Name: Açık Damar Penceresi ve İntravital Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Kokleasında Strial Kan Akışının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Keşfedin fare kokleasında strial kan akışını ölçme yöntemini. Açık damar penceresi ve intravital floresan mikroskobu kullanılarak işitme bozukluklarının kan akışı patolojisiyle ilişkisini araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nden (OHSU) Tıbbi Araştırma Vakfı (X.Shi) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır. Hayvanların kullanımını içeren tüm prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (IACUC onay numarası: TR01_IP00000968).
1. Floresan etiketli kan hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>Donör fareleri (~ 6 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri) intraperitoneal (i.p.) ketamin / ksilazin anestezik çözeltisi enjeksiyonu ile anestezik hale getirin (5 mL / kg, Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Bu anestezi protokolü çok güvenilirdir ve sistemik kan basıncını korur.</li>
	<li>Fareyi sırt üstü yatırın, cildi açın ve cımbız ve disseksiyon makası kullanarak göğüs boşluğunu ortaya çıkarın. Diyaframı kesin, kelepçe makası kullanarak sternumun tabanından tutun, göğüs kafesini kesin ve kalbi açığa çıkarmak için kaldırın. Kardiyak ponksiyon yoluyla heparinde (15 IU / mL kan) 1 mL kan toplayın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 3.000 × g'de santrifüj yapın. Kan alımından sonra servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin.</li>
	<li>Plazmayı çıkarın, kan hücresi peletini 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 3000 × g'de 3x santrifüj yapın.</li>
	<li>Kan hücrelerini PBS'de 1 mL 20 mM DiO veya Dil ile etiketleyin ve oda sıcaklığında 23,24 dakika boyunca karanlıkta30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Etiketli kan hücrelerini 1 mL PBS ile santrifüj yapın ve yıkayın, 4 ° C'de 3 dakika boyunca 3000 × g'de 3x santrifüj yapın ve enjeksiyondan önce hücre peletini ~ 0.9 mL PBS (son hacim ~ 1.3 mL) ile% 30 hematokrit içinde yeniden askıya alın.</li>
</ol>2. Açık pencere oluşturmak için ameliyat 25
<ol><li>Steril cerrahi aletleri ve görüntüleme platformunu hazırlayın ve örtünün altına bir ısıtma yastığı yerleştirin (Şekil 1A). Adım 1.1'de açıklandığı gibi fareleri (~ 6 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri) anestezi altına alın ve pençe refleksini ve genel kas tonusunu izleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvanı ılık ısıtma yastığına yerleştirin ve rektal sıcaklığı 37 ° C'de tutun.</li>
	<li>Kan basıncını ve kalp atışını izlemek için hayvan kuyruğunu CODATM monitör sistemine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hayvanın sistolik kan basıncını, diyastolik kan basıncını ve ortalama kan basıncını (MBP) anestezi altındaki durumda kaydedin. NOT: Anestezi uygulanmış ve anestezi yapılmamış durumda hayvan MBP'sinde fark görülmemektedir (107 ± 11 mmHg'ye karşılık 97 ± 7 mmHg). Hayvan kalp atış hızı anestezi altında stabildir, ancak anestezi yapılmamış durumdan daha düşüktür (hala normal aralıkta) (357 ± 12 bmp'ye karşı 709 ± 3 bmp). Kısıtlama26'ya yerleştirilen hayvanlarda biraz artmış bir kalp atışı beklenmelidir.</li>
	<li>Sol timpanik bullayı stereo mikroskop altında lateral ve ventral bir yaklaşımla açın ( Malzeme Tablosuna bakınız), timpanik membranı ve kemikçikleri sağlam bırakın21.<ol><li>Hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca, başı hareketsiz ve hareketi en aza indirecek şekilde konumlandırılmış bir kesi yapın (Şekil 1B). Sol submandibuler bezi ve digastrik kasın arka göbeğini çıkarın ve koterize edin. NOT: Ameliyat sırasında ağrıyı azaltmak için deri altından 0.05 mg / kg'da buprenorfin enjekte edin.</li>
		<li>Sternokleidomastoid kası ve bulla'ya doğru anterior uzanan fasiyal siniri tanımlayarak kemikli bullayı bulun ve ortaya çıkarın.</li>
		<li>Kemikli bullayı 30 G'lık bir iğne ile açın ve koklea ve stapedial arterin net bir görünümünü sağlamak için çevredeki kemiği cerrahi cımbızla dikkatlice çıkarın, medial marjı yuvarlak pencere nişinin kenarında uzanır ve oval pencereye doğru anterior-superior akar (Şekil 1C, D). NOT: Trakeotomi, hava yolunu engelsiz tutmak için yapılır ve sadece hayvanın ameliyat sırasında solunum sorunu olduğunda yapılmalıdır. Genel olarak, anestezi altındaki hayvanların çoğu düzgün nefes alır. Bununla birlikte, hayvanlar ameliyat sırasında trakeotomi aldıysa, kaydedilen kan akışı herhangi bir karşılaştırma için kullanılmamalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare kokleasının tepe-orta dönüşünde, ince bir nokta çatlayana kadar tepeden yaklaşık 1,25 mm uzakta yanal duvar kemiğini kazımak için küçük bir bıçak bıçağı (özel olarak öğütülmüş #16 neşter) kullanın. Kemik yongalarını küçük tel kancalarla çıkarın (Şekil 1E).</li>
	<li>Normal fizyolojik koşulları korumak ve kap görüntülerini kaydetmek için optik bir görünüm sağlamak için kap penceresini kesilmiş bir kapak kayması ile örtün. NOT: Tüm prosedürler dikkatle yapılmalıdır. Vücut ısısını izlemenin yanı sıra, kan basıncı ve kalp atışı da dahil olmak üzere hayvanın hayati belirtileri de ameliyat boyunca izlenmelidir.</li>
</ol>3. FIVM altında CoBF'nin görüntülenmesi
<ol><li>Damarı açığa çıkarmak için sağ safen damar boyunca ~1 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1F).</li>
	<li>FITC-dekstran çözeltisinin 100 μL'sini (2000 kDa, PBS'de 40 mg / mL) ve 100 μL kan hücresi süspansiyonunu (% 30 hematokrit) safen damarından (Şekil 1G) hayvana art arda enjekte ederek kan damarlarının görselleştirilmesini ve kan akış hızının izlenmesini sağlayın.</li>
	<li>Enjeksiyondan 5 dakika sonra kan akışını doğrudan bir video monitöründe gerçek zamanlı olarak gözlemleyin. Uzun çalışma mesafesi (W.D.) hedefi (W.D. 30.5 mm, 10x, 0.26 sayısal açıklık) ve çoklu bant uyarma filtresi ve uyumlu emisyon filtresi (Malzeme Tablosu) içeren bir lamba muhafazası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kan damarlarını görüntüleyin. Yüksek çözünürlüklü dijital siyah beyaz şarj bağlantılı cihaz kamerası (Malzeme Tablosu) kullanarak 2 kare/sn'de video kaydedin. Akış hızının başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlamak için video başına 350'den fazla görüntü elde edin. NOT: Hem spiral ligament hem de stria vascularis'in kan damarları, optik odak ayarlanarak görüntülenebilir (Ek Video 1).</li>
</ol>4. Video analizi
<ol><li>Uygun yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanarak kap çapını ölçün ve elde edilen görüntülerde gemi boyunca iki sabit nokta arasındaki mesafeyi belirleyin.</li>
	<li>Görüntü konumları arasındaki uzamsal mesafedeki etiketli kan hücrelerinin hareketini izleyerek yakalanan video karelerinden kan akış hızını hesaplayın27.<ol><li>Yazılımdaki kan akışının videosunu açın (bu protokolde Fiji [ImageJ] kullanıldı) ve görüntülerin ölçeğini ayarlayın.</li>
		<li>İzleme işlevini kullanarak seçilen DiO lekeli kan hücrelerini izleyin. Akış hızının otomatik olarak hesaplanması için hücrelerin hareket ettirdiği mesafeyi ve videodaki görüntü kareleri arasındaki zaman aralığını kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki denkleme göre hacimsel akışı (F) hesaplayın: F = V × A. (V: hız; C: geminin kesit alanı).</li>
</ol>5. Gürültüye Maruz Kalma
<ol><li>Hayvanları tel örgü kafeslere yerleştirin. Bunları bir ses pozlama kabininde 120 dB ses basıncı seviyesinde geniş bant gürültüsüne 3 saat ve ertesi gün 3 saat daha maruz bırakın. NOT: Bu laboratuvarda rutin olarak kullanılan bu gürültüye maruz kalma rejimi, koklear hassasiyette kalıcı kayıp28'e neden olur.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li>
<li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li>
<li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+%5Bcorrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li>
<li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li>
<li>Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li>
<li>Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound-induced+cochlear+ischemia%2Fhypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Noise+and+Health%22%5BJournal%5D)">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17(1999).</li>
<li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hearing%22%5BJournal%5D)">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).</li>
<li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li>
<li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+%28ALDF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li>
<li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser+Doppler%3A+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li>
<li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li>
<li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li>
<li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).</li>
<li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).</li>
<li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%22%5BJournal%5D)">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li>
<li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li>
<li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li>
<li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041(2012).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow%3A+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li>
<li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652(2011).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li>
<li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu yazıda, bir fare modelinin koklear lateral duvarındaki (ve stria vascularis'teki) kılcal damarların, bir FIVM sistemi altında açık bir kap penceresi hazırlığında florofor etiketleme ile nasıl görselleştirilebileceği gösterilmektedir. Fare modeli, insan sağlığı ve hastalıklarının araştırılmasında memeli modeli olarak yaygın olarak kullanılmakta ve tercih edilmektedir. Burada açıklanan protokol, FIVM sistemi altında açık bir damar penceresi kullanarak fare lateral duvarında (özellikle stria vascularis'te) CoBF'yi görünt...

