Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Thermobia domestica bazal bir böcek olduğu için, bu tür üzerinde yapılan genetik çalışmalar, böceklerdeki motorlu uçuş ve metamorfozlar gibi önemli yeniliklerin evriminin altında yatan mekanizmaları aydınlatacaktır. Bu protokol, Thermobia'yı bir laboratuvar model türü olarak uygulamak için kültür bakımından yumurta mikroenjeksiyonuna kadar temel teknikleri kapsar. Bu yöntem aynı zamanda RNI aracılı gen yıkımı ve termobide transgenez gibi diğer genetik araçların uygulanması için de kullanılabilir.

Yabani tip ve mutant popülasyonları, normal yapay balık yemi, üstünde havalandırma deliği olan plastik kaplarda su, böcekleri saklamak için katlanmış bir kağıt ve yumurtlamak için katmanlı pamuk içeren büyük bir plastik kapta tutun. Tüm T.domestica kültürlerini 37 derece Santigrat derece kuluçka makinelerinin içinde tutun ve her bir kabın içindeki bağıl nemi %60 ila 80'e ayarlayın Yumurta toplama kolonilerini hazırlamak için yaklaşık 20 erkek ve 20 dişi yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış bir kağıt ve yumurtlamak için küçük bir parça katmanlı pamuk içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın. Kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni oluşturun.

Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yeni pamukla değiştirin. Sekiz saat sonra, forseps kullanarak katmanları ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın. Yumurtalar arasında iki milimetre mesafe bırakarak ıslak bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çift taraflı bant üzerine hizalayın.

Tüm yumurtalar, bir yumurtanın uzunlamasına ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir. Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın. İki mikrolitre gRNA CAS9 solüsyonunu bir mikro yükleyici ile bir cam enjeksiyon kılcal damarına yükleyin.

Enjeksiyondan önce solüsyonda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Gerekirse, baloncukları çıkarmak için iğneye hafifçe vurun. Tıkanmayı önlemek ve bir dizi enjeksiyon boyunca daha iyi dayanıklılık elde etmek için iğne ucunun şeklini forseps ile hafifçe kırarak optimize edin.

İğneyi bir yumurtanın uzunlamasına ekseninin orta noktasına yerleştirin ve az miktarda çözelti enjekte edin. İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikro enjektörün konfigürasyonunu ayarlayın. Enjekte edilen yumurtaları 37 santigrat derecede %60 ila 80 bağıl neme sahip uygun büyüklükte bir kapta saklayın.

Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar oluşumunu önlemek için hasarlı yumurtaları atın. Bir yumurta üzerinde çok fazla mantar büyüyorsa, yumurtanın yüzeyini %70 etanol ile temizleyin. Yumurtadan çıkmadan önce, çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla birlikte cam slaytı talk pudrasına batırın.

Bu, yumurtadan çıkan nimflerin istiflenmesini önleyecektir. Toz boyalı cam slaytları yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın. G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 oyuklu plakaya izole edin.

Yapay düzenli balık yemi tedarikini sürdürün. 24 oyuklu plakayı% 60 ila 80 nem için su kaynağı olan daha büyük bir kaba yerleştirin Forseps kullanarak bir peri veya yetişkinden bir cercus sıkıştırın ve çekin ve bunları 50 mikrolitre etanol içeren 0.2 mililitrelik bir tüpe toplayın. Toplanan numuneleri uzun süreli saklama için eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Etanolü buharlaştırmak için numune tüplerini kapakları açık olarak 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin. Yumurtlamadan sonraki ilk sekiz saat içinde embriyolara gRNA CAS9 ribonükleoprotein kompleksinin enjeksiyonu, gRNA hedeflenen bölgede indellerle sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin bazı hücrelerinde bialelik mutasyonlara neden olur ve genellikle mutant mozaik fenotipler elde edilir.

Bu protokol, beyaz geni hedeflemek için tasarlanmış bir gRNA'yı enjekte etmek için kullanıldığında, G0 nimflerinin% 32.6'sı bileşik gözlerinde ve sırt bölgelerinde kısmi bir pigmentasyon kaybı gösterdi. G0 yetişkinlerinin ve mutasyona uğramış G1 bireylerinin germ hattı dönüşümünün değerlendirilmesi genomik PCR ile yapıldı ve ardından hetero dupleks hareketlilik testi yapıldı. G1 örneklerinde, vahşi tip ve mutasyona uğramış örnekler arasındaki diferansiyel bant modelleri açıkça ayırt edilebilir.

Thermobia'da genom düzenleme, böceklerin erken özelliklerinin altında yatan genetik mekanizmaları analiz etmek için sağlam bir yaklaşım sağlar. Onların ve bizim olağanüstü başarımızın ardındaki sırları keşfetmeye yardımcı olur.