Name: Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, membran proteinlerini deterjan kullanmadan hücre dışı sentezleme ve önceden oluşturulmuş nanodisklere ko-translasyonel yerleştirme yöntemini. Bu protokol, yapısal çalışmalar ve antikor üretimi için güçlü bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibesi BE1911/8-1'e, LOEWE projesi GLUE'ya ve işbirlikçi araştırma merkezi Transport and Communication across Membranes'a (SFB807) finansal destek için teşekkür ederiz.

<ol><li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li>
<li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li>
<li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li>
<li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li>
<li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li>
<li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+expression%3A+no+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li>
<li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters%2C+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li>
<li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein%2C+forming+soluble+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors%3A+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li>
<li>Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor%2Fnanodisc+complexes+with+different+lipid+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li>
<li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li>
<li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li>
<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li>
<li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li>
<li>Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li>
<li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li>
<li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li>
<li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li>
<li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li>
<li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li>
<li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E.+coli+S30+lysate+proteome%3A+A+prototype+for+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li>
<li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li>
<li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4%3A+Linkages+in+substrate+binding%2C+spin+state%2C+uncoupling%2C+and+product+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li>
<li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li>
<li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes%3A+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

CF ekspresyonunu optimize etmek için kurulum ve stratejiler ve fonksiyonel milletvekillerinin nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi açıklanmaktadır. Gerekli ekipman bir biyoreaktör, bir Fransız pres cihazı veya benzeri, bir UV / VIS ve floresan okuyucu, iki bölmeli bir konfigürasyon kurulumu için uygun CF reaksiyon kapları ve sıcaklık kontrollü bir inkübatörden oluşur. Diğer standart ekipmanlar, E. coli hücrelerinin toplanması için santrifüjlerin yanı sıra S30 lizatlarının hazırlanması i...

Membran proteinleri (MPS), sulu ortamlarda çözünmemeleri nedeniyle protein üretim çalışmalarında zorlu hedeflerdir. Geleneksel MP üretim platformları, E. coli, maya veya ökaryotik hücreler gibi hücre tabanlı sistemlerden oluşur. Sentezlenen rekombinant milletvekilleri ya hücre zarlarından ekstrakte edilir ya da inklüzyon cisimciklerinden yeniden katlanır1. Deterjan çözünürlüğünden sonra milletvekilleri, in vitro sulandırma protokolleri oluşturularak uygun membran ortamlarına aktarılabilir. Veziküller ve lipozomların yanı sıra, nanodiskler2 veya salipro3 parçacıkları şeklinde düzlemsel membranlara MP resuentasyonu son zamanlarda rutin teknikler haline gelmiştir. Bununla birlikte, tüm bu stratejiler, milletvekilleriyle deterjan temasının istikrarsızlaşmaya, oligomerlerin ayrışmasına ve hatta protein yapısının ve aktivitesinin kaybına neden olabileceği anlamınagelir 4. Bu nedenle optimum deterjan çözünürlüğü ve sulandırma koşullarının taranması sıkıcı ve zaman alıcı olabilir5.
Hücresiz (CF) sistemlerin açık doğası, ekspresyon reaksiyonunun, tanımlanmış bir lipit bileşimine sahip önceden oluşturulmuş membranlarla doğrudan sağlanmasını sağlar. Bu lipit bazlı ekspresyon modunda (L-CF), sentezlenmiş milletvekilleri, sağlanan çift katmanlı 6,7'ye birlikte translasyonel olarak ekleme fırsatına sahiptir (Şekil 1). Düzlemsel lipid çift katmanlı disk8'i çevreleyen bir membran iskele proteininden (MSP) oluşan nanodiskler, bu strateji 9,10 için özellikle uygun görünmektedir. Nanodiskler rutin olarak çeşitli farklı lipitlerle in vitro olarak monte edilebilir, çok kararlıdırlar ve stoklar 1 mM'ye kadar konsantre edilebilir. Bununla birlikte, E. coli'de MSP ekspresyonu ve saflaştırılması gereklidir. Alternatif bir strateji olarak MSP, lipozomlarla beslenen KF reaksiyonlarında hedef MP ile birlikte eksprese edilebilir11,12,13. Hem MSP hem de MP için DNA şablonları reaksiyona eklenir ve ifade üzerine MP / nanodiskler oluşabilir. MSP üretiminden kaçınılırken, birlikte ekspresyon stratejisi, nihai DNA şablon konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ince ayarlanmasını gerektirir ve numune üretiminin verimliliğinde daha yüksek varyasyonlar beklenebilir.
Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklerin zarlarına ko-translasyonel olarak eklenmesi, translokon makinelerinden ve sinyal dizileri13,14,15,16'dan bağımsız, fizyolojik olmayan ve hala büyük ölçüde bilinmeyen bir mekanizmadır. Yerleştirme etkinliğinin başlıca belirleyicileri, membran proteininin tipi ve sağlanan membranın lipit bileşimidir ve negatif yüklü lipitler için sıklıkla tercih edilir15,17. Nanodisk membranları nispeten sınırlı boyuttadır, MP yerleştirme18 üzerine önemli miktarda lipit salınır. Nanodisk boyutunun değişimi, daha yüksek oligomerik MP komplekslerinin 15,18'in yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Diğerlerinin yanı sıra, iyon kanalı KcsA, iyon pompası proteorhodopsin (PR) ve çoklu ilaç taşıyıcı EmrE15,18 için homooligomerik komplekslerin doğru montajı gösterilmiştir. Milletvekillerinin simetrik nanodisk membranına her iki taraftan da nispeten eşit frekansta girmeleri muhtemeldir. Bu nedenle, bir nanodiske yerleştirilen farklı monomerlerin veya oligomerlerin zıt yönelimlere sahip olabileceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, oryantasyondaki bir önyargı, PR hexamers ve KcsA tetramerlerinin oluşumu için bildirilen işbirlikçi yerleştirme mekanizmalarından kaynaklanabilir18. MP oryantasyonundaki başka bir önyargı, muhtemelen nanodisk membranlarının kenarına yerleştirilmiş MP'lerin oryantasyon anahtarlarından kaynaklanabilir.
E. coli suşlarından CF lizat üretimi güvenilir bir rutin tekniktir ve hemen hemen her biyokimyasal laboratuvarda gerçekleştirilebilir19,20. Disülfit köprü oluşumunun yanı sıra, bir MP'nin E. coli lizatları kullanılarak sentezlenmesi durumunda, diğer birçok çeviri sonrası modifikasyonun bulunmadığı düşünülmelidir. Bu, yapısal çalışmalar için daha homojen örnekler üretebilirken, bireysel MP hedeflerinin işlevi üzerindeki potansiyel etkileri dışlamak gerekebilir. Bununla birlikte, E. coli CF lizatlarında G-protein kuplajlı reseptörlerin (GPCR) 14,21,22, ökaryotik taşıyıcıların 23 veya büyük heteromerik montajların 24'ünün yüksek kaliteli örneklerinin verimli bir şekilde üretilmesi, karmaşık hedefler için bile uygunluklarını göstermektedir. Bir numunenin hazırlık ölçeği miktarları (≈ 1 mg/mL), bir reaksiyon karışımı (RM) ve bir besleme karışımı (FM) bölmesinden oluşan iki bölmeli sürekli değişim hücresiz (CECF) konfigürasyonu ile elde edilebilir. FM hacmi, RM hacmini 15 ila 20 kat aşıyor ve düşük moleküler ağırlıklı enerji bileşikleri ve öncülleri19'dan oluşan bir rezervuar sağlıyor. Böylece reaksiyon ifadesi birkaç saat uzatılır ve MP hedefinin nihai verimi artırılır. RM ve FM bölmeleri, 10-14 kDa kesimli bir diyaliz membranı ile ayrılır. İki bölme, CECF reaksiyon kabının özel bir tasarımını gerektirir (Şekil 1). FM'i tutan özel pleksiglas kaplar ile birlikte RM kapları olarak ticari diyaliz kasetleri uygun örneklerdir. MP verimleri, RM: FM oranlarını değiştirerek veya belirli bir inkübasyon süresinden sonra FM'yi değiştirerek daha da manipüle edilebilir.
