Name: Firebrat Thermobia domesticada Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Öğrenin Thermobia domestica'da yumurta mikroenjeksiyonu ve verimli çiftleşme yöntemleriyle genom düzenleme tekniklerini. Bu protokol, mutant suşların oluşturulması ve sürdürülmesi için laboratuvar modeli olarak kullanımı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TO ve TD, sırasıyla JSPS KAKENHI hibe numaraları 19H02970 ve 20H02999 tarafından desteklenmiştir.

1. Laboratuvar kolonilerinin bakımı
<ol><li>Wildtype ve mutant popülasyonlarının bakımı için, düzenli yapay balık maması içeren büyük bir plastik kap (460 mm x 360 mm x 170 mm), üstünde havalandırma deliği bulunan plastik bardaklarda su, böcekleri gizlemek için katlanmış bir kağıt ve yumurta bırakmak için katmanlı pamuk kullanın (Şekil 2A). Tüm T. domestica kültürlerini 37 °C inkübatörlerin içinde tutun ve her kabın içindeki bağıl nemi (RH) %60-%80 olarak ayarlayın. NOT: T. domestica atmosferden su buharını emdiği için11, doğrudan su kaynağına gerek yoktur. Uygun RH, üstte havalandırma deliği içeren plastik bardaklardan veya her kabın içindeki kapaksız bardaklardan su buharı bulunması nedeniyle korunur. Kültürleri içeren tüm bir inkübatörün içinde nemlendirmeye gerek yoktur. Bu protokolde açıklanan koşul altındaki her gelişim aşamasının yaklaşık süresi Şekil 1'de gösterilmiştir. Gelişim hızı sıcaklık ve/veya RH12değiştirilerek ayarlanabilir.</li>
	<li>Periyodik olarak yiyecek ekleyin. Kurumadan önce su ekleyin.</li>
	<li>Yetişkinlerin kirli bir ortamda ve/veya yoğun popülasyonda yumurta bırakmayı bıraktığı göz önüne alındığında, popülasyonları en az 3 ayda bir yeni bir temiz kaba aktarın (bkz. Tartışma).</li>
</ol>2. Yumurta toplama ve mikroenjeksiyon
<ol><li>Kılavuz RNA (gRNA) tasarlama<ol>
<li>Gerekli her hedef için bir gRNA dizisi tasarlayın ve olası hedef dışı tanıma alanlarını kontrol etmek için gRNA dizilerini genom tertibatı ile patlatın.</li>
		<li>GRNA'ları üreticinin talimatlarına göre sentezlemek ve arındırmak8. NOT: Örnek olarak, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı beyaz geninin hedeflenmesi durumunda, 20 bp hedef dizisi tasarlanmış ve iki sentezlenmiş DNA oligonükleotid 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' ve 5'-TTCTAGCTAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' sipariş edilmiştir. DNA şablonu, bu iki oligonükleotid ve ardından PCR amplifikasyonu tavlanarak hazırlandı ve gRNA daha sonra şablondan bir T7 RNA polimeraz ile in vitro olarak yazıldı.</li>
	</ol></li>
	<li>Yumurta toplama kolonileri hazırlayın<ol>
<li>Yaklaşık 20 erkek ve 20 kadın yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış kağıt ve yumurtlama için küçük bir katmanlı pamuk parçası ile orta büyüklükteki bir kaba (200 mm x 150 mm x 90 mm) aktarın(Şekil 2B).</li>
		<li>Genom düzenleme için kullanılacak kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni kurun. NOT: 37 °C'de 8 saat sonra bir koloniden yaklaşık 20-40 yumurta toplanması beklenir. Transfer edilen yetişkinlerin, muhtemelen yeni bir ortama adaptasyon nedeniyle yumurta bırakmaya başlamaları genellikle birkaç gün sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yenileriyle değiştirin.</li>
	<li>Normal 76 mm x 26 mm cam kaydırağa 76 mm x 5 mm çift taraflı bant yerleştirin.</li>
	<li>Sekiz saat sonra, katmanları kümesleri kullanarak ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın.</li>
	<li>Yumurtaları ıslak bir boya fırçası kullanarak çift taraflı bantta hizalayın ve yumurtalar arasında 2 mm mesafeyi koruyun. Tüm yumurtalar, bir yumurtanın boyuna ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir (Şekil 3A). Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın. NOT: Bu protokolde mantar, ıslak ve sıcak durumda hasarlı enjekte edilmiş yumurtalarda hızlı büyür. Çapraz kontaminasyonu ve mantarın genişlemesini önlemek için yumurtalar arasındaki mesafeyi korumak önemlidir.</li>
	<li>GRNA ve Cas9 proteinini sırasıyla 100 ng/μL ve 500 ng/μL'lik son konsantrasyonda karıştırın. Seyreltme için damıtılmış su kullanın. Ribonucleoprotein kompleks oluşumunu teşvik etmek için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından karışımı buzda tutun. NOT: Enjekte edilen miktarı izlemek için enjeksiyon çözeltisine % 1 nihai konsantrasyonda nötr kırmızı eklenebilir.</li>
	<li>GRNA/Cas9 çözeltisinin 2 μL'sini bir mikro doldurucu ile cam enjeksiyon kılcal damarı içine yükleyin. Enjeksiyondan önce çözeltide hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Gerekirse, kabarcıkları çıkarmak için iğneye dokunun. NOT: Bu deneyde, ince bir iğne ucu elde etmek için hazır bir iğne kullanılır (Şekil 3B). Bunun yerine benzer şekle sahip ev yapımı bir iğne kullanılabilir.</li>
	<li>Daha önce gRNA/Cas9 çözeltisi ile yüklenen cam enjeksiyon kılcal damarını manipülatörle donatılmış bir tutucuya sabitleyin ve tutucuyu elektronik bir mikroinjektöre bağlayın.</li>
	<li>Bir dizi enjeksiyon boyunca tıkanmasını ve daha iyi dayanıklılık elde edilmesini önlemek için iğne ucunun şeklini biraz kırarak optimize edin (Şekil 3C'deuygun bir iğne örneği gösterilmiştir). NOT: Bir iğne tıkandığında değiştirilmesi önerilir. Yine tokalarla kırılırsa aynı iğne ile enjekte etmeye devam etmek mümkündür, ancak daha geniş bir uç daha fazla yumurta hasarına yol açar ve hayatta kalma oranını düşürür. T. domestica yumurtaları yumuşak ve kırılgan olduğundan, ince bir iğne ucu tutmak enjeksiyondan sonra yüksek hayatta kalma oranına sahip olmak için anahtardır.</li>
	<li>İğneyi bir yumurtanın boyuna ekseninin orta noktasına yerleştirin ve çözeltinin hafif bir miktarını enjekte edin (enjeksiyon miktarına referans için Şekil 3D-H'ye bakın). İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikroenjektörün konfigürasyonunu ayarlayın. NOT: Enjeksiyon sırasında sabit bir basınç uygulanması önerilir, aksi takdirde yapışkan yumurta içeriği cam iğneye kolayca akabilir ve tıkayabilir. Çözüm, enjekte edilen sıvı miktarına bağlı olarak kısa bir basınç darbesi veya sabit bir basınçla enjekte etmek olabilir. Bir iğne ucu geniş bir açıklığa sahip olduğunda, bir yumurtaya çok fazla çözelti enjekte edildiğini ve bunun ölümcülliğe neden olduğunu unutmayın (Şekil 3F-H). Bu durumda, sabit basınçla sabit bir sıvı akışı sağlayın, ardından iğneyi bir yumurtaya yerleştirin ve hemen çekin. Çok fazla taşma veya yumurta patlamasına neden olursa, iğneyi değiştirin.</li>
	<li>Enjekte edilen yumurtaları% 60-80 RH ve 37 ° C ile enjekte edilen yumurta sayısına uygun boyutta bir kapta tutun (<20 yumurta: küçük tabak; >20 yumurta: orta boy kap).</li>
</ol>3. Çiftleşme
<ol><li>Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar büyümesini önlemek için hasarlı yumurtaları tokmaklarla atın (Şekil 3I,J). Bir yumurtada çok fazla mantar yetişmesi durumunda, yumurtanın yüzeyini% 70 EtOH ile temizleyin.</li>