Lateral koklear duvardaki mikrosirkülasyonun normal fonksiyonu (spiral ligament ve stria vascularis'teki kılcal damarların çoğunluğunu içerir) işitme fonksiyonunun korunması için kritik öneme sahiptir1. Anormal CoBF, gürültüye bağlı işitme kaybı, kulak hidrops ve presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere birçok iç kulak bozukluğunun patofizyolojisinde rol oynar. İntravital CoBF'nin görselleştirilmesi, işitme fonksiyonu ile koklear vasküler patoloji arasındaki bağlantıların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Kokleanın temporal kemik içindeki karmaşıklığı ve yeri, CoBF'nin doğrudan görüntülenmesini ve ölçülmesini engellese de, CoBF'nin değerlendirilmesi için lazer-doppler flowmetri (LDF)10,11,12, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)13, floresan intravital mikroskopi (FIVM)14, floresan mikroendoskopi (FME)15, endoskopik lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI)16 gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. ve etiketli belirteçlerin ve radyoaktif olarak etiketlenmiş mikrosferlerin kan dolaşımına enjeksiyonuna dayanan yaklaşımlar (optik mikroanjiyografi, OMAG)17,18,19,20. Bununla birlikte, bu yöntemlerden hiçbiri, FIVM hariç, CoBF'deki değişikliklerin in vivo olarak mutlak gerçek zamanlı izlenmesini sağlamamıştır. FIVM, lateral koklear duvardaki bir damar penceresi ile birlikte, çeşitli laboratuvarlar tarafından farklı deney koşulları altında kobaylarda kullanılan ve doğrulanan bir yaklaşımdır 14,21,22.
Kontrast madde olarak floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran ve bir floresan boya (3, 3′-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat, yeşil) veya Dil (1,1-dioktadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red) kullanılarak faredeki koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri incelemek için bir FIVM yöntemi başarıyla oluşturulmuştur. Bu çalışmada, normal ve patolojik koşullar altında (gürültüye maruz kaldıktan sonra olduğu gibi) farede CoBF'deki değişiklikleri görüntülemek ve ölçmek için bu yöntemin protokolü tanımlanmıştır. Bu teknik, araştırmacıya, özellikle hazır transgenik fare modelleriyle birlikte uygulandığında, stria vascularis'teki işitme disfonksiyonu ve patoloji ile ilgili CoBF'nin altta yatan mekanizmalarını araştırmak için gereken araçları sağlar.

