Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Bu teknik, araştırmacıların yüzlerce bireysel sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacimlerini karşılaştırmak için beslemelerine ve tek başlarına yüksek verimli ölçümler yapmalarına olanak tanır. Yemeğin içeriğini değiştirmek veya farklı deney grupları tarafından tüketilen hacmi karşılaştırmak için uyarlanabilir olabilir. Bu protokolün kullanıcı dostu ve düşük maliyetli olması amaçlanmıştır.

Farmakolojik ve genetik manipülasyonlar için, sivrisinek kanıyla beslenmeyi ve sel sonrası beslenme davranışını incelemek. Organizasyon bu protokol için kritik öneme sahiptir. Kurulumu ve reaktifleri önceden hazırlayın, böylece yemekleri sivrisineklere hızlı bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Başlamak için, 1.98 ila iki mililitre defibrine koyun kanını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Yemek boyutunun floresan bazlı miktar tayini yapılıyorsa, floresein çözeltisini% 0.002'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, kan hacmini eklenen floresein ile aynı miktarda azaltın. Referans standart eğrisini oluşturmak için son yemek formülasyonunun bir mililitresini saklayın.

Floresein içeren tüm yemekler ve solüsyonlar alüminyum folyoya sarılmalı veya karanlıkta tutulmalıdır. Proteinsiz tuzlu yemekler hazırlamak için, 600 mikrolitre 400 milimolar sodyum bikarbonatı 15 mililitrelik konik bir tüpte 1.39 mililitre çift damıtılmış su ile birleştirin. Yemek boyutunun floresan bazlı miktar tayini daha sonra gerçekleştirilecekse, floresein çözeltisini% 0.002'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.

Referans standart eğrisini oluşturmak için% 0.002 floresein içeren son yemek formülasyonunun en az bir mililitresini saklayın. Hazırlanan yemekleri teslim etmeye hazır olana kadar bir kenara koyun. Floresein içeren tüm yemekler ve solüsyonlar alüminyum folyoya sarılmalı veya karanlıkta tutulmalıdır.

Deney dişi sivrisinek grubunu bir kabın içine yerleştirin ve üzerlerini ağ ile örtün. Bu dişilerin beslenme odasına alışmasına izin verin. Yemek verilmeyecek olan beslenmemiş sivrisineklerden oluşan bir kontrol grubunu bir kenara koyun.

Bir GLI tüpü oluşturmak için 50 mililitrelik konik bir tüpü 40 mililitre% 100gliserol ile doldurun. Sızıntı olasılığını en aza indirmek için açık konik boruyu iki parça parafilm ile kapatın. İsteğe bağlı olarak, parafilmi lastik bantlar kullanarak yerinde tutun.

Delik veya boşluk olmadığından emin olmak için tüpü ters çevirin. Yemek dağıtım cihazını oluşturmak için, keskin bir tıraş bıçağı veya bir lave kullanarak konik tüpün vidalı kapağında ortalanmış 2,5 santimetrelik bir delik açın. Bir parça parafilmi eşit şekilde gerin, böylece kabaca iki katına çıkar.

Parafilm, sivrisineklerin kolayca delebileceği kadar ince olmalı, ancak sızıntı olmamalıdır. Deliği tamamen kapatmak için vidalı kapağın dış yüzeyini parafilm ile kapatın ve kapağı bir kenara koyun. Hem kapalı gliserol tüpünü hem de kan ve tuzlu yemekleri ve 42 ila 45 santigrat derece su banyosunu en az 15 dakika ısıtın.

Isıtılmış yemeğe ATP ekleyin ve iyice girdaplayın. Isıtılmış yemekten iki mililitreyi vidalı kapağın iç haznesine pipetleyin ve ters ısıtılmış gliserol dolgulu konik tüpü yavaşça üzerine yerleştirin. Kısmen, yemekle birlikte kapağı, yemeğin veya gliserolün sızmasını önleyecek kadar gliserol dolu tüpe vidalayın.

Monte edilmiş gly tüpünü sivrisinek kabının üzerine yerleştirin, karbondioksit uygulayın ve maksimum besleme oranlarına ulaşmak için sivrisineklerin en az 15 dakika beslenmesine izin verin. Beslemeden sonra, GLI tüp kapağı biyolojik tehlike atığı olarak atılabilir veya düşük yüzdeli bir ağartıcı solüsyonuna batırıldıktan ve suda iyice durulandıktan sonra yeniden kullanılabilir. Bir referans standart eğrisi oluşturmak için, deney sivrisinek grubuna sunulan% 0.002 floresein içeren aynı yemeğin seri bir seyreltmesini hazırlayın.

