Saflaştırılmış tübülinin beklenenden daha düşük bir verimi, ikinci, dördüncü ve altıncı pelet fraksiyonlarında daha düşük tübülin miktarı ve ikinci, dördüncü ve altıncı süpernatan fraksiyonlarında daha yüksek miktar ile kanıtlandığı gibi verimsiz bir tübülin polimerizasyonundan kaynaklanabilir. Saflaştırılmış tübülini ölçmek için, numuneler bilinen miktarlarda sığır serum albümininin yanında çalıştırılabilir. Protein bantlarının kantitatif dansitometrisi daha sonra saflaştırılmış tübülin miktarının hesaplanmasına izin verir.Tübülinin modifikasyon durumu, numunelerin immüno-blot analizi ile doğrulanabilir. Protokolümüz, kontrollü translasyon sonrası modifikasyonlarla tübülinin izolasyonuna izin verir. Bu tübülin ile, tübülin modifikasyonlarının mikro-tubal özellikler üzerindeki etkisini ve bunların mikrotübül ile ilişkili proteinlerle etkileşimlerini belirlememize izin veren in vitro sulandırma deneyleri yapabiliriz.

purification-tubulin-with-controlled-posttranslational-modifications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.

Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Bu makalede, basit, yenilikçi bir ikinci harmonik nesil mikroskopi yaklaşımı ile bir tübülinopati modelinde mikrotübül yüklü oligodendrositleri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

Burada, protein hazırlama ve yapım ve aktif nematik hapsetme için kuyuların kullanımı da dahil olmak üzere mikrotübüllerden ve kinesin motorlarından aktif nematiklerin hazırlanması için yöntemler sunulmaktadır.

Mikrotübül Tabanlı Aktif Nematiklerin Oluşturulması, Sınırlandırılması ve Gözlemlenmesi

Bu protokol, küçük ölçekli enstrümantasyon için optimize edilmiş domuz beyninden tübülinin yüksek verimli izolasyonu için bir tekniği açıklar. İzolasyon prosedürleri, ko-sedimantasyon deneyleri ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak in vitro olarak tübülin polimerizasyon aktivitesinin belirlenmesi için prosedürlerle tamamlanmaktadır.

Domuz Beyin Dokusundan Tübülin Veriminin Optimize Edilmesi

Burada, spesifik bir modifikasyon için zenginleştirilmiş mikrotübüller elde etmek için spesifik mikrotübül modifiye edici enzimlerden yoksun veya içerebilen memeli hücrelerinden endojen tübülin çıkarmak için bir protokol tarif ediyoruz. Daha sonra, ekstrakte edilen mikrotübüllerin, kriyo-elektron mikroskobu için ızgaralar hazırlamak üzere saflaştırılmış mikrotübül bağlayıcı proteinlerle nasıl dekore edilebileceğini açıklıyoruz.

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Keşfedin, polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri kullanarak kültür hücreleri veya fare beyinlerinden tübülin saflaştırma yöntemini. Bu protokol, belirli posttranslasyonel modifikasyonlara sahip saf, montaj yetenekli tübülin üretmeyi sağlar.

Tubulinin Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet