Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Tüm zar proteinleri ilaç keşfinde önemli hedeflerdir. Membran proteinlerinin en büyük ölçekli üretimi, biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal membran proteini çalışmalarının yürütülmesinde bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu yöntem, zar proteinlerini in vitro olarak verimli bir şekilde sentezlemek ve saflaştırılmış proteolipozomları kısa sürede yüksek başarı oranı ile hazırlamak için kullanılabilir.

Bir transkripsiyon reaksiyonu karışımı oluşturmak için hücresiz ekspresyon plazmidi de dahil olmak üzere uygun reaktifleri ekledikten sonra, tüp içeriğini hafif ters çevirme veya vurma ile karıştırın ve bir mikrosantrifüjde hızlı bir döndürme gerçekleştirin. Döndürmeden sonra, transkripsiyon reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin, ardından karıştırma ve bir sıkma aşaması izleyin. Translasyon tamponunu hazırlamak için, stok çözeltisini taze ultra saf su ile seyreltin.

Küçük ölçekli çeviri için, gliserolü diyaliz membranından çıkarmak için ultra saf suyla yıkanmış 100 mikrolitrelik diyaliz kabı kullanın. Yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe bir mililitre ultra saf su ekleyin ve tüpe küçük ölçekli bir diyaliz kabı yerleştirin. Ardından, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için bardağa 500 mikrolitre ultra saf su ekleyin.

Lipozomları hazırlamak için, 50 miligram lipit içeren bir lipit çözeltisini bir buharlaştırma şişesine aktarın. Çözücüyü buharlaştırmak için şişeyi döner bir buharlaştırıcıya yerleştirin. Şişe tabanının yüzeyinde ince, eşit şekilde yayılmış bir lipit tabakası oluştuğunda, çözücüyü tamamen çıkarmak için şişeyi gece boyunca negatif basınç altında bir vakumlu desikatöre aktarın.

Ertesi sabah, şişeleri kurutucudan çıkarın ve ince lipit filmini kontrol edin. Şişeye bir mililitre çeviri tamponu ekleyin ve tamponu ince lipit film üzerine yaymak için şişeyi döndürün. Beş dakika sonra, çözeltinin tüm lipit film yüzeyine temas etmesine izin vermek için ara sıra açıyı değiştirerek şişeyi sonikleştirin.

Lipid şişeden tamamen sıyrıldığında ve lipozom süspansiyonu homojen hale geldiğinde sonikasyonu durdurun. Daha sonra lipozom süspansiyonunu 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Bir in vitro protein translasyonu gerçekleştirmeden önce, malzemeyi hızlı bir şekilde çözmek için eksi 80 derecelik depolamadan bir tüp buğday tohumu özütünü oda sıcaklığında su üzerinde birkaç dakika bekletin.

Ekstrakt çözüldükten sonra, tüp içeriğini hemen hafifçe ters çevirerek karıştırın. Ardından döndürün ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Bir translasyon reaksiyonu karışımı oluşturmak için buğday tohumu özü mRNA'sını ve lipozomları ekleyin.

Tüp içeriğini hafifçe ters çevirerek veya hafifçe vurarak karıştırın ve bir mikrosantrifüjde hızlı bir dönüş gerçekleştirin. Küçük ölçekli bir in-vitro protein çevirisi yapmak için, suyu küçük ölçekli diyaliz kabından ve tüpünden çıkarın ve tüpe bir mililitre çeviri tamponu ve bardağa 300 mikrolitre ekleyin. 60 mikrolitre translasyon reaksiyon karışımı alın.

Pipet ucunu diyaliz kabındaki çeviri tamponuna yerleştirin. Ardından karışımı yavaş ve nazikçe enjekte edin. Daha yüksek yoğunluklu reaksiyon karışımı kendiliğinden kabın dibine çöker ve bir tabaka oluşturur.

Buharlaşmayı önlemek için bardağı bir kapakla örtün. Büyük ölçekli bir çeviri yapmak için, 25 mililitrelik bir tüpe 22 mililitre çeviri tamponu ekleyin ve tüpe iki mililitrelik bir diyaliz kabı yerleştirin. Diyaliz kabına iki mililitre çeviri tamponu ekleyin.

Translasyon reaksiyonu karışımından 500 mikrolitre alın, karışımı yavaşça ve nazikçe fincandaki translasyon tamponuna enjekte edin. Reaksiyonları 15 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Ertesi gün diyaliz kabındaki reaksiyonu pipetleme ile iyice karıştırın ve ham proteolipozom süspansiyonlarını yeni tüplere aktarın.

Proteolipozomları saflaştırmak için, proteolipozomu santrifüjleme yoluyla ham süspansiyonlarda çökeltin. Daha sonra proteolipozomu uygun hacimde buz gibi soğuk PBS tamponunda üç kez yeniden süspanse ederek yıkayın. Yıkadıktan sonra, proteolipozom peletlerini küçük bir hacimde PBS içinde iyice yeniden süspanse edin ve bir mikropipet kullanarak süspansiyon hacmini ölçün.

Ardından, süspansiyon hacmini ayarlamak için PBS ekleyin. Her süspansiyonu yeni bir mikro tüpe aktarın. Bir SDS sayfa analizi ayarlamak için, her bir proteolipozom süspansiyonunun 10 mikrolitresine 70 mikrolitre su ve 40 mikrolitre üç zamanlı konsantre SDS sayfası numune tamponu ekleyin.

Bir elektroforez odasında %5 ila %20 gradyanlı bir SDS sayfa jeli ayarlayın. Jeli, her proteolipozom örneğinden üç, altı ve 12 mikrolitre protein boyutu işaretleyicisinin iki mikrolitresi ve 10 mikrolitre sığır serum albümini standardı ile yükleyin. Numuneleri yükledikten sonra, elektroforezi çalıştırın ve ardından jeli Coomassie Brilliant Blue boyası ile boyayın.

Son olarak, jeli sıcak suda hafifçe çalkalayarak rengini açın ve jel görüntüsünü tarayın. Gösterildiği gibi bu protokolü kullanarak, üç veya daha fazla transmembran sarmalına sahip çeşitli zar proteinleri kısa sürede proteolipozom olarak kolayca üretilebilir. Bu iki katmanlı diyaliz yönteminde, sürekli bir substrat temini ve yan ürünün uzaklaştırılması, reaksiyon karışımının hem üstünde hem de altında uzun bir süre boyunca verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir ve bu da mükemmel bir translasyon etkinliğine yol açar.

İki katmanlı diyaliz yöntemi, tek başına iki katmanlı veya diyaliz yöntemlerinin kullanılmasına kıyasla üretkenlikte dört ila 10 kat artışa neden olur. Sentezlenen proteolipozomların santrifüjleme ile toplanması ve bir yıkama tamponu ile kısmen saflaştırılması, zar proteinlerinin saflaştırma sürecini büyük ölçüde kısaltır. Bu hücresiz sistemin manipüle edilmesi kolaydır ve yüksek düzeyde ölçeklenebilir.

Diğer yöntemler kullanılarak ifade edilmesi zor olan hafıza proteinlerini üretmek için de kullanılabilir. Bu yöntem, antimembran proteini, antikor üretimi, SPR, Elisa ve AlphaScreen gibi zar proteinlerini kullanan veya hedefleyen araştırmalar ve deneyler için son derece yararlıdır.