<table><tbody><tr><td>% 0.9 Sodyum Klorür</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0.6 mL (1 mL için)</td></tr> <tr><td>1,1 & prime; -Dioktadesil-3,3,3 & prime;, 3 & prime; -tetrametilindokarbosiyanin perklorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td>20 & mikro; </td></tr><tr><td>M3,3&asal;-Dioktadesikloksakarbosiyanin perkloratDio (3,3&asal;-Dioktadesiksakarbosiyanin perklorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 &mikro; M</td></tr><tr><td>CODA Monitör sistemi</td><td>Kent scientific</td><td></td><td>CODA Monitor, kan basıncını ve kalp atışını izlemek için</td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>DC Sıcaklık Kontrol Cihazı</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Damar çapının ölçümü</td></tr><tr><td>FITC-dekstran (2000 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 mg / mL</td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Enjeksiyonu, USP MDV</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 USP birimi/mL</td></tr><tr><td>Katatezi (100 mg/mL)</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0.2 mL (1 mL için)</td></tr><tr><td>Mikroskop Objektif</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Model: C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>Kzain (100 mg / ml, kullanım için 5x seyreltilmiş)</td> <td>Lloyd</td><td>LPFL04821</td><td>0.2 mL (1 mL için)</td></tr> <tr><td>Zoom Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Model: SZ61, floresan mikroskop</td></tr></tbody></table>

açık damar penceresi ve İntravital floresan mikroskobu kullanılarak fare kokleasında strial kan akışının Ölçülmesi

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Sesin iletimi metabolik olarak zordur ve mikrovaskülatürün lateral duvardaki normal fonksiyonu endokoklear potansiyeli, iyon taşınımını ve sıvı dengesini korumak için kritik öneme sahiptir. İşitme bozukluklarının farklı formlarının kokleada anormal mikrosirkülasyon içerdiği bildirilmiştir. Koklear kan akımı (CoBF) patolojisinin işitme fonksiyonunu nasıl etkilediğinin araştırılması, uygulanabilir sorgulama yöntemlerinin eksikliği ve iç kulağa erişimdeki zorluk nedeniyle zordur. Lateral koklear duvardaki açık bir damar penceresi, floresan intravital mikroskopi ile birlikte, CoBF değişikliklerini in vivo olarak incelemek için kullanılmıştır, ancak çoğunlukla kobayda ve sadece son zamanlarda farede. Bu makale ve ilgili video, fare kokleasındaki kan akışını görselleştirmek için açık damar penceresi yöntemini açıklamaktadır. Ayrıntılar arasında 1) farelerden floresan etiketli kan hücresi süspansiyonunun hazırlanması; 2) anestezi uygulanan bir farede intravital mikroskopi için açık bir damar penceresinin oluşturulması ve 3) görüntülemenin çevrimdışı bir kaydını kullanarak kan akış hızının ve hacminin ölçülmesi. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri araştırmak için farede açık pencere yaklaşımının nasıl kullanılacağını göstermek için video formatında sunulmuştur.

Yanal duvardaki koklear kılcal damarların cerrahi maruziyetinden sonra (Şekil 1), FITC-dekstran etiketli damarlarda Dil etiketli kan hücrelerinin intravital yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobik gözlemi açık bir damar penceresinden mümkün olmuştur. Şekil 2A, FIVM altında çekilmiş ve fare koklear tepe orta dönüş yanal duvarının kılcal damarlarını gösteren temsili bir görüntüdür. Bu damarların luminası, plazma ile karıştırılmış ...

Floresan izleyiciler kullanan açık damar-pencere yaklaşımı, koklear kan akışı (CoBF) ölçümü için yeterli çözünürlük sağlar. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında farede CoBF'deki yapısal ve fonksiyonel değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır.

Açık Damar Penceresi ve İntravital Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Kokleasında Strial Kan Akışının Ölçülmesi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Kokleaya normal kan akışı, koklea Meniere Hastalığı için, özellikle saç hücrelerinin işlemi için gerekli itici güç olan iç mekan koklear potansiyelini korumak için kritik öneme sahiptir. Kan dolaşımının bu işlevi, farklı işitme kaybı biçimleriyle yakından ilişkilendirilmiştir. Koklear kan akımının daha iyi anlaşılması, kan akımı disfonksiyonundan kaynaklanan işitme bozukluklarının daha etkili bir şekilde yönetilmesini sağlayacaktır.Bununla birlikte, doğrudan kan akımı ölçümü, iç kulağın değerlendirilmesinin zorluğu nedeniyle çok çok zordur. Koklear kan akışını değerlendirmek için teknikler şu anda hala geliştirilme aşamasındadır. Burada, fare gibi küçük hayvan türlerinde koklear kan akışını daraltmak için yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile konaklama birimlerinde laboratuarımızda kurulan son yöntemlerden birini açık kas penceresinde gösteriyoruz.Bu tekniğin transgenetik kitle modelleri ile uygulanması, intravasküler riskte işitme fonksiyonu ile koklear kan akımı ile ilgili patoloji arasındaki bağlantıları çözmek için araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir. Prosedürlerimiz dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Anlık vücut kanamasına ek olarak, kan basıncı ve kalp atışı da dahil olmak üzere hayvanın hayati belirtileri ameliyatınız sırasında izlenmelidir.Kardiyak ponksiyon yoluyla heparinde yaklaşık bir milimetre kan toplayarak başlayın. Kanı dört santigrat derecede üç dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüj edin. Plazmayı çıkarın, ardından kan hücresi peletini bir mililitre PBS ile üç kez 3000 kez G'de santrifüjleme yoluyla dört santigrat derecede üç dakika boyunca yıkayın.Kan hücrelerini PBS'de bir mililitre 20 mikromolar DiO veya Dil ile etiketleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Etiketli kan hücrelerini bir mililitre PBS ile yıkayın ve üç dakika boyunca 3000 kez G'de üç kez santrifüj yapın. Enjeksiyondan önce hücre peletini yaklaşık 0.9 mililitre PBS ile% 30 hematokrit içinde yeniden askıya alın.Steril cerrahi aletler ve görüntüleme platformu hazırlayın ve örtünün altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Anestezinin derinliğini kontrol etmek için anestezi uygulanan farelerin zayıf refleksini ve genel kas tonusunu izleyin. Kan basıncını ve kalp atışını izlemek için hayvanı sıcak ısıtma yastığına ve kuyruğunu monitör sistemine yerleştirin.Rektal sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun ve hayvanın sistolik kan basıncını, diyastolik kan basıncını ve anestezi altındaki durumda ortalama kan basıncını kaydedin. Sol timpanik bullayı stereo mikroskop altında lateral ve vental bir yaklaşımla açın ve timpanik membranı ve kemikçikleri sağlam bırakın. Hareketi en aza indirmek için hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca, başı hareketsiz olacak şekilde bir kesi yapın.Sol sub mandibuler bezi ve digastrik kasın arka göbeğini çıkarın ve koterize edin. Sternokleidomastoid kası ve bulla'ya doğru anterior uzanan fasiyal siniri tanımlayarak kemikli bullayı bulun ve ortaya çıkarın. Kemikli bullayı 30 gauge iğne ile açın ve yuvarlak pencere nişinin kenarında uzanan ve oval pencereye doğru ön üstünlüğe neden olan medial marjı ile koklear ve stapedial arterin net bir görünümünü sağlamak için çevredeki kemiği cerrahi cımbızla dikkatlice çıkarın.Fare kokleasının tepe orta dönüşünde, ince bir nokta çatlayana kadar tepeden yaklaşık 1,25 milimetre uzaktaki yanal duvar kemiğini kazımak için küçük bir bıçak bıçağı kullanın. Kemik yongalarını küçük tel kancalarla çıkarın. Normal fizyolojik koşulları korumak ve damar görüntülerini kaydetmek için optik bir görünüm sağlamak üzere kap penceresini kesilmiş bir kapak kayması ile örtün.Damarı açığa çıkarmak için sağ safen damar boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın. FITC-Dextran çözeltisinin her birine 100 mikrolitre ve kan hücresi süspansiyonunu, kan damarlarının görselleştirilmesini ve kan akışının izlenmesini sağlamak için safen damarından hayvana art arda infüze edin. Enjeksiyondan beş dakika sonra bir video monitöründe kan akışını gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.Uzun bir çalışma mesafesi hedefi ve çoklu bant uyarma filtresi ve uyumlu emisyon filtresi içeren bir lamba muhafazası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kan damarlarını görüntüleyin. Video başına 350'den fazla görüntü elde eden yüksek çözünürlüklü dijital siyah beyaz şarj bağlantılı cihaz kamerasını kullanarak videoyu kaydedin. Akış hızının başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlamak.Uygun yazılımı kullanarak kap çapını ölçün ve elde edilen görüntülerde gemi boyunca iki sabit nokta arasındaki mesafeyi belirleyin. Yazılımdaki kan akışı videosunu açın ve görüntülerin ölçeğini ayarlayın. İzleme işlevini kullanarak seçilen DiO lekeli kan hücrelerini izleyin.Ardından, akış hızının otomatik olarak hesaplanması için hücrelerin hareket ettiği mesafeyi ve videodaki görüntü kareleri arasındaki zaman aralığını kullanın. Metin yazısında verilen denklemi kullanarak hacimsel akışı hesaplayın. Kan akışı kaydından önce gürültüye maruz kalma modelini oluşturmak için, hayvanları tel örgü kafeslere yerleştirin ve üç saat boyunca bir ses maruz kalma kabininde 120 desibel ses basıncı seviyesinde geniş bant gürültüsüne maruz bırakın.Sonra ertesi gün üç saat daha. Gürültüye maruz kaldıktan iki hafta sonra kan akışını kaydedin. Lateral duvardaki koklear kılcal damarların cerrahi maruziyetinden sonra, FITC Dextran etiketli damarlardaki DiL etiketli kan hücrelerinin intravital yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobik gözlemi açık bir damar penceresinden gerçekleştirildi.FITC Dextran ile etiketlenmiş Stria damarlarındaki DiL etiketli kan hücreleri burada gösterilmiştir. FITC Dextran ile etiketlenmiş Dio etiketli kan hücreleri, spiral ligamentin damar yoğunluğunun daha yoğun Stria vascularis'inkinden daha seyrek olduğunu göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü IVM, kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış modellerini gösterir.Gürültüye maruz kalan gruplarda bozulmuş kan dolaşımı paterni görülebilir. Anomaliler arasında damar çapının azalması ve damar çapının artması sayılabilir. Kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış hızları, DiO etiketli kan hücrelerinin kökleri izlenerek hesaplandı.Gürültüye maruz kalan gruptaki kan hızı ve hacmi kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşüktü. Açık damar penceresinin başarılı bir şekilde kurulması, yüksek derecede cerrahi beceri gerektirir. Koklear lateral duvarın kemiğinin çıkarılmasına özen gösterilmelidir.

