PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Triptofan sentaz enzimini Salmonella typhimurium'dan saflaştırmak için kullanılan bu protokol hızlı, basit ve kısadır. Amonyak sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisi, vahşi tip ve mutant triptofan sentaz kompleksinin tek bir günde saflaştırılmasını mümkün kılar. Bu teknik, diğer ilgili proteinleri saflaştırmak için uygulanabilir, çünkü amonyak sülfat fraksiyonlaması ve boyut dışlama kromatografisi, etiketlenmemiş proteinleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılır.

Başlamak için, 10 saniyelik darbeler ve 20 saniyelik dinlenmeler kullanarak 20 döngü boyunca% 80 genlikte bir buzlu su banyosunda sonikasyon yaparak hücre peletini bozun. Hücre lizatını 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca 30.000 kez g'de santrifüjleyin ve peleti yerinden çıkarmadan süpernatanı aspire edin. Arıtılmış süpernatan fraksiyonu oda sıcaklığında 0.45 mikrometrelik bir filtre ile filtreleyin.

% 20 doygunluğa ulaşılana kadar süzüntüye yavaşça az miktarda amonyum sülfat ekleyin. Amonyum sülfat fraksiyonlamasını 25 santigrat derecede gerçekleştirin ve kabarcıkları önlemeye dikkat ederek çözeltiyi 10 dakika hafifçe karıştırın. Çözeltiyi tekrar 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı daha fazla kullanım için temiz bir şişeye aktarın.

Peleti 20 mililitre numune tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve SDS-PAGE'i çalıştırmak için bir numune hazırlayın. % 30 doygunluğa ulaşılana kadar süpernatanıma amonyum sülfat ekleyin ve kabarcıklardan kaçınarak çözeltiyi karıştırın. Çözeltiyi tekrar 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı daha fazla kullanım için temiz bir şişeye aktarın.

Elde edilen %40 pelet fraksiyonunu 10 mililitre numune tamponu ikide nazikçe yeniden süspanse edin ve SDS-PAGE'i çalıştırmak için bir numune hazırlayın. Daha sonra% 40 protein örneğini dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 10.000 kez g'de mikrosantrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı, dakikada 0.5 mililitre akış hızında hızlı bir protein sıvı kromatografi cihazına bağlı önceden dengelenmiş bir HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR kolonuna yükleyin. Toplanan tepe fraksiyonlarını ve amonyum sülfat fraksiyonlarını, Coomassie parlak mavisi ile boyanmış %12'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde değerlendirin.

Yabani tip veya mutant alfa-iki beta-iki Salmonella typhimurium triptofan sentaz kompleksini 100 kilodaltonluk bir santrifüj filtre ile 3.000 kez g'de dört santigrat derecede döndürerek konsantre edin. Konsantre proteini iki mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve agregaları çıkarmak için tekrar 10.000 kez g'de dört derecede 10 dakika santrifüjleyin. Numunenin protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, mililitre başına 20 ila 25 miligramda 0.5 mililitre alikot hazırlayın.

Flaş onları sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 derecede saklayın. Suda 200 milimolar spermin içeren beş mililitrelik bir stok çözeltisi hazırlayın ve eksi 20 derecede 500 mikrolitrelik alikotlarda saklayın. Daha sonra suda% 30 polietilen glikol 8.000 içeren 50 mililitrelik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 25 mililitreyi 25 santigrat derecede 50 mililitrelik tek kullanımlık bir santrifüj konik şişede tutun.

Her biri suda olmak üzere 25 mililitrelik bir molar sezyum klorür ve sodyum klorür stok çözeltileri hazırlayın ve bunları 25 santigrat derecede tutun. Üç set 50 mililitrelik tek molar bicine stok çözeltisi hazırlayın ve pH 7.6, 7.8 ve sekizde tamponlu çözeltiler elde etmek için sezyum hidroksit veya sodyum hidroksit ile titre edin. Çözeltilerin 25 mililitrelik alikotlarını dört santigrat derecede tutun.

Bir buz banyosunda alfa-iki beta-iki Salmonella typhimurium triptofan sentaz kompleksi örneğini çözün. Daha sonra 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de mikrosantrifüj edin. Berrak süpernatan fraksiyonu temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.

Süpernatantın protein konsantrasyonunu tahmin edin ve alikotları, 50 milimolar sezyum veya sodyum klorür içeren pH 7.8'lik 50 milimolar bicine sezyum hidroksit veya bicine sodyum hidroksit ile mililitre başına 15 miligrama seyreltin. Steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde üç adet 24 oyuklu oturma damla plakası için 500 mikrolitre rezervuar çözeltisi hazırlayın. PEG 8, 000 ve spermin konsantrasyonunu değiştirin ve her set için metin el yazmasında açıklandığı gibi tampon pH'ını değiştirin.

Tüpleri kapatın ve hava kabarcıklarını gidermek için 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüjlemeden önce 10 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Her rezervuarda bu çözeltiden 500 mikrolitre dağıtın. Bir P-10 mikropipet kullanarak her bir oturma damlasına litre başına 15 mikrogram beş mikrolitre protein çözeltisi dağıtın.

Daha sonra, protein damlasına karşılık gelen her bir rezervuar çözeltisinden beş mikrolitre ekleyin. Karıştırma sırasında hava kabarcıklarından kaçının ve yukarı ve aşağı pipetlemeyin. Son olarak, plakayı şeffaf yapışkan bantla örtün ve 25 derecede saklayın.

Kristaller iki ila beş gün içinde ortaya çıkar ve iki hafta içinde tam boyutlarına ulaşır. Bu protokol, Salmonella typhimurium triptofan sentazın alfa alt birimini ve beta alt birimini modifiye pET SUMO vektörüne alt klonlamak için kullanıldı. His6-SUMO-alfa ve His6-SUMO-beta triptofan sentaz füzyon proteinine karşılık gelen iki güçlü bandın temsili SDS-PAGE sonuçları burada gösterilmektedir.

Her protein, nikel-nitrilotriasetik asit afinite kromatografisi ve amonyum sülfat çökeltme ile saflaştırıldı, ardından His-SUMO-etiket bölünmesi, His-SUMO-etiket izlerinin çıkarılması ve protein konsantrasyonu ölçümü yapıldı. SEC üzerindeki alfa alt biriminin, beta alt biriminin ve alfa-iki beta-iki Salmonella typhimurium triptofan sentaz kompleksinin elüsyon profili ve bunların tepe fraksiyonlarının saflığı burada gösterilmektedir. Triptofan sentaz kompleksinin mutant formlarını ürettikten sonra, kirletici proteinleri heterolog ekspresyon sisteminden çıkarmak için amonyum sülfat fraksiyonlaması kullanıldı.

Alfa-iki beta-iki Salmonella typhimurium triptofan sentaz kompleksinin bir dışlama kromatografisi sütunu üzerinde göreceli bir elüsyon pozisyonuna sahip temsili bir elüsyon profili burada gösterilmektedir. Dışlanan tepe fraksiyonlarının saflığı, havuzlamadan önce SDS-PAGE kullanılarak analiz edildi. Büyük tek kristaller, değişen PEG 8.000 ve spermin konsantrasyonları ve bizin tampon pH'ı ile ince bir kristalizasyon optimizasyonu yoluyla elde edildi.

Farklı morfolojilere sahip kristaller iki ila beş gün içinde ortaya çıktı ve iki hafta içinde tam boyuta ulaştı. Yabani tip alfa-iki beta-iki Salmonella typhimurium triptofan sentaz kompleksinin kristal yapısı için elektron yoğunluğu haritalarının doğrulanması, kristal yapı rafine edilmesinden sonra aydınlatıldı. Bu protokolü gerçekleştirirken, triptofan sentaz aktivite kaybını önlemek için ilk saflaştırma adımlarını mümkün olan en kısa sürede oda sıcaklığında tamamlayın.

Mutantların kristal yapılarının, L-triptofan sentezindeki anahtar kalıntıların oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni bilgiler sağlaması bekleniyor.