Bir MP'nin verimi ve kalitesi sıklıkla reaksiyon parametrelerinin yoğun optimizasyonunu gerektirir. CF ifadesinin önemli bir avantajı, bir MP'nin bireysel gereksinimlerine göre hemen hemen her bileşiği değiştirme ve ince ayar yapma olasılığıdır. Basit bir strateji, önce temel bir üretim protokolü oluşturarak bir MP'nin verimini artırmaya odaklanmak ve daha sonra reaksiyon ve katlama koşullarına ince ayar yaparak MP kalitesini optimize etmektir. KF lizatlarında fizyolojik süreçlerin olmaması ve karmaşıklığının azalması, milletvekillerinin verimli üretimi için yüksek başarı oranlarına neden olmaktadır25. DNA şablon tasarımı ve Mg2 + iyon konsantrasyonunun optimizasyonu için rutin hususlar çoğu durumda tatmin edici verimler elde etmek için yeterlidir26. İfade moduna bağlı olarak, MP kalitesinin optimizasyonu zaman alıcı olabilir, çünkü daha çeşitli parametrelerintaranması gerekir 14,17,22.
Tanımlanan CF ekspresyon platformunu oluşturmak için, E. coli CF lizat (i), T7 RNA polimeraz (ii), nanodiskler (iii) ve temel CECF reaksiyon bileşiklerinin (iv) üretimi için protokoller gereklidir (Şekil 1). E. coli K12 suşu A1927 veya BL21 türevleri, verimli S30 (30.000 x g'de santrifüjleme) lizatlarının hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. S30 lizatlarının yanı sıra, diğer g-kuvvetlerinde (örneğin S12) santrifüj edilmiş karşılık gelen lizatlar da kullanılabilir. Lisatlar ekspresyon verimliliği ve proteom karmaşıklığı bakımından farklılık gösterir. Tanımlanan protokol ile hazırlanan S30 lizatının proteomu28 ayrıntılı olarak incelenmiştir. S30 proteomu hala iyon kanallarının ekspresyonu ve analizi üzerine arka plan problemleri verebilecek bazı artık dış zar proteinleri içerir. Bu tür hedefler için S80-S100 lizat kullanılması önerilir. Lisat hazırlama sırasında değerli bir modifikasyon, hücrelerin orta log büyüme fazında kombine ısı şoku ve etanol beslemesi ile SOS yanıtının indüklenmesidir. Elde edilen HS30 lizatları şaperonlar bakımından zenginleştirilmiştir ve gelişmiş MP katlama22 için S30 lizatlarla karışımlarda kullanılabilir. E. coli lizatlarındaki CF ekspresyonu, T7 RNA polimeraz (T7RNAP) tarafından kontrol edilen promotörler içeren DNA şablonları ile birleştirilmiş bir transkripsiyon / translasyon işlemi olarak çalıştırılır. Enzim, pAR1219 plazmid29'u taşıyan BL21 (DE3) Yıldız hücrelerinde verimli bir şekilde üretilebilir.
MSP1E3D1'in iki kopyası, 10-12 nm çapında bir nanodiskte toplanır, ancak aşağıda açıklanan protokol diğer MSP türevleri için de çalışabilir. Bununla birlikte, MSP1E3D1 ile oluşturulanlardan daha büyük nanodiskler daha az kararlı olma eğilimindeyken, MSP1 gibi MSP türevleriyle oluşturulan daha küçük nanodiskler daha büyük MP'leri veya MP komplekslerini barındırmayabilir. MSP1E3D1 nanodiskleri, çok çeşitli farklı lipitler veya lipit karışımları ile in vitro olarak monte edilebilir. Önceden oluşturulmuş nanodiskler genellikle -80 ° C'de 1 yıl > stabildir, stabilite ise farklı lipit bileşenleri için değişebilir. Bir MP'nin katlanması ve stabilitesi üzerindeki lipit etkilerinin taranması için, temsili çeşitli lipitler / lipit karışımları ile monte edilmiş kapsamlı bir nanodisk seti hazırlamak gerekir. Aşağıdaki lipitler iyi bir başlangıç seçimi sağlayabilir: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).
3 mL CECF reaksiyonunun hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. 1: 1 oranında daha fazla yukarı veya aşağı ölçeklendirme mümkündür. İki bölmeli CECF konfigürasyonu için, tüm bileşikleri içeren bir RM ve sadece düşük moleküler ağırlıklı bileşikleri içeren bir FM hazırlanmalıdır. 10-14 kDa MWCO'lu ticari 3 mL diyaliz cihazları RM konteyner olarak kullanılabilir ve daha sonra FM'i tutan özel yapım pleksiglas kaplara yerleştirilir (Şekil 1D)30. RM: FM oranı 1: 20'dir, bu nedenle 3 mL RM için 60 mL FM hazırlanmalıdır. DNA şablonları yayınlanan kılavuzlara göre hazırlanmalıdır ve hedefin okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ürün verimini daha da artırabilir26. Hazırlık ölçeği CECF reaksiyonu için, PR üretimi için belirlenmiş bir protokol tanımlanmıştır. Yeni milletvekilleri için ifade protokolleri oluşturmak için, verimi ve kaliteyi artırmak için genellikle belirli bileşiklerin optimizasyon ekranlarını (Tablo 1) gerçekleştirmek gerekir. Mg2 + iyonları için, farklı DNA şablonları için sıklıkla önemli varyasyonlar gösteren iyi odaklanmış bir konsantrasyon optimumluğu vardır. Yeni T7RNAP veya S30 lizat partileri gibi diğer CF reaksiyon bileşikleri, optimal Mg2 + konsantrasyonunu daha da değiştirebilir. Örnek olarak, 14-24 mM konsantrasyon aralığında ve 2 mM'lik adımlar halinde tipik bir Mg2+ ekran tanımlanmıştır. Her konsantrasyon kopyalar halinde ve analitik ölçekte CECF reaksiyonlarında taranır. CECF reaksiyon kabı olarak, RM'yi tutan özel yapım Mini-CECF Pleksiglas kaplar30, FM'yi tutan standart 24 delikli mikro plakalarla birlikte kullanılır (Şekil 1B). Alternatif olarak, uygun kurulumlarda 96 derin kuyucuklu mikroplakalar veya diğer ticari diyalizör cihazları ile birlikte ticari diyaliz kartuşları kullanılabilir (Şekil 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) (sodyum tuzu) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (ABD)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (ABD)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (sodyum tuzu) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (ABD)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-rak-(1-gliserol) (sodyum tuzu) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (ABD)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipidler (ABD)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rak-gliserol) (sodyum tuzu) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipidler (ABD)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hidroksimetil)- propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>9781</td><td></td></tr> <tr><td>[3H] -dihidroalprenolol Hidroklorür</td><td>Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar (ABD)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Asetil fosfat lityum potasyum tuzu (ACP)</td><td>Merck ( Almanya)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Almanya)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol</td><td>hidroklorür Merck (Almanya)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anyon değişim kromatografisi kolon malzemesi: Q-sepharose&reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav Tipi GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyoreaktör Tipi 884 124/1</td><td>B.Braun (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Almanya); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Almanya); Mikro 22 R; Hettich (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolik asit</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Kültür şişeleri 500 ml şaşkın şişeler, 2 l şaşkın şişeler</td><td>Schott Duran (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5'-trifosfat disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz monohidrat</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potasyumhidrojen fosfat trihidrat</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standart RC boru</td><td>Fisher Scientific (Almanya)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth (Almanya)</td> <td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit kalsiyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td> <td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Fransız basınç hücresi bozucu</td><td>SLM; Amico Instruments (ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5'-trifosfat di-sodyum tuzu (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC sütunu: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Yaşam Bilimleri (Almanya)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil-&beta;-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-arginin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartik Asit</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik Asit</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glisin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-histidin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-İzolösin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-serin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofan</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirozin</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 diyaliz üniteleri</td><td>Scienova (Almanya)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-ethansülfonik asit (HEPES)</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodesilfosfokolin</td><td>Antrace (ABD)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE odası: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE jel döküm sistemi: Mini Protean Handcast sistemleri</td><td>Biorad (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAYFA jel güç kaynağı: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kazeinden tripton/pepton</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa: ip-12</td><td>Ismatec (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenol piruvat monopotasyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich (Almanya)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat kinaz</td><td>Roche (Almanya)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon sayacı: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finlandiya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS peletleri</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre Nanodrop</td><td>Peqlab (Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre/floresan okuyucu Spark&reg;</td><td>Tecan (İsviçre)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tRNA (E. coli)</td> <td>Roche (Almanya) 10109550001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Almanya)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Uridine 5'-trifosfat tri-sodyum tuzu (UTP)</td> <td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td> <td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 köpük önleyici</td><td>Sigma-Aldrich (Almanya)</td> <td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Carl Roth (Almanya)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

membran proteinlerinin Önceden oluşturulmuş nanodisklere ko-translasyonel olarak yerleştirilmesi

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Hücresiz ekspresyon sistemleri, membran proteinleri gibi karmaşık proteinlerin bile işlevsel katlanmasını desteklemek için reaksiyon ortamlarının özel tasarımına izin verir. Membran proteinlerinin nanodiskler olarak tedarik edilen önceden oluşturulmuş ve tanımlanmış membranlara ko-translasyonel olarak yerleştirilmesi ve katlanması için deneysel prosedürler gösterilmiştir. Protokol tamamen deterjansızdır ve bir gün içinde miligram saflaştırılmış numune üretebilir. Elde edilen membran proteini / nanodisk örnekleri, çeşitli fonksiyonel çalışmalar ve kristalizasyon, nükleer manyetik rezonans veya elektron mikroskobu gibi yapısal uygulamalar için kullanılabilir. Hücresiz lizatlar, tasarlanmış membranlı nanodiskler, kritik stok çözeltileri ve iki bölmeli hücresiz ekspresyon reaksiyonlarının montajı gibi temel anahtar bileşenlerin hazırlanması açıklanmaktadır. Membran proteinlerinin katlanma gereksinimleri çok çeşitli olabileceğinden, bu protokolün ana odak noktası, kritik temel reaksiyon bileşikleri, nanodisklerin membran bileşimi, redoks ve şaperon ortamı veya DNA şablon tasarımı gibi numune kalitesi için önemli olan parametrelerin ve reaksiyon adımlarının modülasyonudur. Tüm süreç proteorhodopsin ve bir G-protein eşleşmiş reseptör sentezi ile gösterilmiştir.

İnce ayar reaksiyon bileşiklerinin, sentezlenmiş milletvekillerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki etkisi örneklendirilmiştir. Sık kullanılan rutin bir yaklaşım, CF reaksiyonlarında optimal Mg2+ konsantrasyonunu, sistem verimliliğinin uygun bir monitörü olarak yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonu ile ayarlamaktır. Örnek olarak, GFP, 14 ila 24 mM arasındaki Mg 2+ konsantrasyonlarında bir pET-21a (+) vektöründen sentezlendi (Şekil 2). SDS-PAGE analizi, CF reak...

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Protokol son derece verimli ve çok yönlüdür. Hemen hemen her zar proteinine uygulanabilir ve tüm üretim prosedürü bir gün içinde tamamlanır. Sentezlenen zar proteinleri, sağlanan ligandlar tarafından zaten ko-translasyonel olarak stabilize edilebilir.Deterjan temaslarından tamamen kaçınılır ve proteinler doğrudan sağlanan ve özel membran ortamlarına girer ve katlanır. Yapısal yaklaşımlar, fonksiyonel karakterizasyon ve antikor üretimi başlıca uygulama alanlarıdır. Teknik ayrıca, zar proteini katlanması ve işlevi üzerindeki lipid etkilerini analiz etmede basittir.Kültürün üçüncü gününde, 10 litre steril 37 santigrat derece YPTG ortamını 100 mililitre ön kültür ile 15 litrelik karıştırılmış tank reaktöründe aşılayın. Ve bakterileri yüksek havalandırmada dakikada 500 devir ile 37 santigrat derecede yetiştirin. Aşırı köpürmeyi önlemek için steril köpük önleyici ekleyin.Hücreler orta log fazına ulaştığında, kültüre 300 mililitre etanol ekleyin ve hücreleri 42 santigrat derecede dakikada 500 rotasyonla 45 dakika daha yüksek havalandırmada inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve hücreleri 300 mililitre S30A tamponunda tamamen yeniden süspanse etmek için bir spatula ve bir pipet kullanın. Yeniden süspanse edilen bakterileri iki kez santrifüjleyin, peleti yıkama başına 300 mililitre taze S30A ile yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 1.1 hacim S30B tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu önceden soğutulmuş bir Fransız pres basınç hücresine yükleyin ve hücreleri bir kez inç kare başına 1.000 pound'da bozun. Kararsız bileşenleri çıkarmak ve mRNA'yı ribozomlardan serbest bırakmak için, lizatı 0.4 molar sodyum klorüre ayarlayın ve numuneyi 42 santigrat derecelik bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin.Membran iskele proteini nanodisklerini monte etmek için, MSP1E3D1 çözeltisini lipit çözeltisi ile karıştırın ve DPC'yi %0.1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Reaksiyonu tabloya göre uygun nihai hacme ayarlayın ve reaksiyonları hafif çalkalama altında 21 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bir diyaliz kasetinin zarını disk oluşturma tamponu ile önceden ıslatın ve montaj karışımını kasete yüklemek için bir şırınga kullanın. Daha sonra, karışımı 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme ile disk oluşum tamponu dengelenmiş santrifüj filtre ünitelerine aktarmadan önce, oda sıcaklığında 10 ila 20 saat boyunca üç adet beş litrelik disk oluşturma tamponuna karşı reaksiyonu diyaliz edin.Ardından, konsantrasyonu ölçmek için bir UV-Vis okuyucu kullanarak santrifüjleme yoluyla reaksiyonu en az 300 mikromolar kadar konsantre edin. Üç mililitrelik sürekli değişim hücresi içermeyen bir reaksiyon hazırlamak için, üç mililitrelik bir diyaliz kasetinin zarını 100 milimolar tris-asetat içinde dengeleyin. Reaksiyon karışımını kasete aktarmak için bir şırınga kullanın.Bir şırınga kullanarak, reaksiyon karışımı bölmesindeki fazla havayı alın ve kaseti diyaliz odasına yerleştirin. Hazneyi 60 mililitre besleme karışımı ile doldurun ve kapağı haznenin üzerine yerleştirin. Kapağı yerine sabitledikten sonra, hazneyi dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin.Magnezyum iyon taraması için 60 mikrolitrelik hücre değişim hücresiz reaksiyon kurulumu hazırlamak için, reaksiyon karışımına 60 mikrolitre taze hazırlanmış 3X Master Mix'imizden ve besleme karışımına 825 mikrolitre ekleyin. Ve besleme karışımını suyla doldurun. Girdaplamadan sonra, 24 oyuklu bir mikroplakanın üç oyuğunun her birine 825 mikrolitre besleme karışımı ekleyin.10 ila 14 kilodalton moleküler ağırlıklı rejenere selüloz diyaliz tüplerini yaklaşık 25 x 20 milimetre boyutunda parçalar halinde kesin ve parçaları %0.05 sodyum azit takviyeli suda saklayın. Mini hücre değişimi hücresiz kap montajından önce, diyaliz zarlarındaki fazla suyu çıkarmak için bir doku kullanın ve her kabın üzerine bir zar parçası yerleştirin. Membranları bir politetrafloroetilen halkası ile sabitleyin ve mini kabı bir besleme karışımı kuyusuna aktarın.Yüksek moleküler bileşenleri tabloda belirtildiği gibi reaksiyon karışımına ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Hava kabarcıklarını önlemek için reaksiyon kabına 60 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin. Ve 24 oyuklu plakanın etrafına iki adet sekize 10 santimetrelik bir sızdırmazlık termoplastik filmi sarın.Kuyu plakasının kapağını bantla yerine sabitleyin ve plakayı 12 ila 16 saat çalkalayarak dakikada 200 devirde 30 santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi sabah, mini hücre değiştirme hücresiz kabındaki diyaliz membranını delmek için bir pipet ucu kullanın ve reaksiyon karışımını aspire edin. Reaksiyon karışımını yeni santrifüj tüplerine aktarın ve çökeltileri gidermek için santrifüjleyin.Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Burada, ince ayar reaksiyon bileşiklerinin sentezlenen zar proteinlerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki temsili bir etkisi gösterilmektedir. Bu analizde, T-beta-on adrenerjik reseptörün genel sentezi ve nanodisk çözünmesi, analiz edilen tüm membran bileşimleri altında benzerdi.Buna karşılık, sentezlenen G proteinine bağlı reseptörün kalitesinde çok daha yüksek bir varyasyon tespit edildi, en düşük aktivite DMPC ve POPC lipidleri ile elde edildi ve en yüksek aktivite DOPG ve POPG uygulandığında gözlendi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, lipid baş grubunun yükünün yanı sıra yağ asidi zincirinin esnekliğinin, bu hücre zarı proteininin katlanması ve aktivitesi için önemli modülatörler olduğunu göstermektedir. Nihai nanodisk konsantrasyonu da membran protein kalitesi için önemli bir faktör olabilir.Örneğin, nanodisk konsantrasyonu 3.75 ila 60 mikromolar arasında bir aralıkta taranırsa, G proteinine bağlı reseptörün yaklaşık 30 mikromolar nanodiskte tam bir çözünmesi elde edilir ve bu da bir ila üç zar proteini-nanodisk oranı verir. Buna karşılık, proteorhodopsinin tam bir çözünmesi, yaklaşık 10 mikromolar nanodisklerle elde edilebilir ve bu da 10'a bir proteorhodopsin-nanodisk oranı verir. Doğru pipetleme ve yüksek kaliteli bileşenler kesinlikle zorunludur.Lizat hazırlığı için kritik adımlar, hücrelerin orta log fazında hasat edilmesi ve yüksek tuz aşamasının uygulanmasıdır. Teknik, membran protein sentezinin karmaşıklığını büyük ölçüde azaltır. Eskiden zorlu hedefler verimli bir şekilde sentezlenir, bu nedenle şimdiye kadar keşfedilmemiş farmasötik olarak ilgili proteinlerin moleküler yapıları üzerinde çalışmaya izin verilir.

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Kaynak: Gilmore, S.F., ve diğerleri. Aşı Geliştirme için Chlamydia muridarum'dan Rekombinant Majör Dış Membran Proteinine Hücresiz Ölçekli Üretim ve Adjuvan İlavesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, çift bölmeli bir sistem kullanılarak nanodisk ile stabilize edilmiş membran protein antijenlerinin hücresiz sentezini göstermektedir. Cihaz, verimli protein sentezi, uygun katlama ve nanodisklere stabil entegrasyon için en uygun koşulları korur.

Hücresiz Bir Sistem Kullanılarak Nanodisk ile Stabilize Edilmiş Membran Protein Antijenlerinin Sentezi

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Burada, yapay lipid membranlarda yüksek uzay-zamansal hassasiyetle ışık regüle edilmiş ve geri dönüşümlü protein modelleri oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, mavi ışık altında ortak proteini Nano'ya (vahşi tip SspB) bağlanan model zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilen protein iLID'in (geliştirilmiş ışıkla indüklenebilir dimer) lokalize fotoaktivasyonundan oluşur.

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Öğrenin, membran proteinlerini deterjan kullanmadan hücre dışı sentezleme ve önceden oluşturulmuş nanodisklere ko-translasyonel yerleştirme yöntemini. Bu protokol, yapısal çalışmalar ve antikor üretimi için güçlü bir yaklaşım sunar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Daha fazla video keşfet