measurement-strial-blood-flow-mouse-cochlea-utilizing-an-open-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

Kortikal kan akımı dinamikleri 2-foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte görüntüleme floresan dekstran boyalar in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl gösterir.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Bu video, bir fare modelinde trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu tekniğini göstermektedir. Fareye, kan dolaşımını izlemek için florofor etiketli bir polisakkarit enjekte edilir. Yüksek yoğunluklu bir ışıkla aydınlatıldıktan sonra, kulağın mikro damar sistemindeki bir yaralanmanın fototoksik indüksiyonu, kan akışındaki tıkanıklığın görselleştirilmesiyle doğrulanan bir trombüs oluşumuna yol açar.

Mikrovasküler Trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

İntravital mikroskopi, hayvanlarda retina vasküler çaplarını, kan dolaşım hızlarını ve toplam retinal kan akışını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılabilir.

Farelerde Retinal Kan Akışının İntravital Video Mikroskobu Ölçümleri

Bu makale, görüntü elde etme ve analiz için özel bir metodoloji ile birlikte intravital mikroskopi görüntüleme kullanılarak fare karaciğer damar sisteminin tek tek kan damarları içindeki kan akış hızının dinamik ölçümü ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir yöntem hakkında ayrıntılı bir yöntem hakkında rapor vermektedir.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Göz dolaşımındaki etiketli kan hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi, diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyonda inflamasyon ve iskemi hakkında bilgi sağlayabilir. Kan hücrelerini etiketlemek ve retinal dolaşımda etiketli hücreleri imal etmek için bir protokol tarif edilmiştir.

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Fare retinal damar sistemi, vasküler patern oluşumunun mekanizmalarını anlamada özellikle ilgi çekicidir. Bu protokol, optik diskten sabit bir mesafede floresan anjiyografi fundus görüntülerinden fare retina damarlarının çapını otomatik olarak ölçer.

Fare Floresan Anjiyografi Görüntülerinden Retina Damar Çapının Ölçülmesi

Keşfedin fare kokleasında strial kan akışını ölçme yöntemini. Açık damar penceresi ve intravital floresan mikroskobu kullanılarak işitme bozukluklarının kan akışı patolojisiyle ilişkisini araştırın.

Açık Damar Penceresi ve İntravital Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Kokleasında Strial Kan Akışının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet