Name: Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Öğrenin lazer kullanmadan hidroksil radikal protein ayak izi yöntemini, gerçek zamanlı dozimetri ile protein etkileşim bölgelerini belirlemek için. Bu yöntem protein yapı ve stabilite çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R43GM125420 ve R44GM125420) tarafından finanse edildi.

1. Kılcal borunun takılması
<ol><li>Bir silika dekolte taşı kullanarak, 250 μm iç çap (ID) silika kılcal damarı 27 inç'e bölün. Kılcal uçları temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.</li>
	<li>Poliimid kaplamayı yakarak kabaca 15 mm uzunluğunda iki pencere oluşturun. "Alt uçtan" başlayarak, ilk fotoliz penceresini "alt uçtan" 90 mm ve ikinci dozimetre penceresini "alt uçtan" 225 mm uzağa yapın. NOT: Kaplama yandıktan sonra kılcal damar çok kırılgandır.</li>
	<li>5 numaralı bağlantı noktasındaki somunu ve yüksükleri sökün ve kılcal damarın "alt ucunu" yüksük konik ucunun hemen ötesine yerleştirin (Şekil 1A).</li>
	<li>Fotoliz modülünde, fotoliz hücre kapağını doğrudan dışarı çekerek çıkarın ve ardından kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş metal maskeyi çıkarın. DİkKAT: Fotoliz hücre kapağının içinde kavisli bir ayna vardır, aynaya hiçbir şeyin dokunmasına izin vermeyin.</li>
	<li>Dozimetre modülünde, soldaki sekmeye basarak dozimetre hücresini açın ve dozimetre hücresini sağa doğru açın. Kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş klipsleri çıkarın.</li>
	<li>Kılcal damarı fotoliz hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin. Kılcal pencereyi fotoliz hücre penceresiyle ortala. Kılcal damarı tek elle yerinde tutarken, kılcal damarı yerinde tutmak için manyetik maskeyi ekleyin. Fotoliz kapağını yerine yerleştirin.</li>
	<li>Kılcal damarı dozimetre hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin. İkinci kılcal pencereyi dozimetre hücre tabanının ortasındaki küçük diyafram açıklığına ortala. Kılcal damarı bir elinizle yerinde tutarken, iki manyetik klipsi kılcal damarı yerinde tutacak şekilde yerleştirin. Dozimetre hücresini kapalı tıklatana kadar kapatın.</li>
	<li>Kılcal damarları, ürün toplayıcının kılcal asansörün üzerine tırtıklı somundan geçirin (Şekil 1B). Kılcal damarı şişenin hemen üstüne uzatın. NOT: Kılcal damarın şişenin dibine ulaşması, bir deney çalıştırırken kılcal damarın söndürme çözeltisine batırılmasını sağlamak için önemlidir.</li>
</ol>2. Enjeksiyon döngüsü takma
<ol><li>Dış çapı 1/16" ve iç çapı 0,015" (381 μm) olan Teflon boru kullanın. Denklem 1'i takip ederek istenen hacim için gereken boru uzunluğunu hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> L'nin milimetre cinsinden boru uzunluğu olduğu durumlarda, V mikrolitrelerde istenen hacimdir ve d milimetre cinsinden tüp iç çapıdır. 25 μL enjeksiyon hacmi ve 381 μm iç çap için boru uzunluğunun kabaca 219,3 mm olması gerekir. NOT: 20 μL'den küçük hacimler için iç çapı 0,01" olan PTFE boru kullanın.</li>
	<li>Teflon boruyu bir tüp kesici kullanarak gerekli uzunluğa kadar kesin. Tüpün uçlarını temiz ve düz bir kesik için kontrol edin.</li>
	<li>Yeni enjeksiyon döngüsünün bir ucunun somunlarından bir ucuna yerleştirin ve tüpün ucuna yeni bir yüksük yerleştirin. Yüksük ve somunu yerinde tutun ve tüpü valfte dibe vurana kadar enjeksiyon vanasının 3 numaralı portuna yerleştirin. Tüpü sıkıca tutun ve somun parmağını sıkıca sıkın. Bir anahtar kullanarak, somunu 1/4 daha fazla sıkın. Montajı çıkarın ve inceleyin. NOT: Yüksük sabit değilse, 1/8'i yeniden yükleyin ve sıkın. Döngünün diğer ucuyla tekrarlayın.</li>
	<li>Her iki ucu da somun ve sabit yüksük olduğunda, bir ucunu 3 numaralı bağlantı noktasına, diğer ucunu da bağlantı noktası 6'ya(Şekil 1C)gevşek bir şekilde vidalayın. Pozisyona girdikten sonra her iki tarafı da sıkılaştırarak parmak sıkın, ardından 1/4'ü bir İngiliz anahtarıyla parmağınızı sıkıca geçin.</li>
</ol>3. Fotoliz sistemini başlatın
<ol><li>Fotoliz modüllerini aşağıdaki sırayla açın: (1) Akışkanlar Modülü (2) Fotoliz Modülü (3) Dozimetri Modülü (4) Ürün Toplayıcı ve son olarak (5) sistem bilgisayarı ve kontrol yazılımını başlatın NOT: Dozimetre Modülünün soğuk bir başlangıçtan itibaren ısınması için en az yarım saat izin verin.</li>
	<li>Şırınna pompası üzerindeki "Valf" konumundan boruyu tamamen10mL tampona batırın. Boruyu "Atık" konumundan (Şekil 1D) ve boruyu şırınna bağlantı noktası üzerindeki 2 numaralı bağlantı noktasından (Şekil 1C) atıkları toplamak için boş bir kaba yerleştirin. NOT: Proteininizin askıya alacağı tamponu kullanın. Önerilen arabellek 10 mM NaPO4 'dür.</li>
	<li>Ürün Toplayıcı atlıkarıncasına, 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini H ve 6 olarak işaretlenmiş konuma yerleştirin.</li>
	<li>250 μm ID kılcal damar kullanıyorsanız, yük akış hızını 500 μL/dak, işleme akış hızını 7,5 μL/dak ve atık akış hızını 500 μL/dak olarak ayarlayın.</li>
	<li>Denklem 2'yi kullanarak Yarı Otomatik Modu kullanmak için flaş gecikmesini, ürün süresini ve zaman kaybetmeyi hesaplayın. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Burada t dakika cinsinden zaman, s milimetre cinsinden kılcal mesafe, d milimetre cinsinden kılcal damarın iç çapı ve f μL / dak'taki akış hızıdır.<ol>
<li>Flaş gecikmesi için, mesafe kılcal damarın "alt ucundan" kabaca 90 mm olması gereken ilk pencereye kadardır. 250 μm ID kılcal damar ve 7,5 μL/ dk işlem akış hızı kullanarak örnek yaklaşık 35 saniye içinde fotoliz penceresine ulaşacaktır. Numuneler gelmeden önce 1 Hz'de iki flaşın oluşmasına izin verin, bu nedenle flaş gecikmesini 33 saniye olarak ayarlayın.</li>
		<li>Ürün süresi için, enjekte edilen çözeltinin enjeksiyon vanasından kılcal damarın sonuna kadar akması için gereken süreyi girin. 27" uzunluğunda 250 μm ID kılcal damar için ürün süresini 4,5 dakika olarak ayarlayın.</li>
		<li>Boşa harcanan zaman için, enjekte edilen çözeltinin toplam hacminin toplanması için gereken süreyi girin. Şu anda, ürün toplayıcı ürün konumundan atık şişeye geçecektir. 25 μL enjeksiyon hacmi ve 7,5 μL/dk akış hızı için atık süresini 7,8 dakika olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyon vanası yük konumuna ayarlanmış olarak enjekte etme portuna 25 μL HPLC sınıfı su enjekte ederek enjeksiyon döngüsünü beş kez durulayın.</li>
	<li>Sistemin geri kalanını yıkamak için enjeksiyon vanasını manuel olarak 'enjeksiyon konumuna' getirin. Akan suya başlamak için kontrol yazılımında İşlem (Çıkış) seçeneğini belirleyin. Akarken, ürün toplayıcının altında Yukarı'yı seçerek ürün toplayıcı kılcal kaldırmayı kaldırın, böylece kılcal damarın ucunun görebilirsiniz. Bir damlacık oluşana kadar kılcal damardan su akışı. NOT: Bir damlacık oluşmazsa, enjektör valfini sızıntılara karşı kontrol edin. Bir sızıntı varsa, somunu gevşetin, kılcal damarı yeniden takın ve yeniden ısıtın.</li>
</ol>4. Tampondan radikal atma etkilerini test etmek için gerçek ▪OH verimini belirleyin.
<ol><li>Denetim Yazılımı'nda, İşlem (Çıkış)öğesini seçerek akışı başlatın. Ayarlar sekmesinde flaş voltajını 0 V olarak ayarlayın. Dozimetre verileri bölümündeki El ile Kontrol sekmesinin altında Verileri Başlat + Otomatik Sıfır 'ıseçin.</li>
	<li>Ürün şişesi (H) ve atık şişe (6) için pozisyonu seçin.</li>
	<li>Hazır'ıseçin, enjeksiyon vanasını manuel olarak yük konumuna getirin ve enjeksiyon portuna 100 mM H 2 O 2 ile25 μL1 mM Adenine enjekte edin. Enjekte edildikten sonra, enjeksiyon vanasını manuel olarak enjekte konumuna getirin. NOT: Bu, akışı başlatmak, plazma kaynağını açmak ve dozimetri verilerini almak için sistemi otomatik olarak tetikler.</li>
	<li>Ayarlar sekmesine gidin ve flaş voltajını değiştirerek voltajı artırın. 500 V, 750 V, 1000 V ve 1250 V kullanarak 4.2 ve 4.3 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Her örneğin ortalama emiciliğini belirlemek için hesaplamalar sekmesini seçin. İlk olarak, Seç'i tıklatın, sonra tepe emiciliğinin başlangıcını ve sonunu el ile seçin. Kullanılabilir alana, örneğin bir açıklamasını yazın. Elde edilen tüm veriler için yineleyin. NOT: Kabarcıklar dozimetre okumasında bir artışa neden olabilir. Ortalama emiciliği belirlemek için veri seçerken kabarcıklı alanları atla.</li>
	<li>Her voltaj için adenin emiciliğindeki ortalama değişimi hesaplamak için Excel'de verileri kopyalayıp yapıştırın, böylece etkili ▪OH verimini belirler.</li>
	<li>Her durum için etkili ▪ OH verimini normalleştirmek için birden fazla örnek koşul (farklı tampon/katkı maddeleri) kullanılıyorsa, 4.1-4.6adımlarını yineleyin.</li>
</ol>5. Daha yüksek düzen yapısındaki değişiklikleri tespit etmek için proteinin değiştirilmesi.
<ol><li>2 mM adenin ve 10 μM protein içeren bir çözelti yapmak için 4 mM adenin ile 20 μM proteini bire bir oranında karıştırın.</li>
	<li>Kalan radikalleri söndürmek için fazla hidrojen peroksit ve 35 mM methionine amide parçalamak için 0.3 mg/mL katalaz kullanarak söndürme çözeltisini yapın. Aliquot 25 μL söndürme çözeltisi 200 μL mikrotüp içine solüsyon, böylece eşit miktarda söndürme ve etiketli ürün karıştırılır.</li>
	<li>H 2 O2ila200 mM'yi seyreltin ve buzda tutun.</li>
	<li>Ayarlar sekmesindeki Kontrol Yazılımı'nda, herhangi bir arka plan oksidasyonunu belirlemek için flaş voltajını 0 V'ta başlatın.</li>
	<li>Manuel kontrol sekmesinde, Verileri Başlat + Otomatik Sıfırla'yı seçin, ardından İşlem (Çıkış)ve ardından Hazır'ı seçin ve son olarak enjeksiyon vanasını yük konumuna getirin.</li>
	<li>Ürün toplama atlıkarıncasının 1 konumuna bir söndürme çözeltisi yerleştirin. Sistem Kontrol Yazılımı'nda ürün şişesini 1 olarak değiştirin.</li>
	<li>Enjeksiyondan hemen önce, 12,5 μL adenin ve protein karışımını 12,5 μL H2O 2 ile karıştırarak1 mM Adenin, 5 μM protein ve 100 mM H 2 O2konsantrasyonu yapın. Karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet, hızlı bir şekilde aşağı döndürün ve karıştırmadan sonraki 10 saniye içinde enjeksiyon portu kullanarak 25 μL enjekte edin.</li>
	<li>Enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin ve numune işlenirken bekleyin.</li>
	<li>500 V, 750 V, 1000 V ve 1250 V ile tekrar edinim.</li>
	<li>Adım 4.5'te açıklandığı gibi ortalama emiciliği hesaplayın. Tüm verileri kopyalayıp Excel'e yapıştır.</li>
</ol>6. Sistemi kapatın
<ol><li>Tüm numuneler toplandıktan sonra, enjeksiyon vanasını yük konumuna indirerek şırınma portunu ve numune döngüsünü boşaltın ve beş kez 25 μL HPLC suyu enjekte edin.</li>
	<li>Sistemin geri kalanını HPLC suyuyla yıkamak için enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin.</li>
	<li>Akışı durdurun, sistem kontrol yazılımını kapatın ve ürün toplayıcı, dozimetre modülü, fotoliz modülü ve son olarak akışkanlar modülü ile başlayan modülleri kapatın.</li>
</ol>7. Numune hazırlama ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi
<ol><li>50 mM Tris ve 1 mMCaCl2 varlığında 20 dakika boyunca 80 °C'de numuneleri inkübe ederek proteini denatüre edin. Numuneleri oda sıcaklığına soğutin ve proteine 1:20 trypsin ekleyin. Numune karıştırma ile proteini 37 °C'de bir gecede sindirin. Ertesi sabah, trypsin sindirimi numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtarak sonlandırın.</li>
	<li>UPLC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü bir LC-MS/MS sistemi kullanarak peptitleri tespit edin.</li>
	<li>Numuneyi ilk olarak bindirme kolonuna yükleyin (300 μm ID X 5 mm 100 şgözenek boyutu, 5 μm partikül boyutu) ve %2 solvent B (asetonitril ve% 0,1 formik asit) içeren su ile 3 dakika boyunca 5,0 μL /mL'de yıkayın.</li>
	<li>Peptitleri bir C18 nanokolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm parçacık boyutu, 100 şgözenek boyutu) üzerindeki peptitleri solvent A (%0,1 formik asit içeren su) ve solvent B arasında bir gradyan ile 300 nL/dk akış hızında ayırın. Peptit salınımı için gradyan, 22 dakika boyunca% 2'den% 35 B'ye doğrusal bir artıştan oluşur, 5 dakika boyunca% 95 B'ye rampalanmış ve sütunu yıkamak için 3 dakika boyunca tutulur ve daha sonra 3 dakika boyunca% 2 B'ye geri döner ve sütunu yeniden eşit hale getirmek için 9 dakika tutulur.</li>
	<li>Verileri pozitif iyon modunda alın. Püskürtme voltajını 2400 V'a ve iyon transfer tüpünün sıcaklığını 300 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>250-2000 m/z'den tam MS taramalarını ve ardından en bol sekiz peptit iyonunda sekiz veriye bağımlı MS/MS taraması alın. Peptitleri parçalamak için 5 normalleştirilmiş enerjide çarpışma kaynaklı ayrışma kullanın.</li>
	<li>Protein dizisini ve ilgili proteolitik enzimi içeren gerekli FASTA dosyasına karşı mevcut bir protein analiz yazılımı kullanarak MS/MS analizinden tespit edilen tüm değiştirilmemiş peptitleri tanımlayın.</li>
	<li>HRPF Veri İşleme Yazılımı kullanarak değiştirilmiş peptitleri arayın ve ölçün. Tanımlanan her peptit için oksidasyonun kapsamı, değiştirilmiş bir peptitin toplam kromatografik tepe alanının, denklem 3 kullanılarak değiştirilen ve değiştirilmeyen peptitin toplam kromatografik tepe alanına bölünmesiyle hesaplanır. P = [I(tekli oksitlenmiş) X 1 + I (iki kat oksitlenmiş) X 2 + I(triply oksitlenmiş) X 3 + .../[Iunoxidized + I(tekli oksitlenmiş) + I(iki kat oksitlenmiş) + I( üçkat oksitlenmiş) ...] Burada P, peptid molekülü başına ortalama oksidasyon olay sayısını gösterir ve benoksidize peptid(Iunoxidized)ve n oksidasyon olayları ile peptidin tepe alanını temsil ederim.</li>
</ol>8. Bir diferansiyel çalışma için, ikinci koşulda 5-7 arası adımları tekrarlayın.
NOT: Tekrarlanabilirliği doğrulamak için, her durum için teknik üç taraflılıklara ek olarak iki biyolojik çoğaltma önerilir.

<ol><li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li>
<li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe%3A+a+regulatory+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Generics+and+Biosimilars+Initiative+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li>
<li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Society%22%5BJournal%5D)">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li>
<li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data%3A+starting+a+new+dialogue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li>
<li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding%3A+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li>
<li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li>
<li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+for+Higher+Order+Structure+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li>
<li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li>
<li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li>
<li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li>
<li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+targeting+the+%CE%B2-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li>
<li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136(2018).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins%3A+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li>
<li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li>
<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins%28FPOP%29%3A+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li>
<li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li>
<li>Linde. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Linde+Specialty+Gases+of+North+America%22">Linde Specialty Gases of North America</a>. , (2009).</li>
<li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li>
<li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li>
<li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87(2019).</li>
<li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498(2020).</li>
<li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li>
<li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis%3A+Fundamentals+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355(2020).</li>
<li>Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum">http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum</a> (2016).</li>
<li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody%2FInterleukin-23+Interaction+with+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange%2C+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry%2C+and+Alanine+Shave+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li>
<li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li>
<li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+paramyxovirus+fusion+%28F%29+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li>
<li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris%28hydroxymethyl%29aminomethane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li>
<li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li>
<li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li>
</ol>

E.E.C., J.S.S., ve S.R.W., daha yüksek düzey protein yapısı analizi için teknolojileri ticarileştirmek isteyen erken aşama bir şirket olan GenNext Technologies, Inc.'e önemli bir finansal ilgiyi açıklamamaktadır. Sağlanan temsili veriler, finansal çıkar çatışması olmayan S.K.M.

Herhangi bir HRPF deneyi sırasında proteinlerin doğru etiketlenebilmesini sağlamak için birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, numunenin her bolusunun bir kez ışınlandığını emin olmak için uygun bir akış hızı ve kaynak flaş hızı seçilir. Bu, proteinin yeni oluşan ▪OH'nin tek bir bolus'una maruz kalmasını sağlar. Bir protein oksitlendikten sonra, daha yüksek sıralı protein yapısı değiştirilebilir. Yerli protein yapısının araştırıldığından emin olmak için, her protein molekülü tek bir anda değiştirilmelidir. Doz...

Protein uyumu ve ilişkili yüksek düzen yapısı (HOS) uygun biyolojik fonksiyonun ve sapkın davranışın temel belirleyicileridir1. Aynı şey, yapısı ve fonksiyonel aktivitesi üretim ve çevrelerinin çeşitli yönlerine bağlı olan biyofarmasötikler için de geçerlidir. HOS'taki biyofarmasötik değişim, istenmeyen farmakoloji ve hasta immünolojik yanıtına atfedilen advers ilaç reaksiyonları (ADR) ile bağlantılıdır2,3. ADR'lerin ortaya çıkışı, biyofarmasötik endüstrisini protein HOS'un biyoterapötiklerin güvenliğinde ve verimliliğinde oynadığı kritik role karşı uyarmıştır ve yeni ve geliştirilmiş HOS analitiği ihtiyacını ortaya atmıştır4.
Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein HOS'taki değişimi izlemek için umut verici bir tekniktir. HRPF, proteinin5,6,7çözücü erişilebilir yüzeyini tanımlamak için kütle spektrometresi (MS) analizi ile takip edilen ▪OH ile bir proteinin dış yüzeyinin geri dönüşü olmayan etiketlemesini içerir. HRPF, protein HOS ve işlevi8 ,9,monoklonal antikorların HOS'u (mAb)10,11, 12,13,bir ligand14'ünbağlayıcı Kd'sini belirlemek ve çok daha fazlası15, 16,17,18,19'u karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. HRPF için ▪OH'yi oluşturmak için yaygın bir yöntem, H 2 O2fotolizisinden ▪OH üretmek için yüksek enerjili, hızlı UV lazerler kullanan Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonudur (FPOP). Çoğunlukla, FPOP solunum ve göz yaralanmalarını önlemek için önemli önlemler gerektiren tehlikeli gaz (KrF) kullanan pahalı excimer lazerler kullanır20. Soluma tehlikelerini önlemek için, diğerleri frekans dörtlü neodimyum alümünyum garnet (Nd:YAG) lazerlerikullandılar 21Toksik gaz kullanımını ortadan kaldırır, ancak hala maliyetlidir, önemli operasyonel uzmanlık gerektirir ve kullanıcıları göz yaralanmasından korumak için kapsamlı başıboş ışık kontrolleri talep eder.
HRPF kullanılarak geniş bilgi elde edilebilse de, biyofarmada geniş benimseme karşılanmadı. Sınırlı HRPF benimsemesi için iki engel şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı20; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility22. Lazer kullanımını desteklemek için, FPOP'u facile bir şekilde güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için yüksek hızlı, yüksek enerjili plazma flaş fotoliz ünitesi geliştirilmiştir. HRPF deneylerinin geri alınamazlığını geliştirmek için gerçek zamanlı radikal dozimetri uygulanır.
HRPF uygulaması, ▪OH22'ninarka plan çöplüğüne atfedilen geri alınamazlık ile sınırlanmıştır. ▪OH mükemmel protein topografyası probları olsa da, preparatlarda bulunan birçok bileşenle de reaksiyona girerek, hedef proteini oksitlemek için mevcut olan radikalin etkili konsantrasyonunun ölçülmesi gerekir. Tampon hazırlama, hidrojen peroksit konsantrasyonu, ligand özellikleri veya fotolizdeki varyasyonlar, HOS diferansiyel çalışmalarında belirsizlik yaratan kontrol ve deneysel gruplar arasında oksidasyon farklılıklarına neden olabilir. Gerçek zamanlı radikal dozimetrinin eklenmesi, OH yükü ▪etkinin ayarını sağlar ve bu nedenle bir HRPF deneyi sırasında güveni ve tekrarlanabilirliği arttırır. FPOP'ta radikal dozimetri kullanımı başka bir yerde açıklanmıştır23,24,25, ve yakın tarihli bir yayında daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır26. Burada, bir FPOP deneyindeki peptit oksidasyon seviyelerini bir ekscimer lazer kullanırken elde edilenlerle karşılaştırarak at apo-myoglobin 'i (aMb) etiketlemek için yeni bir flaş fotoliz sistemi ve gerçek zamanlı dozimetri kullanımını açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>herhangi bir marka yeterlidir</td></tr><tr><td>50 &mikro; L SGE Gaz Geçirmez Şırıngalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Beğeni PepMap 100 C18 nanokolon (0,75 mm X 150 mm, 2 & m)</td><td></td>% 0.1 Formik Asit (v / h) içeren Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, LC / MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomyoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Görev Silecekleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>herhangi bir %30 hidrojen peroksit yeterlidir</td></tr><tr><td>Metiyonin amid</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Füzyon Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Füzyon Lumos Tribrid Kütle Spektrometresi</td><td>diğer yüksek çözünürlüklü cihazlar (örneğin Q exactive Orbitrap veya Orbitrap Fusion)</td></tr> kullanılabilir <tr><td>Pierce Tripsin Proteaz, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Yarma Taşı, 1 "x 1" x 1/32 "</td><td>Molex</td><td></td><td>1068680064 herhangi bir kılcal boru kesici yeterlidir</td></tr><tr><td>%0,1 Formik Asit (h/h) içeren</td> UPLC Thermo Scientific <td></td><td></td> Su, LC/MS Sınıfı Fisher Scientific LS118-500 <td></td></tr><tr><td>Su, LC/MS Sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteinlerin daha yüksek sıralı yapısal analizini gerçekleştirmek için lazersiz hidroksil radikal protein ayak İzi

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein yapısındaki değişiklikler, protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri hakkında bilgi sağlayan gelişmekte olan ve umut verici bir yüksek sıralı yapısal analiz tekniğidir. HRPF, bir proteinin çözücü erişilebilir yüzeyini geri döndürülemez bir şekilde etiketlemek için hidroksil radikalleri(▪OH) kullanır. HRPF gerçekleştirmenin doğasında var olan karmaşıklık, maliyet ve tehlikeli doğa, biyofarmada geniş tabanlı benimsemeyi önemli ölçüde sınırladır. Bu faktörler şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren karmaşık, tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility. Bu yayın, lazersiz bir HRPF sisteminin çalışması için bir protokol sağlar. Bu lazersiz HRPF sistemi, sıralı radikal dozimetriye sahip yüksek enerjili, yüksek basınçlı plazma ışık kaynağı flaş oksidasyon teknolojisini kullanır. Plazma ışık kaynağı lazer tabanlı HRPF sistemlerine göre hidroksil radikalleri üretmede daha güvenli, kullanımı daha kolay ve daha verimlidir ve hat içi radikal dozimetre çalışmaların tekrarlanabilirliğini artırır. Lazersiz HRPF sistemi, lazer tabanlı tekniklerin belirtilen eksikliklerini ve sınırlamalarını bir araya getirdiğini ve adını ortaya çıkarmaktadır.

Gerçek zamanlı dozimetri ile birleştirilen yüksek basınçlı plazma kaynağı, daha yüksek dereceli protein yapısındaki değişiklikleri daha doğru bir şekilde gözlemlemek için ▪OH veriminin daha iyi kontrol etmesini sağlar. Adenin eklenmesi etkili bir gerçek zamanlı radikal dozimetre sağlar. Oksidasyon üzerine, adenin UV emiciliğini 265 nm'de kaybeder(Şekil 2A). Adenin emiciliğindeki değişiklik, HRPF için mevcut olan radikallerin konsantrasyonu ile doğrudan ilgilidir, böylece tamponlar...

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Lazersiz hidroksil radikal protein ayak izi, protein etkileşim alanlarını ve onay değişim bölgelerini tanımlamayı çok daha kolay hale getirerek protein toplama, yapı ve stabilite çalışmalarındaki araştırmaları hızlandırır. Satır içi radikal dozimetri ile kullanıcılar etkili hidroksil radikal yükünü gerçek zamanlı olarak ayarlayabilir ve gerçek zamanlı radikal dozimetri ile etiketleme tekrarlanabilirliğini geliştirirken deneysel zamandan ve değerli numuneden tasarruf edebilirsiniz. Başlamak için, 250 mikrometre iç çaplı silika kılcal damarı bir silika sıkma taşı ile 27 inç'e bölün, kılcal damarın uçlarını temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.Kabaca 15 milimetre uzunluğunda iki pencere oluşturun. Kılcal damarın alt ucundan, fotoliz penceresini oluşturmak için poliimid kaplamayı 90 milimetre ve dozimetre penceresi için 225 milimetreyi yakın. Kılcal damarın alt ucunu bir somun ve yüksük konik ucunun hemen ötesine yerleştirin.Kılcal damarı beş numaralı bağlantı noktasına ekleyin, parmağın hemen ötesinde bir anahtarla sıkın. Fotoliz modülünün fotoliz hücre kapağını doğrudan dışarı çekerek çıkarın, ardından kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş metal maskeyi çıkarın. Soldaki sekmeye basarak dozimetre hücresini açın ve dozimetre hücresini sağa doğru açın.Kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş klipsleri çıkarın. Daha sonra kılcal damarı fotoliz hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve kılcal pencereyi fotoliz hücre penceresiyle ortala. Kılcal damarı yerinde tutun ve manyetik maskeyi ekleyin.Fotoliz kapağını yerine yerleştirin. Kılcal damarı dozimetre hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve ikinci kılcal pencereyi dozimetre hücresinin ortasındaki küçük diyafram açıklığına ortala. Kılcal damarı bir elinizle yerinde tutarken, iki manyetik klipsi kılcal damarı yerinde tutacak şekilde yerleştirin.Dozimetre hücresini kapalı tıklatana kadar kapatın. Son olarak, kılcal damarı ürün toplayıcının kılcal kaldırmasının üzerine tırtıklı düğmeden geçirin ve kılcal damarı şişenin tabanının hemen üstüne uzatın. Bir kesici kullanarak teflon borunun istenen uzunluğunu kesin ve uçlarını temiz bir düz kesim için kontrol edin.Yeni enjeksiyon döngüsünün bir ucunun bir ucunun somunlardan birine yerleştirin ve tüpün ucuna yeni bir yüksük yerleştirin. Boruyu enjeksiyon vanasının altıncı portuna yerleştirirken somunu ve yükseği, dibe vurana kadar yerinde tutun. Somunu bir İngiliz anahtarı ile sıkın, ardından somun ve yüksüklerin güvenli bir şekilde yerinde olduğunu onaylayın.Her iki ucu da bir somun ve sabit yüksük olduğunda, bir ucunu üç numaralı bağlantı noktasına ve diğer ucunu altı numaralı bağlantı noktasına gevşek bir şekilde vidalayın. Pozisyon aldıktan sonra, her iki tarafı da sıkıca parmakla sıkın, ardından çeyrek bir anahtarla parmağı sıkıca geçin. Akışkanlar modülini başlatarak lazersiz HRPF sistemini açın, ardından fotoliz modülü, dozimetre modülü, ürün toplayıcı ve sistem bilgisayarı.Sistem yazılımını başlatın. Boruyu şırınna pompasının valf konumundan 10 mililitre tampona tamamen batırın. Boruyu atık konumundan ve boruyu şırınna limanındaki ikinci bağlantı noktasından boş bir kaba yönlendirerek atık toplayın.Ürün toplayıcı atlıkarınca üzerinde HN6 işaretli konuma 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Valf yük konumuna ayarlanmış 25 mikrolitre HPLC sınıfı su enjekte ederek enjeksiyon döngüsünü beş kez durulayın. Sistemin geri kalanını yıkamak için enjeksiyon vanasını manuel olarak çevirin.Damlacık oluşana kadar akan suya başlamak için kontrol yazılımında İşlem'i seçin. İki milimoler adenin ve 10 mikromoler protein içeren bir çözelti yapın. Daha sonra mililitre katalaz başına 0,3 miligram ve 35 milimoler metianine amide kullanarak bir söndürme çözeltisi yapın.Aliquot 25 mikrolitre söndürme çözeltisi 200 mikrolitre mikro tüp içine. Hidrojen peroksit 200 milimolar seyreltin ve buzda tutun. Flaş voltajını kontrol yazılımında sıfır voltta başlatın.Bu sıfır volt kontrolü, ilgi proteini üzerindeki herhangi bir arka plan oksidasyonunu belirleyecektir. Verileri Otomatik Sıfırla'yı başlat'ı ve ardından İşlem'i ve ardından Hazır'ı seçin. Son olarak, enjeksiyon vanasını yük konumuna getirin.Söndürme solüsyonunu ürün toplayıcı atlıkarıncasına yerleştirin, ardından ürün şişesini sistem kontrol yazılımında bire değiştirin. Enjeksiyondan hemen önce, adenin ve protein karışımının 12,5 mikrolitresini 12,5 mikrolitre hidrojen peroksit ile karıştırın. Karışımı karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, sonra hızla aşağı çevirin.Karıştırmadan sonraki 10 saniye içinde enjeksiyon portu kullanarak bu çözeltinin 25 mikrolitresini enjekte edin. Enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin ve numune işlenirken bekleyin. Flaş voltajını kontrol yazılımında 750 volta açın ve etiketleme adımlarını tekrarlayın.Ardından her numunenin emiciliğini kaydedin. İlk olarak, Seç'i tıklatın, sonra tepe emiciliğinin başlangıcını ve sonunu el ile seçin. Kullanılabilir alana, örneğin bir açıklamasını yazın.Elde edilen tüm veriler için bunu yineleyin. Her voltaj için adenin emiciliğindeki ortalama değişimi hesaplamak için verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, enjeksiyon vanasını yük konumuna indirerek şırınga portunu ve numune döngüsünü boşaltın ve beş kez 25 mikrolitre HPLC suyu enjekte edin.Sistemin geri kalanını HPLC suyuyla yıkamak için enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin. Temizlendikten sonra akışı durdurun, sistem kontrol yazılımından çıkın ve ürün toplayıcı, dozimetre modülü, fotoliz modülü ve son olarak akışkanlar modülü ile başlayarak modülleri kapatın. Oksidasyon üzerine, dozimetri için kullanılan adenin 265 nanometrede UV emiliminde azalır.Buffer 2, Tampon 1'e kıyasla adenin absorbansındaki değişimi azaltan radikal bir çöpçü içerir. Apomyoglobin, hidrojen peroksit ve adenin varlığında dört artan plazma lamba geriliminde modifiye edildi. 265 nanometrede adenin emiliminin değişimine bağlı olarak oksidasyonda doğrusal bir artışla altı peptit tespit edildi.Bu altı oksitlenmiş peptit miyoglobin kristal yapısı üzerinde etiketlenmiştir. Yüksek basınçlı plazma lambadan tespit edilen oksidasyonun boyutu lazer tabanlı yöntemden çok daha yüksektir. Bu artış, yüksek basınçlı plazma lambasının geniş spektrumlu UV emisyon spektrumundan kaynaklanmaktadır.Geniş bir UV spektrumu üreterek, yüksek basınçlı plazma lambası hidrojen peroksitin absorbans alanıyla daha iyi örtüşür ve kr F Excimer Laser ve Nd YAG Laser ile karşılaştırıldığında hidrojen peroksitin fotolizi yoluyla hidroksil radikallerinin daha verimli bir şekilde üretilmesine neden olur. Yüksek basınçlı plazma lamba, hidroksil radikallerinin üretimini kr F Excimer Lazer kullanılarak tipik olarak gözlemlenenin ötesinde önemli ölçüde artırır. 100 milimoler peroksit kullanmak yüksek düzeyde arka plan oksidasyonuna neden olabilir.Protein sistemi peroksit kaynaklı oksidasyona duyarlıysa, konsantrasyonu 10 milimolar kadar düşürür. HRPF'nin geri dönüşü olmayan etiketi, uzun proteaz sindirimi de dahil olmak üzere aşağı akış numune işlemeye izin verir, çoklama için birlikte kütle etiketi ekleyebilir ve 2D kromatografi yapabilirsiniz, hepsi peptit algılamasını iyileştirir ve yapısal bilgileri birleştirir.

laser-free-hydroxyl-radical-protein-footprinting-to-perform-higher

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol, Mg (II) bağlı hidroksil radikal footprinting iki yöntem RNA üçüncül yapısının oluşumu ölçmek için nasıl kullanılacağını açıklar.

RNA Yapısı &#39;peroksidatif&#39; ve &#39;Oksidatif&#39; Hidroksil Radikal footprinting İzleme Denge Değişiklikler

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Protein yapı ve dinamikleri protein yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için anahtardır. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte hidrojen alış veriş proteinlerin konformasyonel dinamiklerini incelemek ve temas arayüzler ve allosterik etkileri de dahil olmak üzere protein-ligand ve protein-protein etkileşimleri, karakterize için çok yönlü bir yöntemdir.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IV-FPOP) kendi doğal ortamında protein yapısının haritalanması için izin veren bir hidroksil radikal protein ayak izi tekniğidir. Bu protokol, IV-FPOP mikroakışkan akış sisteminin montajını ve kurulumünü açıklar.

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Burada, canlı hücrelerdeki protein yapısını ve etkileşim alanlarını, proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IC-FPOP) olarak adlandırılan bir protein ayak izi tekniği ile karakterize ediyoruz.

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu proteinlerin yapısal karakterizasyonu için ortaya çıkan bir tekniktir. Farklı solvent katkı maddeleri ve ligandlar çeşitli hidroksil radikal atma özelliklerine sahiptir. Farklı koşullarda protein yapısını karşılaştırmak için reaksiyonda oluşan hidroksil radikallerinin gerçek zamanlı telafisi reaksiyon koşullarını normalleştirmek için gereklidir.

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IC-FPOP) adı verilen bir protein ayak izi tekniği kullanılarak yerel hücre ortamındaki protein yapısını ve etkileşim alanlarını karakterize etmek için yeni bir statik platform kullanılır.

Hareketli XY Stage ile Platform İnkübatörü: Proteinlerin Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonunu Uygulamak İçin Yeni Bir Platform

Öğrenin lazer kullanmadan hidroksil radikal protein ayak izi yöntemini, gerçek zamanlı dozimetri ile protein etkileşim bölgelerini belirlemek için. Bu yöntem protein yapı ve stabilite çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırır.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Daha fazla video keşfet