Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Protokol son derece verimli ve çok yönlüdür. Hemen hemen her zar proteinine uygulanabilir ve tüm üretim prosedürü bir gün içinde tamamlanır. Sentezlenen zar proteinleri, sağlanan ligandlar tarafından zaten ko-translasyonel olarak stabilize edilebilir.

Deterjan temaslarından tamamen kaçınılır ve proteinler doğrudan sağlanan ve özel membran ortamlarına girer ve katlanır. Yapısal yaklaşımlar, fonksiyonel karakterizasyon ve antikor üretimi başlıca uygulama alanlarıdır. Teknik ayrıca, zar proteini katlanması ve işlevi üzerindeki lipid etkilerini analiz etmede basittir.

Kültürün üçüncü gününde, 10 litre steril 37 santigrat derece YPTG ortamını 100 mililitre ön kültür ile 15 litrelik karıştırılmış tank reaktöründe aşılayın. Ve bakterileri yüksek havalandırmada dakikada 500 devir ile 37 santigrat derecede yetiştirin. Aşırı köpürmeyi önlemek için steril köpük önleyici ekleyin.

Hücreler orta log fazına ulaştığında, kültüre 300 mililitre etanol ekleyin ve hücreleri 42 santigrat derecede dakikada 500 rotasyonla 45 dakika daha yüksek havalandırmada inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve hücreleri 300 mililitre S30A tamponunda tamamen yeniden süspanse etmek için bir spatula ve bir pipet kullanın. Yeniden süspanse edilen bakterileri iki kez santrifüjleyin, peleti yıkama başına 300 mililitre taze S30A ile yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 1.1 hacim S30B tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu önceden soğutulmuş bir Fransız pres basınç hücresine yükleyin ve hücreleri bir kez inç kare başına 1.000 pound'da bozun. Kararsız bileşenleri çıkarmak ve mRNA'yı ribozomlardan serbest bırakmak için, lizatı 0.4 molar sodyum klorüre ayarlayın ve numuneyi 42 santigrat derecelik bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin.

Membran iskele proteini nanodisklerini monte etmek için, MSP1E3D1 çözeltisini lipit çözeltisi ile karıştırın ve DPC'yi %0.1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Reaksiyonu tabloya göre uygun nihai hacme ayarlayın ve reaksiyonları hafif çalkalama altında 21 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bir diyaliz kasetinin zarını disk oluşturma tamponu ile önceden ıslatın ve montaj karışımını kasete yüklemek için bir şırınga kullanın. Daha sonra, karışımı 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme ile disk oluşum tamponu dengelenmiş santrifüj filtre ünitelerine aktarmadan önce, oda sıcaklığında 10 ila 20 saat boyunca üç adet beş litrelik disk oluşturma tamponuna karşı reaksiyonu diyaliz edin.

Ardından, konsantrasyonu ölçmek için bir UV-Vis okuyucu kullanarak santrifüjleme yoluyla reaksiyonu en az 300 mikromolar kadar konsantre edin. Üç mililitrelik sürekli değişim hücresi içermeyen bir reaksiyon hazırlamak için, üç mililitrelik bir diyaliz kasetinin zarını 100 milimolar tris-asetat içinde dengeleyin. Reaksiyon karışımını kasete aktarmak için bir şırınga kullanın.

Bir şırınga kullanarak, reaksiyon karışımı bölmesindeki fazla havayı alın ve kaseti diyaliz odasına yerleştirin. Hazneyi 60 mililitre besleme karışımı ile doldurun ve kapağı haznenin üzerine yerleştirin. Kapağı yerine sabitledikten sonra, hazneyi dakikada 200 devirde 30 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin.

Magnezyum iyon taraması için 60 mikrolitrelik hücre değişim hücresiz reaksiyon kurulumu hazırlamak için, reaksiyon karışımına 60 mikrolitre taze hazırlanmış 3X Master Mix'imizden ve besleme karışımına 825 mikrolitre ekleyin. Ve besleme karışımını suyla doldurun. Girdaplamadan sonra, 24 oyuklu bir mikroplakanın üç oyuğunun her birine 825 mikrolitre besleme karışımı ekleyin.

10 ila 14 kilodalton moleküler ağırlıklı rejenere selüloz diyaliz tüplerini yaklaşık 25 x 20 milimetre boyutunda parçalar halinde kesin ve parçaları %0.05 sodyum azit takviyeli suda saklayın. Mini hücre değişimi hücresiz kap montajından önce, diyaliz zarlarındaki fazla suyu çıkarmak için bir doku kullanın ve her kabın üzerine bir zar parçası yerleştirin. Membranları bir politetrafloroetilen halkası ile sabitleyin ve mini kabı bir besleme karışımı kuyusuna aktarın.

Yüksek moleküler bileşenleri tabloda belirtildiği gibi reaksiyon karışımına ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Hava kabarcıklarını önlemek için reaksiyon kabına 60 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin. Ve 24 oyuklu plakanın etrafına iki adet sekize 10 santimetrelik bir sızdırmazlık termoplastik filmi sarın.

Kuyu plakasının kapağını bantla yerine sabitleyin ve plakayı 12 ila 16 saat çalkalayarak dakikada 200 devirde 30 santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi sabah, mini hücre değiştirme hücresiz kabındaki diyaliz membranını delmek için bir pipet ucu kullanın ve reaksiyon karışımını aspire edin. Reaksiyon karışımını yeni santrifüj tüplerine aktarın ve çökeltileri gidermek için santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Burada, ince ayar reaksiyon bileşiklerinin sentezlenen zar proteinlerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki temsili bir etkisi gösterilmektedir. Bu analizde, T-beta-on adrenerjik reseptörün genel sentezi ve nanodisk çözünmesi, analiz edilen tüm membran bileşimleri altında benzerdi.

Buna karşılık, sentezlenen G proteinine bağlı reseptörün kalitesinde çok daha yüksek bir varyasyon tespit edildi, en düşük aktivite DMPC ve POPC lipidleri ile elde edildi ve en yüksek aktivite DOPG ve POPG uygulandığında gözlendi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar, lipid baş grubunun yükünün yanı sıra yağ asidi zincirinin esnekliğinin, bu hücre zarı proteininin katlanması ve aktivitesi için önemli modülatörler olduğunu göstermektedir. Nihai nanodisk konsantrasyonu da membran protein kalitesi için önemli bir faktör olabilir.

Örneğin, nanodisk konsantrasyonu 3.75 ila 60 mikromolar arasında bir aralıkta taranırsa, G proteinine bağlı reseptörün yaklaşık 30 mikromolar nanodiskte tam bir çözünmesi elde edilir ve bu da bir ila üç zar proteini-nanodisk oranı verir. Buna karşılık, proteorhodopsinin tam bir çözünmesi, yaklaşık 10 mikromolar nanodisklerle elde edilebilir ve bu da 10'a bir proteorhodopsin-nanodisk oranı verir. Doğru pipetleme ve yüksek kaliteli bileşenler kesinlikle zorunludur.

Lizat hazırlığı için kritik adımlar, hücrelerin orta log fazında hasat edilmesi ve yüksek tuz aşamasının uygulanmasıdır. Teknik, membran protein sentezinin karmaşıklığını büyük ölçüde azaltır. Eskiden zorlu hedefler verimli bir şekilde sentezlenir, bu nedenle şimdiye kadar keşfedilmemiş farmasötik olarak ilgili proteinlerin moleküler yapıları üzerinde çalışmaya izin verilir.