Name: İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Öğrenin, insan viseral yağ dokusundan kollagenaz sindirimiyle canlı adiposit ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin izolasyonunu. Akış sitometrisiyle makrofaj fenotiplemesi ve yüksek kaliteli RNA analizi için optimize edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Instituto Nacional de Perinatologia (hibe numaraları: 3300-11402-01-575-17 ve 212250-3210-21002-06-15) ve CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (hibe numarası 2015-3-2-61661) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, Instituto Nacional de Perinatologia'nın IRB'si (212250-3210-21002-06-15) tarafından onaylanmıştır. Katılım gönüllülük esasına dayalıydı ve kayıtlı tüm kadınlar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.
1. Viseral yağ dokusu toplanması
<ol><li>Doğum sancısı olmadan tekil gebelikleri olan sağlıklı yetişkin kadınlardan sezaryen sırasında kısmi omentektomi yoluyla KDV biyopsileri alın.</li>
	<li>Rahim kapanması ve hemostaz yapıldıktan sonra, daha büyük omentum tanımlamaya devam edin ve ıslak bir kompres üzerinde uzatın. Maruz kalan AT KDV'dir.</li>
	<li>En büyük kan damarını bulun ve daha büyük omentum tabanına 7 x 5 cm'lik hayali bir çizgi izleyin.</li>
	<li>Bir avasküler bölge belirleyin ve KDV'nin dış tarafını delmek için Kelly forseps kullanın.</li>
	<li>KDV'nin delindiği bölgede proksimal ve distal tarafı sıkıştırmak için Ochsner forseps kullanın ve dokuyu kesmek için Metzenbaum makası kullanın.</li>
	<li>Daha büyük omentumu 1 numaralı siyah ipek ile bağlayın.</li>
	<li>Ochsner forsepslerini çıkarın ve hemostazı değerlendirin.</li>
	<li>KDV biyopsisini steril bir kaba koyun ve hemen laboratuvara taşıyın.</li>
</ol>2. Viseral yağ dokusunun enzimatik sindirimi ve olgun adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>KDV biyopsisini tartın ve 1x PBS pH 7.4 ile durulayın.</li>
	<li>4 g KDV'yi kesin ve dokuyu bir diseksiyon tepsisinde küçük parçalara ayırmak için makas kullanın.</li>
	<li>Kıyılmış KDV'yi steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın, 20 mL PBS ekleyin ve kırmızı kan hücrelerinin fazlalığını gidermek için hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>KDV'yi yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 25 mL sindirim solüsyonu ekleyin (% 0.25 kollajenaz tip II, 5 mM glikoz, PBS'de% 1.5 albümin).</li>
	<li>37 °C'de 60 dakika boyunca 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.</li>
	<li>Sindirilmiş dokuyu üç kat gazlı bezden geçirerek yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne süzün.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>SFV hücreleri pelette kalırken, olgun adipositlere karşılık gelen bir üst faz olan iki faz elde edilir. Olgun adipositleri bir transfer pipeti kullanarak yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne nazikçe aktarın.</li>
	<li>20 mL soğuk PBS ekleyin, hafifçe çalkalayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Olgun adipositleri 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın.</li>
	<li>4 °C'de 1 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve bir P200 mikropipet kullanarak fazla PBS'yi çıkarın. Gerekirse bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>300 μL olgun adiposit süspansiyonunu 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüplerine yavaşça aktarın. Olgun adipositleri RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Adipositler bir pelet oluşturmaz.</li>
	<li>Adipositler ayrıldıktan sonra (adım 2.9), SVF peletini tüpün dibinde tutarak sindirim solüsyonunun çoğunu bir transfer pipeti ile aspire edin.</li>
	<li>SVF hücreli peleti, bir transfer pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücre peletini nazikçe yıkayın, yukarı ve aşağı pipetleyerek 20 mL soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla hızla atın.</li>
	<li>2.17 ve 2.18 adımlarını tekrarlayarak ikinci bir yıkama gerçekleştirin.</li>
	<li>SVF peletine oda sıcaklığına (RT) dengelenmiş, 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile askıya alın. Girdap yapmayın.</li>
	<li>RT'de 5 dakika inkübe edin ve 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir transfer pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve uygun şekilde atın.</li>
	<li>Lizis tamponunu nötralize etmek için 10 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve hücre peleti ayrılana kadar hafifçe karıştırın.</li>
	<li>SVF peleti elde etmek ve PBS'yi atmak için 800 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet görünmelidir.</li>
	<li>Tekrarlanan pipetleme ile RT'de 5 mL 1x PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve üç kat gazlı bezden yeni bir 50 mL konik tüpe süzülün. Daha sonra, bu hücreler akış sitometrisi ile makrofaj alt popülasyon karakterizasyonu için kullanılacaktır.</li>
</ol>3. Olgun adipositlerden RNA ekstraksiyonu
<ol><li>RNA bozulmasını önlemek için RNase dekontaminasyon spreyi kullanarak temiz bir alan hazırlayın. RNA prosedürleri için ayrılmış bir pipet seti kullanın. Kullanılan tüm tüpler ve uçlar RNaz içermemelidir.</li>
	<li>Olgun adiposit süspansiyonunu (bölüm 2.14) -80 °C'ye kadar saklanmışsa 4 °C'de çözün. NOT: Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.</li>
	<li>1.000 μL asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktif ekleyerek hücreleri parçalayın ve homojenize etmek için bir P1000 mikropipet ile iyice karıştırın.</li>
	<li>Nükleoprotein komplekslerinin ayrışmasını artırmak için RT'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>RT'de 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücresi lizatı. Üç faz elde edilecektir: adiposit lipidlerine karşılık gelen bir üst faz (sarı), nükleik asitlere karşılık gelen bir orta faz (pembe) ve bir pelet (hücresel kalıntı).</li>
	<li>Bir P200 mikropipet kullanarak lipit tabakasını dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Orta fazı 2 mL'lik yeni bir tüpe aktarın, lipid kalıntısı ve pelet bozulmasından kaçının (yaklaşık 700 μL).</li>
</ol>4. MikroRNA'lar dahil toplam RNA'nın saflaştırılması
NOT: Yüksek kaliteli toplam RNA elde etmek için kolon tabanlı bir toplam RNA saflaştırma yöntemi kullanılır.
<ol><li>Bölüm 3.7'den numuneye eşit hacimde etanol (%95-100), yaklaşık 700 μL ekleyin ve tüpü 10 saniye ters çevirerek elle karıştırın.</li>
	<li>Karışımın 700 μL'sini bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir kolona aktarın, santrifüjleyin ve akışı atın.</li>
	<li>Sütunu yeniden yükleyin ve 4.2 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kolona ve santrifüje 400 μL ön yıkama tamponu ekleyin. Akışı atın ve bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Kolona 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolonu dikkatlice nükleaz içermeyen bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Doğrudan kolon matrisine 50 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve RNA'yı santrifüjleme yoluyla elüte edin. 200 μL'lik mikrofüj tüpleri kullanarak 10 μL'lik alikotlar hazırlayın.</li>
	<li>Hemen buza alikotlar koyun ve RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için bunlardan birini kullanın.</li>
	<li>RNA bütünlüğünü ve mikroRNA konsantrasyonunu ölçmek için 100 ng/μL'ye ayarlanmış 5 μL toplam RNA'dan oluşan bir alikot hazırlayın.</li>
	<li>Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Olgun adiposit RNA konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün belirlenmesi; mikroRNA miktar tayini testi
NOT: RNA konsantrasyonu ve saflık tayinleri bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak gerçekleştirilir; RNA bütünlüğü ve miRNA nicelemesi, bir RNA kalite kontrol analizörü kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>Numune okuyucuyu moleküler dereceli suyla yıkayın ve silin.</li>
	<li>2 μL elüsyon suyu (boş) yükleyin, ayarı RNA olarak değiştirin ve Boş düğmesine tıklayın.</li>
	<li>2 μL numune yükleyin ve Ölç düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Okuma tamamlandıktan sonra, A260/A280 ve A260/A230 oranlarının yanı sıra RNA miktarını (ng/μL) kaydedin (Şekil 1A). NOT: OD260/OD280 ve OD260/OD230 oranı 2.0 civarında olan RNA saf kabul edilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek bir RNA bütünlük kiti kullanarak RNA bütünlük numarasını (RIN) ölçün (Şekil 1B). NOT: BIR RIN =10, bozulmamış RNA'ya karşılık gelirken, bir RIN ≤ 3.0, güçlü bir şekilde bozulmuş bir RNA'yı gösterir. İfade mikrodizileri veya RT-qPCR için RIN ≥ 6.0 ile RNA kullanın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek mikroRNA'ların konsantrasyonunu ve yüzdesini belirlemek için küçük bir RNA kiti kullanın (Şekil 1C). NOT: Küçük ve mikro RNA'ların fazla tahmin edilmesini önlemek için, RIN ≥ 6.0 ile RNA örneklerini kullanın.</li>
</ol>6. Stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin sayısı ve canlılığı
<ol><li>10 μL SVF hücre süspansiyonunu (bölüm 2.24) 90 μL %0.4 Tripan Mavisi Çözeltisine (son seyreltme 1:10) seyreltin ve standart bir hemositometreye 10 μL uygulayın.</li>
	<li>Canlı hücreleri, ölü hücreler hariç, sayım odasının köşesindeki dört karede dikkatlice sayın.</li>
	<li>Orijinal süspansiyonda bulunan hücre konsantrasyonunu belirleyin: Hücre konsantrasyonu = Toplam hücre sayısı/4 x seyreltme faktörü (10) x 10.000 = Hücreler/mL</li>
	<li>Elde edilen hücresel verimi (doku gramı başına hücre) hesaplamak için, hücresel konsantrasyonu orijinal toplam numune hacmi (mL cinsinden) ile çarpın ve sindirilen dokunun ağırlığına (gram cinsinden) bölün.</li>
	<li>Hücre canlılığını canlı hücrelerin yüzdesi olarak şu şekilde değerlendirin: % Canlılık = (Canlı hücre sayısı / Toplam hücre sayısı) x 100.</li>
</ol>7. Stromal vasküler fraksiyondan makrofaj alt gruplarının karakterizasyonu
<ol><li>4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme yoluyla akış sitometrisi ve pelet hücreleri için toplam 1 x 106 SVF hücresi/mL'yi 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne aktarın.</li>
	<li>Peleti gevşetmek için dikkatlice vorteksleyin ve hücreleri RT'de 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hücre yüzeyi antijeni için spesifik olan her bir florokrom konjuge monoklonal antikorun önceden titre edilmiş optimal konsantrasyonunu ekleyin; hafifçe karıştırın ve RT'de karanlıkta 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Fazla soğuk 1x PBS (≈ 1 mL) ekleyin ve SVF'yi 400 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantları dekantasyon ile hızla atın. Peletleri rahatsız etmemeye dikkat edin.</li>
	<li>500 μL 1x parçalama çözeltisi ekleyin ve tüpleri doğrudan ışıktan koruyarak RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjledikten sonra çözeltiyi çıkarın ve veri alınana kadar karanlıkta 2-8 °C'de saklayın.</li>
	<li>Elde etmeden önce agregasyonu azaltmak için hücreleri düşük hızda iyice vorteksleyin.</li>
	<li>SVF peletini RT'de 5 mL kılıf sıvısı içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücre ayırıcı hatlarının tıkanmasını azaltmak için akış sitometrisi ile analizden önce üç kat gazlı bezden yeni bir 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne süzün.</li>
	<li>Analizden önce her tüpü kısaca vorteksleyin.</li>
	<li>İlgilenilen örneklerden veri elde edin. Akış analizi için en az 10.000 olay sayın. NOT: Bir hücre sıralama akış sitometresi kullanıyorsanız, sonraki çalışmalarda uygulama için makrofajları ayırın.</li>
</ol>8. Geçit stratejisi
<ol><li>Singlet popülasyonunu belirlemek için İleri Dağılım (FSC) alanına göre yüksekliği veya genişliği çizin (Şekil 2A).</li>
	<li>Hücresel kalıntıları atarak FSC'ye karşı Yan Dağılım (SSC) alanını çizen hücreleri seçin (Şekil 2B).</li>
	<li>Seçilen hücrelerden, CD45'i hematopoietik hücreler olarak ifade eden popülasyonları tanımlayın (Şekil 2C) ve CD45 / CD14 çift pozitif hücreleri makrofajlar olarak tanımlayın (Şekil 2D).</li>
	<li>CD45+/CD14+ makrofajlarından negatif ve pozitif HLA-DR hücrelerini tespit edin (Şekil 2E). NOT: Antikor paneli için kompanzasyon kontrollerini dahil edin ve panel için yeterli olan çok renkli bir akış sitometresinde spektral örtüşmeyi ayarlayın. Üç lazerle (405 nm mor lazer, 488 nm mavi lazer ve 640 nm kırmızı lazer) donatılmış bir sitometre ve belirtilen florokromlar için dedektörler kullanarak akış sitometrisi analizi yapıyoruz.</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

KDV, metabolik düzenleme ve inflamasyonda çok önemli bir rol oynar. Obezite ile ilişkili kronik inflamasyonda adipositlerin ve immün hücrelerin rolüne olan ilginin artması, AT'de bulunan SVF ve yağ hücrelerini ayırmak için farklı tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu teknik, adipositler ve SVF hücreleri arasındaki etkileşimlerle ilgili çalışmalar için çok önemli olabilecek tek bir prosedürde aynı KDV biyopsisinden aşağı akış uygulamaları için uygun olan bu iki farklı hücre setinin elde edilmes...

Beyaz yağ dokusu sadece yağ hücrelerinden veya adipositlerden değil, aynı zamanda makrofajlardan, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) olarak diğer bağışıklık hücrelerinden ve eozinofillerden, preadipositlerden ve fibroblastlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu içeren stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak bilinen yağsız bir hücre fraksiyonundan oluşurve vasküler ve bağ dokusu ile çevrilidir 1,2. Yağ dokusu (AT) artık otokrin, parakrin ve endokrin etkileri ile farklı hücreler tarafından üretilen ve dokuya salınan adipokinler, sitokinler ve mikroRNA'lar aracılığıyla metabolizma ve iltihaplanma ile ilgili fizyolojik süreçleri düzenleyen bir organ olarak kabul edilmektedir 3,4. İnsanlarda beyaz yağ dokusu, deri altı yağ dokusu (SAT) ve viseral yağ dokusunu (VAT) içerir ve aralarında önemli anatomik, moleküler, hücresel ve fizyolojik farklılıklar vardır 2,5. SAT, insan AT'sinin %80'ini temsil ederken, VAT karın boşluğunda, özellikle mezenter ve omentumda bulunur ve metabolik olarak daha aktiftir6. Ayrıca VAT, vücut ağırlığı, insülin duyarlılığı, lipid metabolizması ve inflamasyon üzerinde önemli etkisi olan aracıları salgılayan bir endokrin organdır. Sonuç olarak, KDV birikimi abdominal obeziteye ve tip-2 diyabet, metabolik sendrom, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık riski gibi obezite ile ilişkili hastalıklara yol açar ve obezite ile ilişkili mortalitenin daha iyi bir yordayıcısını temsil eder 6,7,8,9.
Homeostatik koşullarda, adipositler, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, anti-enflamatuar mediatörlerin salgılanması yoluyla KDV metabolizmasını sürdürmek için işbirliği yapar10. Bununla birlikte, aşırı KDV genişlemesi, aktive edilmiş T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve makrofajların alımını teşvik eder. Nitekim yağsız KDV'de makrofajların oranı %5 iken, obezitede bu oran %50'ye kadar yükselmekte, makrofaj polarizasyonu ile anti-inflamatuardan pro-inflamatuar fenotipe doğru kronik inflamatuar bir ortam oluşturmaktadır10,11.
Obezite pandemisinin bir sonucu olarak, diğerlerinin yanı sıra adiposit biyolojisi, epigenetik, inflamasyon, endokrin özellikler ve hücre dışı veziküller olarak ortaya çıkan alanlar dahil olmak üzere farklı KDV araştırma konularını ele alan şaşırtıcı sayıda rapor ortaya çıkmıştır 8,10,12,13. Bununla birlikte, KDV ortamı, adipositler ile yerleşik veya gelen makrofajlar arasındaki karışma ile tanımlansa da, çoğu çalışma yalnızca bir hücre popülasyonuna odaklanmıştır ve bu hücrelerin KDV'deki etkileşimi ve patofizyolojik sonuçları hakkında çok az bilgi vardır11,14. Ayrıca, AT'de adiposit-makrofaj etkileşimini ele alan değerli çalışmalar, in vivo hazırlama koşullarından yoksun hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir 11,14,15. Bu hücrelerin KDV'deki etkileşimini veya özel katkısını incelemek için uygun bir strateji, KDV metabolizmasını düzenleyen in vivo özellikleri mümkün olduğunca benzer şekilde yansıtan in vitro tahliller gerçekleştirmek için her iki hücre tipinin de aynı yağ biyopsisinden izole edilmesini gerektirir.
AT'yi kırmak için mekanik kuvvetlere dayanan enzimatik olmayan ayrışma yöntemleri minimum manipülasyon sağlasa da, enzimatik yöntemlere kıyasla hücre geri kazanımında daha düşük etkinliğe ve düşük hücre canlılığına sahip olduklarından ve daha büyük bir doku hacmine ihtiyaç duyulduğundan, amaç SVF hücrelerini incelemek ise bu yöntemler kullanılamaz16,17. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, WAT18 gibi fibröz dokuların kollajen ve hücre dışı matriks proteinlerinin yeterli sindirimine izin veren nazik bir yöntemdir ve tripsin etkisiz veya zararlı olduğundasıklıkla kullanılır 19. Protokol, bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanarak, insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar ve aşağı akış ekspresyon uygulamaları için mikroRNA'lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden toplam RNA'nın yüksek verimini (miktar, saflık ve bütünlük) sağlamak için bilgi verir. Eşzamanlı olarak, protokol, akış sitometrisi20 ile daha fazla analiz için çoklu zara bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF hücrelerinden makrofaj alt kümelerini tanımlamak için optimize edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL PCR tüpleri</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipetler</td><td>Corning</td><td>CLS4101-50EA</td><td>Ayrı ayrı plastik sarılı</td></tr><tr><td>10 ve mikro; L üniversal pipet ucu</td><td>Axygen</td><td>T-300-L-R</td><td>RNase, DNaz içermez ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>10 &mikro; L üniversal pipet ucu</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L üniversal pipet ucu</td><td>Axygen</td><td>T-1000-BR</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>2.0 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>200 &mikro; L üniversal pipet ucu</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R</td><td>RNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Cihazı</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>G2939BA-2101 Biyoanalizör PC</td><td>Agilent</td><td>G2953CA</td><td>2100 PC'ye önceden yüklenmiş Uzman Yazılım</td></tr><tr><td>5 ml Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü</td><td>Corning</td><td>352003&nbsp;</td><td>Çıtçıtlı kapak, steril</td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>CLS430828-100EA</td><td>Polipropilen, konik tabanlı ve steril</td></tr><tr><td>Asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktif</td><td>Zymo Research</td><td>R2050-1-200</td><td>TRI Reaktifi veya benzeri</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511-Agilent</td><td></td></tr> <tr><td>Küçük RNA Kiti</td><td>Agilent</td><td>5067-1548-APC</td><td></td></tr><tr><td>/Cy7 anti-insan CD14 Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>325620</td><td>0.4 mg / 106 hücreleri, monositler / makrofajlar üzerinde bulunur, klon HCD14</td></tr><tr><td>Baker</td> <td>-</td><td></td> <td>250 ml, steril olmayan</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912-100G</td><td>Isı şoku fraksiyonu, pH 5.2, & ge; % 96</td></tr> <tr><td>Talaş hazırlama istasyonu</td><td>Agilent</td><td>5065-9951-Kollajenaz</td><td></td></tr> <tr><td>tip II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td>Toz</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>Zymo Research</td><td>R2051</td><td>50 mL TRI reagen</td></tr><tr><td>Diseksiyon forseps</td> ile birlikte verilir <td>-</td><td></td> <td>Çelik, tırtıklı çeneler ve yuvarlak uçlar</td></tr><tr><td>Diseksiyon tepsisi</td> <td>-</td><td></td> <td>Paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td>200 & kanıt, moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>FACS Akış Kılıfı Sıvısı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>342003-FACS Lizasyon Çözeltisi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>349202-FACSAria III Akış Sitometresi/Hücre Sıralayıcısı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>648282-FASCDiva Yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td>642868</td><td>Yazılımı v6.0 önceden yüklenmiş</td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA-Manuel</td><td></td></tr> <tr><td>hücre sayacı</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mayo diseksiyon makasları</td> <td>-</td><td></td> <td>Paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td> <td>-</td><td></td> <td>Ayarlanabilir sıcaklık</td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ND2000LAPTOP-Orbital çalkalayıcı</td> <td>-</td><td></td> <td>Ayarlanabilir sıcaklık ve hız</td></tr><tr><td>P10&nbsp; Değişken Hacim&nbsp; Mikropipet&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel-Finnpipet</td><td>4642040</td><td>1 ila 10 &mu; L</td></tr><tr><td>P1000&nbsp; Değişken Hacim&nbsp; Mikropipet&nbsp;</td><td>Thermo Scientific-Finnpipette</td><td>4642090</td><td>100 ila 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>P2&nbsp; Değişken Hacim&nbsp; Mikropipet&nbsp;</td><td>Thermo Scientific-Finnpipette</td><td>4642010</td><td>0.2 ila 2 & mu; L</td></tr><tr><td>P200&nbsp; Değişken Hacim&nbsp; Mikropipet&nbsp;</td><td>Thermo Scientific-Finnpipette</td><td>4642080</td><td>20 ila 200 &mu; L</td></tr><tr><td>PCR tüpü saklama rafı</td><td>Axygen</td><td></td> <td>R96PCRFSP-PE</td></tr><tr><td>/Cy5 anti-insan HLA-DR Antikoru BioLegend</td><td></td><td>307608</td><td>0.0625 mg / 106 hücreleri, makrofajlarda bulunur, klon L243</td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-insan CD45</td><td>Antikoru BioLegend</td><td>304016</td><td>0.1 mg / 106 hücreleri, lökositlerde bulunur, klon H130</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>Tozu, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için</td></tr><tr><td>Pipet kontrolörü</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kırmızı Kan Hücreleri Lizis Tamponu</td><td>Roche</td><td>11 814 389 001</td><td>İnsan tam kanından kırmızı kan hücrelerinin tercihli lizisi için</td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td> <td>-</td><td></td> <td>50 mL konik tüpler için beyaz adaptör</td></tr><tr><td>Steril Numune kabı</td> <td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Thermo Scientific-Samco</td><td>204-1S</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Tripan Mavi</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>%0,4</td></tr><tr><td>Çözelti Tüp rafları</td> <td>-</td><td></td> <td>Farklı tüp boyutları için</td></tr><tr><td>Vortex Mini Shaker</td><td>Cientifica SENNA</td><td>BV101</td><td>-</td></tr></tbody></table>

İnsan viseral yağ dokusundan canlı adiposit ve stromal vasküler fraksiyonun rna analizi ve makrofaj fenotiplemesine uygun İzolasyonu

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Viseral yağ dokusu (VAT), metabolik, hormonal ve immün süreçleri kontrol eden farklı biyoaktif molekülleri serbest bırakan, esas olarak olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinden oluşan aktif bir metabolik organdır; Şu anda, bu süreçlerin yağ dokusu içinde nasıl düzenlendiği belirsizdir. Bu nedenle, her hücre popülasyonunun yağ dokusunun patofizyolojisine katkısını değerlendiren yöntemlerin geliştirilmesi çok önemlidir. Bu protokol, izolasyon adımlarını açıklar ve bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanılarak insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF'nin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için gerekli sorun giderme yönergelerini sağlar. Ayrıca, protokol ayrıca makrofaj alt kümelerini tanımlamak ve gen ekspresyonu çalışmaları için olgun adiposit RNA izolasyonu gerçekleştirmek için optimize edilmiştir, bu da bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi inceleyen çalışmaların yapılmasına izin verir. Kısaca, KDV biyopsileri yıkanır, mekanik olarak kıyılır ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için sindirilir. Santrifüjlemeden sonra, olgun adipositler, SVF peletinden yüzdürme yoluyla izole edilir. RNA ekstraksiyon protokolü, aşağı akış ekspresyon deneyleri için adipositlerden yüksek miktarda toplam RNA (miRNA'lar dahil) verimi sağlar. Aynı zamanda, SVF hücreleri, akış sitometrisi analizi yoluyla makrofaj alt kümelerini (pro- ve anti-inflamatuar fenotip) karakterize etmek için kullanılır.

Bu protokol, parsiyel omentektomi sonrası sağlıklı gebe kadınlardan elde edilen KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositleri ve SVF hücrelerini tek bir işlemde izole etmek için kollajenaz sindirimi ve ardından diferansiyel santrifüjleme kullanan enzimatik bir yöntemi açıklar. Bu durumda, RNA ekstraksiyonu için adipositleri ve makrofaj fenotiplemesi için SVF'yi kullanıyoruz.
RNA ekstraksiyon protokolü, yeterli saflıkta, yüksek bütünlükte RNA ve olgun adipositlerden mikroRNA'lar elde edilmesini ...

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Bu protokol, insan viseral yağından canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon SVF hücrelerinin izolasyonuna ve çalışmasına izin verir. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, ekspresyon analizi için uygun mikroRNA'lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden yüksek toplam RNA verimi sağlar. Eşzamanlı olarak, yöntem makrofajları akış sitometrisi ile tanımlamak için optimize edilmiştir.Bu protokol, canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin insan KDV biyopsilerinden tek bir işlemde kolay ve verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar. Rahim kapanması ve hemostaz sonra, daha büyük omentum tanımlayın ve ıslak bir kompres üzerinde uzatın. Bir avasküler bölge belirleyin ve viseral yağ dokusunun veya VAT'ın dış tarafını delmek için Kelly forseps kullanın.KDV'nin delindiği bölgede proksimal ve distal tarafı klemplemek için Ochsner forseps kullanın ve dokuyu kesmek için Metzenbaum makası kullanın. Büyük omentumu bir numaralı siyah ipek ile bağlayın, ardından Ochsner forsepslerini çıkarın ve hemostazı değerlendirin. Enzimatik sindirimi gerçekleştirmek için, dört gram KDV'yi kesin ve dokuyu bir diseksiyon tepsisinde küçük parçalar halinde doğramak için makas kullanın.Parçaları yeni bir steril 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve 25 mililitre sindirim solüsyonu ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca 125 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Daha sonra sindirilmiş dokuyu üç kat gazlı bezden geçirerek yeni bir steril 50 mililitrelik santrifüj tüpüne süzün.Tüpü 200 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra iki faz görünür olmalıdır. Üst faz olgun adipositlere karşılık gelirken, SVF hücreleri pelette kalır.Olgun adipositleri bir tüpe aktarın. 1000 mikrolitre asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktif ekleyerek hücreleri parçalayın ve homojenize etmek için bir P1000 mikropipet ile iyice karıştırın. Nükleo-protein komplekslerinin ayrışmasını hızlandırmak için karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Üç faz, adiposit lipidlerine karşılık gelen bir üst sarı faz, nükleik asitlere karşılık gelen bir orta pembe faz ve hücresel kalıntı içeren bir pelet elde etmek için hücre lizatını 12.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Lipid tabakasını bir P200 mikro pipetle dikkatlice çıkarın. Daha sonra orta fazı, diğer fazları rahatsız etmemeye dikkat ederek iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.RNA'yı saflaştırdıktan ve konsantrasyonu bir UV görünür spektrofotometre ile ölçtükten sonra, RNA bütünlük numarasını belirlemek için bir RNA bütünlük kiti kullanın. Ardından, mikroRNA'ların konsantrasyonunu ve yüzdesini belirlemek için küçük RNA kitini kullanın. Klipsi bir biyoanalizöre yerleştirin.10 mikrolitre SVF hücre süspansiyonunu 90 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi çözeltisine seyreltin ve standart bir hemositometreye 10 mikrolitre uygulayın. Canlı hücreleri, ölü hücreler hariç, sayım odasının köşesindeki dört karede dikkatlice sayın. Akış sitometrisi için mililitrede toplam 1 milyon SVF hücresini beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polipropilen test tüpüne aktarın ve hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 800 G'de santrifüjleme ile peletleyin.Peleti gevşetmek ve hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse etmek için dikkatlice girdaplayın. Bir hücre yüzeyi antijeni için spesifik olan her bir florokrom konjuge monoklonal antikorun önceden titre edilmiş optimal konsantrasyonunu ekleyin ve hafifçe karıştırın, ardından hücreleri karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Fazla miktarda soğuk PBS ekleyin.Ve SVF'yi 400 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı boşaltın. Peleti beş mililitre kılıf sıvısı içinde yeniden süspanse edin.Daha sonra hücreleri üç kat gazlı bezden geçirerek yeni bir beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne süzün. Analizden önce her tüpü kısa bir süre vorteksleyin ve akış analizi için en az 10.000 olay sayın. Bu RNA ekstraksiyon protokolü, olgun adipositlerden yeterli saflıkta ve yüksek bütünlüklü RNA ve mikroRNA'lar elde etmek için kullanıldı.RNA bütünlüğü, bir RNA kalite kontrol analizörü tarafından değerlendirildi. Viseral yağ dokusunun gramı başına yaklaşık 2.8 kez 10 ila altı çekirdekli hücre mevcuttu. Stromal vasküler fraksiyon hücreleri, floresanla aktive edilen hücre sıralama analizi ile 18 makrofajı tanımlamak ve karakterize etmek için floroforla konjuge primer antikorlarla etiketlendi.Hücre agregaları, ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma yüksekliği çizilerek analizden çıkarıldı. Daha sonra, ileri saçılma alanı ve yan saçılma alanı kullanılarak, doğru boyut ve karmaşıklığa dayalı olarak hücrelerin kapılanması ile hücresel kalıntılar hariç tutuldu. Makrofajları analiz etmek için, monosit ve makrofaj soy hücreleri CD45 ve CD14 belirteçleri kullanılarak seçildi.Daha sonra, CD45-CD14 çift pozitif hücreler, makrofaj markörü HLA-DR ekspresyonuna dayalı olarak ayrıldı. İki makrofaj alt kümesi tanımlandı. Bu protokol, yeni hücre fenotiplerinin tanımlanmasına ek olarak, DNA metilasyonu, translasyon sonrası modifikasyonlar ve sinyal yolları gibi gelecekteki analizler için saflaştırılmış hücre popülasyonlarının kullanılmasını mümkün kılar.

isolation-viable-adipocytes-stromal-vascular-fraction-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Öğrenin, insan viseral yağ dokusundan kollagenaz sindirimiyle canlı adiposit ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin izolasyonunu. Akış sitometrisiyle makrofaj fenotiplemesi ve yüksek kaliteli RNA analizi için optimize edilmiştir.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Daha fazla video keşfet