Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi
13 Nisan 2022
Bu protokol, insan sağlığında önemli bir role sahip olan iki model proteinin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknik, protein etki alanları arası hareketlerle ilgili zaman ve uzunluk ölçeklerindeki dinamiklere erişmek için tezgah üstü biyofiziksel karakterizasyonu nötron spin eko spektroskopisi ile birleştirir.
Aşağıdaki protokol, ara saçılma fonksiyonunu ölçmek ve çözeltideki proteinlerin dinamiklerini araştırmak için bir Nötron Spin Yankı deneyinin nasıl kurulacağını sunmaktadır. Nötron Spin Yankı Spektroskopisinin temel avantajı, protein alanlarının ve alt alanlarının pikodan nanosaniyeye kadar yeniden düzenlenmesine bakma yeteneğidir; bu, proteinlerdeki neredeyse doğal ortamlarında ve kalabalık protein çözeltisindeki ağır hareketlerin aralığıdır. Neutron Spin Echo ayrıca kontrast eşleştirme kullanarak çok spesifik ve hedefli çalışmalara izin veren izotopik konfigürasyona duyarlıdır.
Protein etki alanı dinamiklerine ilişkin içgörüler, proteinlerin etki alanı hareketlerini biyolojik işlevleriyle aktarmak için devam eden zor görevde biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır. Burada sunulan protokol, SNS-NSE spektrometresinde gerçekleştirilen herhangi bir Nötron Spin Yankı ölçümüne, yumuşak madde malzemeleri alanında kalırsa, numune seçiminize bakılmaksızın genel olarak uygulanabilir. Deneyi kurmak için, protein numunesinin konsantrasyonuna, ölçüm için gereken sıcaklığa ve mevcut çözelti miktarına bağlı olarak hücre numunesi yüklemesinin kalınlığını seçerek başlayın.
Hücreyi fosfatsız bulaşık deterjanı, deiyonize su ve% 70 dietanol ile temizleyin. Hücreyi konveksiyonlu fırında kurutun. Hücreye dört mililitre protein çözeltisi yükleyin ve kapaklarla kapatın.
Numune hücrelerini kapatmak için balmumu filmi veya herhangi bir sızdırmazlık maddesi kullanın. Dört mililitre diyaliz tamponunu protein numunesi ve conta ile aynı kaba yükleyin. Numuneleri kiriş hattına taşıyın.
Deklanşörü kapatın ve spektrometre muhafazası mağara alanına girin. Vidaları ve tutma plakalarını sıkarak numune hücresini alüminyum numune tutucuya monte edin. Grafit numunesini ve alüminyum oksit tozu numunesini, protein numunesiyle aynı kaba yükleyin.
Aynı tutucuyu, sıcaklık zorlama sisteminin kutusuna hafifçe kaydırarak yerleştirin. Sıcaklık zorlama sistemi kapağını kapatın ve sıcaklık zorlama sisteminin etkileşimli ekranına erişerek sıcaklığı istenen değere ayarlayın. Numunelerin ışına hizalanması için nötron kamerayı takın.
Nötron Spin Yankı Spektroskopisi verilerini toplamak için, nötron kamerasını ve dört bağımsız örnek açıklığını kullanarak nötron ışınındaki numuneyi hizalayın. Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy veri toplama yazılımını açın ve istenen saçılma açıları ve dalga boyu için kırılma taramaları çalıştırarak örnek istatistikler toplayın. Yardımcı Cihaz Bilimcisi tarafından sağlanan ölçüm makrolarını düzenleyerek her numune için toplanan istatistiklere dayanarak ölçüm parametrelerini ayarlayın.
Komut istemine protokol adını yazarak ve örnek için yankılar alarak taramaya başlayın. Neutron Sciences Remote Analysis kümesinde ORNL kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açın ve oturumu başlat düğmesine basın. Kullanıcı dizininde bir terminal penceresi açın ve yazılım kurulum komutunu yazın.
Ardından, ortam komutunu yazın. Giriş dizininde veri azaltma için bir klasör oluşturun ve sağlanan komut dosyalarını ve makroları paylaşılan dizinden kopyalayın. Buna göre sağlanan azaltma makrosunu düzenleyin, yeniden adlandırın ve kaydedin.
Komut istemine drspine" yazın ve yazılım azaltma ortamını başlatmak için Enter tuşuna basın. Yazılım ortamındaki komut istemine azaltma makrosunun adını yazın ve Enter tuşuna basın. Assisting Instrument Scientist tarafından sağlanan Python betiğini azaltılmış dosya verilerinin adlarıyla düzenleyin.
İşlevi, sağlanan kitaplıktan sığacak şekilde düzenleyin. Komut istemine düzenlenen komut dosyasının adını yazın ve azaltılmış NSE verilerini okumak, sığdırmak ve çizmek için Enter tuşuna basın. IgG ve MBP proteinleri için NSE tarafından ölçülen ara saçılma fonksiyonu, dört yıllık kısa zaman ölçeğinde basit bir difüzyon benzeri gevşeme sürecinden açık bir sapma göstererek, protein iç dinamiklerinin NSE tarafından erişilebilirliğini ve gözlemlenen dinamik süreçleri tanımlamak için daha karmaşık bir modele duyulan ihtiyacı göstermektedir.
Her iki proteinin atomik modellemesi ile donatılan ara saçılma fonksiyonu hesaplamalarının sonuçları, deneysel NSE verileriyle mükemmel bir uyum içindeydi. Sonuçlar, daha uzun kürklü zamanlarda gözlenen daha yavaş dinamiklerin genel translasyonel ve rotasyonel difüzyon süreçlerine atfedilebileceğini, kısa zaman ölçeklerinde gözlenen dinamiklerin ise protein alanlarının dinamiklerine atfedilebileceğini kanıtladı. Hatırlanması gereken önemli bir şey, NSE ölçümleri için iyi hazırlanmış ve temiz numunelere duyulan ihtiyaçtır.
Bir Spin Echo için iyi bir numune, numunenin tutarlı ve tutarsız saçılması arasındaki oran olan üçten daha yüksek bir çevirme oranına sahiptir. Ayrıca numune hazırlama ve NSE hücrelerine numune yükleme sırasında, numune çözeltisi güvenli tutulmalı ve herhangi bir kimyasal veya biyolojik çapraz kontaminasyondan uzak tutulmalıdır. Güvenlik nedeniyle, spektrometre muhafazasına giriş sadece deklanşör kapatıldıktan sonra denenmelidir ve muhafazanın radyasyonla soğutulması için yarım saat daha süre tanınmıştır.
Konsantre bir çözeltideki proteinlerin şeklini ve yapısını değerlendirmek için Küçük Açılı Nötron Saçılması önerilir. NSE deneyinden önce veya NSE deneyine paralel olarak yapılabilir. Dinamik ışık saçılması ve viskozite ölçümleri gibi ek yöntemler, konsantre protein çözeltisi içindeki translasyonel difüzyon ve hidrodinamik etkileşim hakkında bilgi sağlar ve ayrıca önerilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, çözelti içindeki protein dinamiklerini incelemek için bir Nötron Spin Yankısı deneyinin kurulumunu özetlemektedir. Teknikle, proteinlerin biyolojik fonksiyonlarını anlamak için kritik öneme sahip olan protein domain yeniden düzenlemelerinin pikosaniye ile nanosaniye zaman ölçeklerinde gözlemlenebilme yeteneği vurgulanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyofizik
- Protein Dinamiği
- Nötron Spin Eko Spektroskopisi
Arka Plan
- Protein dinamikleri, proteinlerin işlevselliğini anlamak için temel öneme sahiptir.
- Nötron Spin Yankısı, izotopik konfigürasyonlara karşı hassastır.
- Bu teknik, kontrast eşleme kullanılarak hedeflenmiş çalışmalara olanak tanır.
- Protein hareketlerinin doğal ortamlara yakın koşullarda incelenmesi kritik bir öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Proteinlerin ara saçılma fonksiyonunu ölçmek.
- Protein domenlerinin ve alt domenlerinin dinamiklerini incelemek.
- Protein hareketleri ile biyolojik işlevsellik arasındaki ilişkiye dair içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Nötron Spin Ekosu deneylerinin kurulumu.
- Çözelti içindeki protein dinamiklerinin ölçümü.
- Protein konsantrasyonuna göre örnek hücresi kalınlığının seçimi.
- Ölçümler sırasında sıcaklık kontrolü.
Temel Sonuçlar
- Proteinlerdeki yavaş hareketleri gözlemleme yeteneği kanıtlanmıştır.
- Çeşitli yumuşak madde materyallerinin incelenmesi için bir çerçeve sağlanmıştır.
- Deneylerde numune hazırlamanın önemi vurgulanmıştır.
- Nötron Spin Yankı yönteminin biyofizik araştırmalarındaki etkinliği gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Nötron Spin Yankısı, protein dinamiklerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Protokol, çeşitli protein örneklerine uyarlanabilir.
- Elde edilen bilgiler, protein fonksiyonelliğinin anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Nötron Spin Yankı Spektroskopisi, biyofarma Ar-Ge çalışmalarının, statik kristal yapılar ile fonksiyonel protein davranışı arasındaki kritik boşluğu doldurarak, protein domain dinamiklerini doğal çözelti koşullarına yakın ortamlarda pikosaniye ile nanosaniye zaman ölçeklerinde incelemesine olanak tanır. Bu yetenek, biyolojik aktivitenin temelini oluşturan protein esnekliği ve konformasyonel değişikliklere dair mekanistik içgörüler sunarak hedef validasyonunu destekler; böylece erken aşama hipotez testlerine ve risk azaltma süreçlerine bilgi sağlar. Yöntem, protein içi hareketler hakkında kantitatif ve tekrarlanabilir veriler sağlayarak, öncü bileşik tanımlama ve preklinik model seçimi süreçlerindeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel mekanizmalarla bağlantılı protein domain yeniden düzenlemelerini karakterize ederek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Çözelti içindeki alt domain dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Protein aktivitesinin mekanistik temelini açıklığa kavuşturarak ve hedef etkileşimindeki belirsizliği azaltarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Protein davranışının dinamik baz hatlarını tanımlayarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kantitatif ara saçılma fonksiyonu ölçümleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini artırır.
- Tarama Hazırlığı: Kalabalık çözelti ortamlarında güvenilir bileşik taraması için ölçeklenebilir, platform uyumlu çıktılar sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalıkla ilgili sistem modellemesi aracılığıyla, keşif aşaması dinamiklerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Dahili protein dinamiklerini genel difüzyon süreçlerinden izole ederek öngörücü risk azaltmaya odaklanır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Fizyolojik koşullara yakın şartlarda yapı-dinamik-fonksiyon ilişkileri kurarak devam/tamamla kararlarına temel oluşturur.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, yapısal ve fonksiyonel analizları tamamlayan dinamik fenotipik okumalar sağlayarak, Erken Keşif'ten Ön Lider Belirleme'ye ve Preklinik çalışmalara kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Fonksiyonel açıdan ilgili zaman ölçeklerinde protein domain hareketlerini çözümleyerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Koşullar arası karşılaştırmaya olanak tanıyan standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar aracılığıyla assay hazırlığı sağlar.
- Analitik: Dahili ve difüzyonel hareketleri nicelleştiren ara saçılma fonksiyonu ve uyarlanmış model parametreleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hücresel ortamları taklit eden yoğun protein solüsyonlarındaki dinamikleri karakterize ederek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla protein hedefi ve modalite genelinde dinamik fenotipleme için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güvenilirliği, hedef doğrulaması, protein fonksiyonundaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Protein sistemleri genelinde dinamik ölçümlerin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Erken mekanistik içgörüler aracılığıyla daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Dinamik fenotipik profillemeye dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Biyofizik, nötron saçılması ve protein numunesi hazırlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Nötron Spin Yankı (Neutron Spin Echo) spektrometrelerine ve veri indirgeme için destekleyici altyapıya erişime bağlıdır.
- Numune hazırlama, mühürleme ve kontaminasyon kontrol protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı protein konsantrasyonları, tampon koşulları ve sıcaklık aralıkları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Yüksek flip oranı (>3) gereksinimi, radyasyon güvenliği protokolleri ve yapısal bağlam için SANS gibi tamamlayıcı teknikler gibi pratik sınırlamaları kapsar.
