Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama
April 27th, 2021
Davranış sırasında ve uyaranlara yanıt olarak yetişkin Drosophila'nın tüm beynini imgelemek için özel olarak uyarlanmış bir yöntem sunuyoruz. Baş, tüm beyne optik erişime izin vermek için konumlandırılırken, sinek bacaklarını ve antenleri, hortumun ucunu hareket ettirebilir ve gözler duyusal uyaranları alabilir.
Protokolümüz, farklı beyin bölgelerindeki nöronların davranışı şekillendirmek için nasıl etkileşime girdiğini anlamak için önemli olan davranış sırasında tüm sinek beyninin görüntülenmesine izin verir. Yayınlanan diğer protokollerin aksine, bu özellikle sinek bir koku, tat veya görsel stimülasyon tarafından davranırken ve algılanırken tüm beyne erişmek için geliştirilmiştir. Kafa boşluğu oluşturmak için.
Tutucuyu 3D yazıcıyla yazdırdıktan sonra, yapışkan bant parçasını stereo mikroskop altında düz bir yüzeye dikdörtgen olarak yerleştirin. Ve yaklaşık beş milimetrelik bir parçayı bir santimetre kesin. Bandın uzun tarafının ortasında 400'e 400 mikrometrelik bir sonraki yuvayı kesmek için paralel olarak sabitlenmiş iki neşter kullanın ve bandı tutucunun altındaki deliğin düz tarafının üzerine yerleştirin.
Bandı deliğin etrafına yaklaşık 500 mikrometre itmek için tokmak kullanın. Ve bandın üstünü ve tutucuyu örtmek için siyah oje kullanın. Ojenin en az bir saat kurumasına izin verdikten sonra, kafa yuvasına yaklaşık bir mikroliter gres eklemek için yuvarlanmış bir doku kullanın.
Gövde yuvasını hazırlamak için, yaklaşık iki santimetrelik geniş bir bant parçasını iki parçaya bölün ve 1,5 milimetre genişliğinde dilimler kesin. Ardından 0,3 milimetre derinliğinde bir omuz ve vücut yuvasını kesin ve bandın tutucuya uyduğundan emin olun. Bir sineği tutucuya sabitlemek için, önce diseksiyon mikroskobun altına buzlu sığ bir kap yerleştirin ve tutucuyu buzun üzerine yerleştirilmiş bir laboratuvar dokusunun üzerine baş aşağı yerleştirin.
Bir ila dört günlük dişi meyve sineklerini aşağılıktan aspire edin ve sineği eritilmemiş buza üfleyin. Sinek hareket etmeyi bıraktığında, kanatların tabanındaki sineği kavramak için Dell forseps kullanın ve sineği yuvanın içindeki boyunla tutucuya kaydırın. Gözler yuvanın her iki tarafına eşit olarak konumlandırılmalıdır.
Gerekirse, tutkalın başın arkasına ulaşmasını önlemek için başın üstüne bir mikroliter gres ekleyin. Daha sonra sineğin hareket etmediğinden emin olmak için vücudu bir mendil ve biraz buzla örtün. Başı sabitlemek için, tamamen arka görünümden yaklaşık 20 derecelik bir açıyla yerleştirin.
Ve duyusal ilgi alanını kirletmekten kaçınırken başın etrafına UV tutkal uygulamak için yuvarlanmış bir doku kullanın. Tat deneyleri için, hortumları çıkarmak için forseps kullanın ve hareketi önlemek için hortum tabanına tutkal ekleyin. Tat deneyi planlanmazsa hortumun kafasına itin ve yapıştırın.
Yapıştırıcıyı UV ışığıyla beş saniye boyunca tedavi edin ve başı çevreleyen alanları dikkatlice temizlemek, bacaklara ve kapılar toprağına, duyusal alanlara yapışabilecek kalan sıvı tutkalları çıkarmak için yuvarlanmış bir doku kullanın. Daha sonra bacakları gerektiği gibi öne taşımak için ince bir bant şeridi veya bir doku kullanın. Gövdeyi konumlandırmak için buz kabını çıkarın ve tutucuyu döndürün.
Sinek etrafındaki suyu çıkarın ve sinek anesteziden iyileşmeden önce hızlı hareket ederek vücut yuvası bandını deliğin üzerine yerleştirin ve boynu abartmamaya dikkat ederek sineğin vücudunu hafifçe aşağı itin. Kalan büyük delikleri bantla kapatın ve tutkalın bu konuma yapışmasını önlemek için başın arkasına yaklaşık bir mikroliter gres ekleyin. Toraksın etrafına ve bant ve toraksın üzerine UV tutkal boyamak için yuvarlanmış bir doku kullanın ve tutkalı yaklaşık beş saniye boyunca UV ışığıyla iyileştirin.
Laboratuvar dokusu ile herhangi bir gresi ve kesilmemiş yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın ve başın üstüne yaklaşık bir mililitre salin ekleyin. Herhangi bir hava kabarcığı kenara itmek ve tuzlu su üzerine bir kapak kayması yerleştirerek ve ön tarafta tuzlu su olup olmadığını kontrol etmek için tutucuyu döndürerek sızıntıları kontrol etmek için forseps kullanın. Salin görülürse, salini çıkarın ve deliği daha fazla tutkal veya daha fazla gresle sabitlayın.
Başı kesmek için en yüksek büyütmeyi seçin ve boynun her iki tarafındaki merkezi koyu kütikül üçgeninin tabanında iki kesik yapmak için keskinleştirilmiş çok ince önlükler kullanın. Koyu üçgenin etrafını kesin ve manikranın bu kısmını çıkarın. Kas 16 ve yemek borusu bu delikten görülebilir ve ritmik olarak hareket etmelidir.
Yemek borusunu delmeden kas 16'yı kesmek için bu bölgenin üst kısmını dikkatlice sıkıştırmak için çok ince tokmakları kullanın. Ritmik hareket durursa kas 16 muhtemelen çıkarıldı. Kas, koyu üçgen bölgesinin medial kenarından başlayarak eksöke edildiğinde, kalan manikürü küçük parçalar halinde dikkatlice kesmek ve çıkarmak için bir makas çifti gibi önsezileri kullanın.
Daha sonra kavramak için tokmakları kullanın ve yavaşça ve istikrarlı bir şekilde bir seferde bir hava kesesini çekin. Bu videoda, bu iki meyve sineği beyninin tüm nöronlarında bir kalsiyum probu ifade edildi. Ve bir koku sunuldu.
Bu deneyde kalsiyum sensör ekspresyonu dopaminerjik ve serotonerjik nöronlarla sınırlandırıldı. Beyin üzerindeki güçlü senkron aktivite ile tüm beynin belirli bir davranış sırasında nasıl gözlemlenebileceğini gösteren sinek yürüme davranışı arasındaki sıkı korelasyona dikkat edin. Prensip bileşen analizi ve bağımsız bileşen analizi kullanılarak farklı renklerde vurgulanan farklı fonksiyonel bölgeler ayıklanabilir.
İşlevsel bölgelerin şekli ve lokalizasyonu, bölgelerin anatomik şablonlarla eşlenmesine izin verir. Beyin bölgelerini ve bazı durumlarda nöron tiplerini tanımlamak için. Uygun anatomik şablon floresan değerlerine hizalandıktan sonra nicel analiz için belirli anatomik beyin bölgelerinde ortalama yapılabilir.
Örneğin, bu analizde tüm bölgelerin yürüyüş sırasında tımar sırasından daha aktif olduğunu gözlemleyebiliriz. Sabırlı olun. Bu kalp diseksiyon tekniğini öğrenmek zordur.
Laboratuvarımda, insanların ustalaşmadan ve ilk yararlı önseçimlerini almadan önce ortalama üç ila dört aya ihtiyaçları var. Bu protokole uyarak floresan mikroskobu kullanarak büyük ölçekli beyin aktivitesini kaydedebiliriz. Işık alanı mikroskopisi gibi hızlı yöntemler özellikle belirtilmiştir.
Genel Bakış
Bu çalışma, yetişkin Drosophila'nın tüm beynini, davranması ve duyusal uyaranlara tepki göstermesine izin vererek görselleştirmek için yeni bir görüntüleme yöntemi sunar. Teknik, sinir hücreleri arasındaki etkileşimlerin yürüyüş ve kokulara tepki gibi etkinlikler sırasında gözlemlenmesini sağlamak için hem optik erişime hem de sineğin hareketine izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Davranış sırasındaki sinirsel etkileşimleri anlamak, beyin bölgelerinin davranışları nasıl şekillendirdiğini deşifre etmek için anahtardır.
- Önceki görüntüleme yöntemleri, organizma aktif olarak davranırken tüm beyine erişimi etkili bir şekilde sağlamamıştır.
- Bu çalışma, görüntüleme sırasında harekete izin veren bir başlık tutucu oluşturarak yenilik yapar.
- Kalsiyum sensörleri, uyaranlara tepki olarak sinirsel aktiviteyi görselleştirmeye yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Davranış sırasında Drosophila beyni için kapsamlı bir görüntüleme protokolü geliştirmek.
- Yürüyüş ve duyusal tepki gibi özel davranışlarla ilgili sinir hücrelerinin eşzamanlı aktivitesini gözlemlemek.
- Canlı bir organizmada beyin aktivitesi ve spesifik eylemler arasındaki korelasyonu anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntem, büyük ölçekli beyin aktivitesi kaydı için bir floresan mikroskop kullanır.
- Biyolojik model olarak Drosophila melanogaster kullanılır ve yetişkin meyve sineğine odaklanılır.
- Görüntüleme sırasında hareketsizlik için özel başlık ve vücut yuvaları oluşturulur.
- Kritik adımlar, dikkatli anatomik diseksiyon ve stabilizasyon için UV yapıştırıcısının uygulanmasını içerir.
- Teknik, çeşitli duyusal uyaranların sunulmasını içerir ve sinirsel tepkilerin gözlemlenmesine izin verir.
Ana Sonuçlar
- Görüntüleme, sinirsel aktivite ile sineğin yürüyüş davranışı arasında güçlü bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır.
- Beynin fonksiyonel bölgeleri tanımlanır ve anatomik şablonlara haritalanır.
- Araştırma, yürüyüş sırasında tüy dökme davranışına kıyasla belirli beyin bölgelerinde daha yüksek aktivite seviyelerini gösterir.
- Ana bileşen analizi gibi yöntemler, beyin bölgelerinin işlevselliğini daha fazla açıklar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, Drosophila'da davranış sırasında sinirsel dinamikleri araştırmak için yeni bir yol gösterir.
- Yöntem, gerçek zamanlı duyusal işleme ve eylemin anlaşılmasını artırır.
- Elde edilen bilgiler, sinirsel mekanizmalar ve davranışsal tepkiler hakkında daha geniş bilgiye katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables whole-brain imaging in behaving Drosophila, providing a scalable model for de-risking target validation in early discovery. By linking neural circuit activity to behavior and stimulus response, it supports mechanistic insight for phenotypic screening and assay development pipelines. The approach enhances predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating whole-brain activity with specific behaviors such as walking or grooming.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time observation of neuronal responses to sensory stimuli like odor, taste, or visual cues.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by mapping functional brain regions to anatomical templates for target engagement analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling quantitative fluorescence readouts of neuronal activity during behavior.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through stabilized head fixation and minimal behavioral perturbation.
- Scalability: Supports platform reuse for compound evaluation in disease-relevant systems requiring behavioral readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neural activity measurements to preclinical validation via brain-wide functional mapping.
- Biomarker Alignment: Enables identification of neuron-type-specific activity patterns (e.g., dopaminergic, serotonergic) for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking target modulation to measurable changes in brain-wide activity during behavior.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating neuronal activity patterns with specific behaviors and sensory responses.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative fluorescence measurements in behaving organisms.
- Analytics: Utilizes principal and independent component analysis to extract functional brain regions for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via anatomical mapping of functional regions to established brain templates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal target validation across multiple sensory modalities and behavioral paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of neuronal dynamics during behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via optimized head fixation, dissection, and stabilization protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-pathway-behavior relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative brain-wide activity changes in response to target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and fluorescence imaging for successful head dissection and preparation.
- Depends on 3D-printed holders, UV glue, saline perfusion, and fluorescence microscopy infrastructure for consistent results.
- Necessitates cross-team standardization in sample preparation, stimulus delivery, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations across model systems due to species-specific anatomy and behavioral repertoires.
- Limited by the steep learning curve, with mastery requiring three to four months of practice as reported in source material.
