Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Protokolümüz, araştırmacıların üç farklı kemik iliği transplantasyon yönteminin fizyolojik etkilerini ve klonal hematopoez ortamında deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olacaktır. Toplam vücut radyasyon kemik iliği nakli kardiyovasküler organları olumsuz etkileyebilir ve hastalık patogenezlerini değiştirebilir. Böylece laboratuvarımız olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir.

Prosedürleri gösteren eunbee park bir yüksek lisans öğrencisi olacak, ve Megan Evans doktora sonrası bir arkadaş, hem benim laboratuvarımdan toraks ve karın kalkanı için, ayarlanabilir tepsi ve x-ray ışınlayıcı doğru mesafeye yerleştirmek üniforma ışınlama elde etmek için. Ve uyuşturulmuş fareleri sırtüstü pozisyonda birbirine ters çevrilmiş düz bir led plakaya yerleştirin. Pençeleri bantla tabağa sabitleyin ve led kalkanı alt ucu xiphisternum kemiği ile hiza olacak şekilde yerleştirin ve kurşun kalkanın üst ucu timusa yakın olacak şekilde yerleştirin.

Kalkandan sonra, fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve hayvanları dört ila 24 saat arayla ayrılmış iki, 5,5 gri ışınlama fraksiyonuna maruz bırakın. Baş koruyucu için, farenin dört pençesini dikkatlice karnına bantleyin. Fareyi konik bir kısıtlayıcıya yerleştirin ve kısıtlayıcıyı kurşun kalkan içindeki yuvaya kaydırın, böylece farenin başı ve kulakları tamamen kaplanır ve farenin vücudunun geri kalanı radyasyona maruz kalır.

Siper ettikten sonra fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve hayvanları dört ila 24 saat arayla ayrılmış bir radyasyonun 5,5 gri fraksiyonuna maruz bırakır. Her radyasyon tedavisinden sonra, uyuşturulmuş fareleri tamamen iyileşene kadar izleme ile ısıtılmış bir paspas üzerinde bir kafese yerleştirin. Kemikleri izole etmek için, donör farenin derisini% 70 etanol ile dezenfekte edin ve göğüs kafesinin altında küçük bir enine cilt kesisi yapın.

Kesiğin her iki tarafında cildi sıkıca tutarak, baş ve ayaklara doğru ters yönde yırtın ve cildi tüm uzuvlardan soyun. Omuzları ve dirsek eklemlerini kesin ve bağlı kasları ve bağ dokularını humeriden çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın. Uyluk kemiği ve kalça kemikleri arasındaki eklemleri dikkatlice yerinden sökün.

Ve bacakları ayırmak için uyluk kafalarını kesmek için künt makas kullanın. Uyluk kemiği ve kaval kemiğini ayırmak için diz eklemini kesin. Ve bağlı kasları ve bağ dokularını kemiklerden dikkatlice çıkarmak için laboratuvar mendilleri kullanın.

Daha sonra kemikleri aynı genotipteki farelerden buz üzerinde 20 mililitre buz soğuk steril PBS içeren bireysel 50 mililitre konik tüplere çekin. Kemik iliği hücrelerini biyo-güvenlik sınıfı iki kabinde izole etmek için, steril 500 mikroliter mikro tüpün dibinde küçük bir delik açmak için 18 kalibrelik bir iğne kullanın. Ve tüpü, 100 mikrolitre buz gibi steril PBS içeren tek bir steril 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.

Tüm tüpler hazırlandığında, PBS'yi izole edilmiş kemikleri içeren tüpten çıkarın ve kemikleri steril bir 100 milimetre hücre kültürü çanağında aktarın. Her kemiğin uçlarından epifizi dikkatlice çıkarmak için ince epanslar ve küçük makas kullanın ve her 500 mikroliter tüpüne altı adede kadar kemik yerleştirin. Tüm kemikler kesildiğinde, kemik iliği hücrelerini santrifüjleme ile çıkarın.

Tüm ilik içeriği çıkarılmışsa, kemikler 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpünün dibinde nispeten büyük bir kırmızı pelet ile beyaz ve yarı saydam görünmelidir. Kemik iliği hücre nakli için, izole edilmiş kemik iliği hücrelerini serumsuz RPMI ortamlarında seyreltin ve hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini enjekte edilecek fare başına 0,5 mililitre insülin şırıngasına yükleyin. Pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, tüm hücre hacmini yavaşça her anestezi alan hayvanın retro orbital damarına enjekte edin.

Daha sonra ağrı kesici için göze bir damla proparacaine yerleştirin. Ve farenin izlenirken bilincini geri kazanmasına izin verin. Üç BMT önkoşullama yönteminin donör hücre engraftasyonu üzerindeki etkisini karşılaştırmak.

Periferik kan ve kalp dokusundaki donör hücrelerin fraksiyonları BMT sonrası bir aylıkken akış sitometrisi ile analiz edildi. Bu temsili analizde, toplam vücut ışınlanması alan alıcı farelerin periferik kanında monositler, nötrofiller ve B hücreleri büyük ölçüde ablatlandı ve donör kemik iliği türevi hücrelerin soyu ile değiştirildi. Ek olarak, yerleşik alıcı kardiyak monosit ve nötrofil popülasyonları donör türevi hücrelerle neredeyse tamamen değiştirildi.

Kısmen korumalı ışınlama grubunda, donör türetilmiş kardiyak immün hücre değişimi mütevazıydı. Kalkanlı bölgelerdeki alıcı fare kemik iliği hücreleri, muhtemelen toplam vücut ışınlanması alan farelere kıyasla daha düşük periferik kan rekonsepsiyon seviyesine katkıda bulunmuştur. BMT önkoşulu olmayan grupta, donör türevi hücreler BMT sonrası dört haftada alıcı farelerin periferik kanında ve kalplerinde tespit edilebilirdi.

Ek olarak, Tet2 eksik donör hücreleri zamanla yavaş yavaş genişledi. Buna karşılık, vahşi tip donör hücreleri ile kaplanmış alıcı fareler, donör hücrelerde minimum klonal genişleme gösterdi. Bu deneysel modellerin optimizasyonu, kardiyo-metabolik hastalık ve kanser gibi mortaliteye neden olan klonal hematopoez sürücü genlerinin daha titiz çalışmalarını sağlayacaktır.

Protokollerimizin araştırmacıların kardiyovasküler hastalıklara ve diğer hastalık durumlarına nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için klonal hematopoez çalışmasına izin vereceğini umuyoruz.