Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Aşağıdaki protokol, ara saçılma fonksiyonunu ölçmek ve çözeltideki proteinlerin dinamiklerini araştırmak için bir Nötron Spin Yankı deneyinin nasıl kurulacağını sunmaktadır. Nötron Spin Yankı Spektroskopisinin temel avantajı, protein alanlarının ve alt alanlarının pikodan nanosaniyeye kadar yeniden düzenlenmesine bakma yeteneğidir; bu, proteinlerdeki neredeyse doğal ortamlarında ve kalabalık protein çözeltisindeki ağır hareketlerin aralığıdır. Neutron Spin Echo ayrıca kontrast eşleştirme kullanarak çok spesifik ve hedefli çalışmalara izin veren izotopik konfigürasyona duyarlıdır.

Protein etki alanı dinamiklerine ilişkin içgörüler, proteinlerin etki alanı hareketlerini biyolojik işlevleriyle aktarmak için devam eden zor görevde biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır. Burada sunulan protokol, SNS-NSE spektrometresinde gerçekleştirilen herhangi bir Nötron Spin Yankı ölçümüne, yumuşak madde malzemeleri alanında kalırsa, numune seçiminize bakılmaksızın genel olarak uygulanabilir. Deneyi kurmak için, protein numunesinin konsantrasyonuna, ölçüm için gereken sıcaklığa ve mevcut çözelti miktarına bağlı olarak hücre numunesi yüklemesinin kalınlığını seçerek başlayın.

Hücreyi fosfatsız bulaşık deterjanı, deiyonize su ve% 70 dietanol ile temizleyin. Hücreyi konveksiyonlu fırında kurutun. Hücreye dört mililitre protein çözeltisi yükleyin ve kapaklarla kapatın.

Numune hücrelerini kapatmak için balmumu filmi veya herhangi bir sızdırmazlık maddesi kullanın. Dört mililitre diyaliz tamponunu protein numunesi ve conta ile aynı kaba yükleyin. Numuneleri kiriş hattına taşıyın.

Deklanşörü kapatın ve spektrometre muhafazası mağara alanına girin. Vidaları ve tutma plakalarını sıkarak numune hücresini alüminyum numune tutucuya monte edin. Grafit numunesini ve alüminyum oksit tozu numunesini, protein numunesiyle aynı kaba yükleyin.

Aynı tutucuyu, sıcaklık zorlama sisteminin kutusuna hafifçe kaydırarak yerleştirin. Sıcaklık zorlama sistemi kapağını kapatın ve sıcaklık zorlama sisteminin etkileşimli ekranına erişerek sıcaklığı istenen değere ayarlayın. Numunelerin ışına hizalanması için nötron kamerayı takın.

Nötron Spin Yankı Spektroskopisi verilerini toplamak için, nötron kamerasını ve dört bağımsız örnek açıklığını kullanarak nötron ışınındaki numuneyi hizalayın. Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy veri toplama yazılımını açın ve istenen saçılma açıları ve dalga boyu için kırılma taramaları çalıştırarak örnek istatistikler toplayın. Yardımcı Cihaz Bilimcisi tarafından sağlanan ölçüm makrolarını düzenleyerek her numune için toplanan istatistiklere dayanarak ölçüm parametrelerini ayarlayın.

Komut istemine protokol adını yazarak ve örnek için yankılar alarak taramaya başlayın. Neutron Sciences Remote Analysis kümesinde ORNL kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açın ve oturumu başlat düğmesine basın. Kullanıcı dizininde bir terminal penceresi açın ve yazılım kurulum komutunu yazın.

Ardından, ortam komutunu yazın. Giriş dizininde veri azaltma için bir klasör oluşturun ve sağlanan komut dosyalarını ve makroları paylaşılan dizinden kopyalayın. Buna göre sağlanan azaltma makrosunu düzenleyin, yeniden adlandırın ve kaydedin.

Komut istemine drspine” yazın ve yazılım azaltma ortamını başlatmak için Enter tuşuna basın. Yazılım ortamındaki komut istemine azaltma makrosunun adını yazın ve Enter tuşuna basın. Assisting Instrument Scientist tarafından sağlanan Python betiğini azaltılmış dosya verilerinin adlarıyla düzenleyin.

İşlevi, sağlanan kitaplıktan sığacak şekilde düzenleyin. Komut istemine düzenlenen komut dosyasının adını yazın ve azaltılmış NSE verilerini okumak, sığdırmak ve çizmek için Enter tuşuna basın. IgG ve MBP proteinleri için NSE tarafından ölçülen ara saçılma fonksiyonu, dört yıllık kısa zaman ölçeğinde basit bir difüzyon benzeri gevşeme sürecinden açık bir sapma göstererek, protein iç dinamiklerinin NSE tarafından erişilebilirliğini ve gözlemlenen dinamik süreçleri tanımlamak için daha karmaşık bir modele duyulan ihtiyacı göstermektedir.

Her iki proteinin atomik modellemesi ile donatılan ara saçılma fonksiyonu hesaplamalarının sonuçları, deneysel NSE verileriyle mükemmel bir uyum içindeydi. Sonuçlar, daha uzun kürklü zamanlarda gözlenen daha yavaş dinamiklerin genel translasyonel ve rotasyonel difüzyon süreçlerine atfedilebileceğini, kısa zaman ölçeklerinde gözlenen dinamiklerin ise protein alanlarının dinamiklerine atfedilebileceğini kanıtladı. Hatırlanması gereken önemli bir şey, NSE ölçümleri için iyi hazırlanmış ve temiz numunelere duyulan ihtiyaçtır.

Bir Spin Echo için iyi bir numune, numunenin tutarlı ve tutarsız saçılması arasındaki oran olan üçten daha yüksek bir çevirme oranına sahiptir. Ayrıca numune hazırlama ve NSE hücrelerine numune yükleme sırasında, numune çözeltisi güvenli tutulmalı ve herhangi bir kimyasal veya biyolojik çapraz kontaminasyondan uzak tutulmalıdır. Güvenlik nedeniyle, spektrometre muhafazasına giriş sadece deklanşör kapatıldıktan sonra denenmelidir ve muhafazanın radyasyonla soğutulması için yarım saat daha süre tanınmıştır.

Konsantre bir çözeltideki proteinlerin şeklini ve yapısını değerlendirmek için Küçük Açılı Nötron Saçılması önerilir. NSE deneyinden önce veya NSE deneyine paralel olarak yapılabilir. Dinamik ışık saçılması ve viskozite ölçümleri gibi ek yöntemler, konsantre protein çözeltisi içindeki translasyonel difüzyon ve hidrodinamik etkileşim hakkında bilgi sağlar ve ayrıca önerilir.