Standart eğrinin ilk çözümünü yapmak için, 950 mikrolitre PBS'ye% 0.002 floresein içeren 50 mikrolitre yemek ekleyin ve iyice girdaplayın. Standart eğri çözeltilerinin geri kalanı için iki kat seyreltme gerçekleştirin ve her seyreltmeden önce iyice girdap yapın. Standart eğri çözeltilerinin her birinden 100 mikrolitreyi, 96 oyuklu bir PCR plakasının ilk sütunundaki sekiz oyuğun her birine pipetleyin.

Aynı sekiz kuyucuğun her birine anestezi uygulanmış veya donmuş beslenmemiş kontrol sivrisineği ekleyin. Tekrarlanan bir ölçüm için plakanın ikinci sütununda tekrarlayın. Beslenmemiş kontrol ve deney grupları için kalan her kuyuya 100 mikrolitre PBS ekleyin.

Negatif bir kontrol olarak, plakanın sonraki iki sütunundaki her bir oyuğa beslenmemiş bir sivrisinek ekleyin. Yemek sunulan deney gruplarından kalan kuyucuklara kuyu başına bir sivrisinek ekleyin. Boncuk değirmeni homojenizatörü ile dokuyu bozuyorsanız, her kuyucuğa üç milimetre borosilikat katı cam boncuk ekleyin.

Plakayı dikkatlice kapatın ve dokuyu bozun, ardından lizatı toplamak için plakayı 2000 RPM'de bir ila iki dakika santrifüjleyin. Her kuyucukta 180 mikrolitre PBS bulunan 96 oyuklu siyah bir plaka hazırlayın. Daha sonra, her bir kuyucuğa 20 mikrolitre lizat ekleyin ve karıştırın.

485 uyarma ve 520 emisyon kanalına sahip bir plaka okuyucu kullanarak floresein yoğunluğunu ölçün. Bilinen yemek hacmini karşılık gelen floresan yoğunluğu ölçümüne göre çizerek referans standart eğrisini oluşturun. Oluşturulan referans standart eğriyi kullanarak, deney grubu sivrisineklerinin her biri tarafından yutulan yemek hacmini tahmin edin.

Temel doku otofloresansını düzeltmek için beslenmemiş negatif kontrol grubunun ortalama floresan yoğunluğu okumasını, her bir deney grubu bireyinin floresan yoğunluğu okumasından çıkarın. Bir kan besleme deneyinden floresein yemek boyutunu ölçmek için, beslenmemiş bir sivrisinek ve% 0.002 floresein içeren bilinen bir yemek hacmini içeren belirlenmiş referans kuyularından floresan okumaları çizilerek standart bir eğri oluşturuldu. Beslenmeyen negatif kontrol grubundan sivrisinekler içeren kalan kuyulardan veya bir yemek sunulan deney sivrisinek grubundan elde edilen Floresan Okumaları, tüketilen yemek hacmini ölçmek için bu standart eğri ile karşılaştırılır.

Deney grubundaki tüm dişilere kan yemeği verilmesine rağmen, bazı sivrisinekler beslendi, bazıları beslenmedi. Bu protokol, çeşitli protein bileşimlerine sahip yemekleri iletmek ve miktarını belirlemek için kullanılabilir. Florisin eklenmiş yemekler kullanılarak toplanan veriler burada gösterilmektedir.

Sivrisineklerin florisin içermeyen yemekler sunulduktan sonra gözle beslenen veya beslenmeyenler olarak puanlandığı bağımsız bir deney de yapıldı. Bu protokol, sivrisinek konakçılarının arama davranışını düzenleyen ilaçlarla tüketilen öğün hacmini belirlemek için kullanıldı. Bu deneylerde, dişilere bir insan NPY iki reseptör agonisti ile tuzlu bir ATP yemeği önerildi.

Bu teknik aynı zamanda, gly tüpünü %0.002 floresein içeren %10 sakaroz ile doyurulmuş bir pamuk topuyla değiştirerek nektar besleme davranışını ölçmek için de kullanıldı ve grup ağırlığı ölçümlerinden doğru bir şekilde ayırt edilemeyen daha küçük veya daha değişken yemek boyutlarını ölçmek için kullanılabileceğini gösterdi. Bu protokolü gerçekleştirirken dikkat edilmesi gereken en önemli şey, numuneleri etkinlikler halinde düzenlemek ve standart eğriyi oluşturmak için beslenmemiş sivrisinekleri ve her öğünden bir ML'yi bir kenara bırakmaktır. Bu prosedürü takiben, hayvanların kanla beslendikten sonraki davranışları gözlemlenebilir ve sindirim izlenebilir.

Bu yöntem, araştırmacıların genetiği değiştirilmiş sivrisineklerde yemek tüketimindeki değişiklikleri değerlendirmelerine olanak tanır. Ayrıca, ilaçları sivrisineklere vermek ve davranış üzerindeki etkilerini test etmek için basit, hızlı ve invaziv olmayan bir yol sağlar.