	<li>Kuluçkadan önce (yumurtlamadan sonra 37 °C'de yaklaşık 10 gün), çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla cam kaydırağı talk tozuna batırın. Bu, yumurtadan çıkmış nimflerin istiflenerek önlenmesini önleyecektir. Toz kaplı cam slaytları, böceklerin saklanması için yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın.</li>
	<li>Nimfler yumurtadan çıktıktan sonra cam slaytları çıkarın. Yetişkinliğe ulaşana kadar periyodik olarak yiyecek tedarik edin. NOT: Bireylerin yumurtadan çıktıktan sonra yetişkinliğe ulaşması yaklaşık 2,0-2,5 ay sürer (Şekil 1A). Yetişkin aşaması kadınlarda iyi gelişmiş bir ovipozitöre göre değerlendirilmektedir (Şekil 1B).</li>
	<li>Bireyleri çiftleşmek için, bir laboratuvar kolonisinden orta büyüklükteki kaba gerektiği kadar wildtype kadın yetişkin aktarın ve bakir olduklarından emin olmak için 37 ° C'de en az 14 gün kuluçkaya yatırın. NOT: Bir laboratuvar kolonisinden bakire dişileri toplamak gerekli değildir, çünkü yetişkin T. domestica"üreme ve kalıplama döngüsü" adı verilen tekrarlanan bir kalıplama ve çiftleşme döngüsüne sahiptir, bu sırada dişiler her eriyikle spermleri atar ve bir sonraki döllenme döngüsünde tekrar çiftleşir13.</li>
	<li>Enjekte edilmiş bir yumurta ve wildtype yetişkin(ler) ile geliştirilen bir erkek veya dişi G0 yetişkinini yiyecek, katlanmış kağıt ve G1 yumurtalarını döşemek için küçük bir pamuk parçası(Şekil 2C'; çiftleşme kabı) ile küçük bir plastik tabağa aktarın. Çiftleşme yemeklerini% 60-% 80 RH (Şekil 2C)ile daha büyük bir kapta tutun. NOT: Bire bir eşleştirme ile yüksek başarı oranları elde edilmiş olmasına rağmen, başarılı çiftleşme şansını artırmak için bir yemeğe birden fazla wildtype yetişkin dahil edilebilir.</li>
</ol>4. Genotipleme
<ol><li>GRNA tarafından hedeflenen siteyi içeren 100-200 bp'lik bir ürünü yükseltmek için her gRNA için PCR astar çiftleri tasarlayın. Özgüllüğünü kontrol etmek için genom tertibatının her astar dizisini PATLATIN (Şekil 4A'da beyaz genin hedeflenmesi için bir örnek gösterilmiştir).</li>
	<li>G0 yetişkinlerinin mikrop çizgisi dönüşümlerini kontrol edin.<ol>
<li>Yumurtalar bırakıldıktan beş gün sonra, her G0 yetişkin çiftinden ayrı G1 yumurtalarını 0,2 mL tüplere toplayın (tüp başına bir yumurta; toplanan örnekleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). Yumurtaları toplamak için pamuk katmanlarını ayırın. NOT: Germline iletiminin başarısını değerlendirmek için her çiftleşme çiftinden en az 12 G1 nimf genotiplenmesi önerilir (bkz. Temsili Sonuçlar).</li>
		<li>Her tüpe 15 μL 0,25 mg/mL Proteinaz K çözeltisi (Tris-EDTA tamponunda çözünmüş) ekleyin, örnekleri kürdanla kısaca homojenize edin ve 55 °C'de 3 ila 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye yerleştirerek Proteinaz K'yi devre dışı bırak.</li>
		<li>Her tüpe 90 μL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın. Adım 4.1'de tasarlanan astarları içeren 10 μL PCR reaksiyon karışımında 2 μL süpernatant kullanın. NOT: Yeterli PCR amplifikasyonuna ulaşmak için ham şablonlar için optimize edilmiş bir DNA polimerazının kullanılması önerilir.</li>
		<li>PCR ürünlerini analiz etmek için mikroçip elektroforez sistemi ile heteroduplex hareketlilik tahlili (HMA) gerçekleştirin (Şekil 3B; bkz. Ohde vd., 2018)8. NOT: Mutasyonlar iki alternatif yöntemle değerlendirilebilir: (1) %8 poliakrilamid14gibi standart jel polimerli HMA; (2) T7 endonucleaz ile PCR ürünlerinin sindirimi ve ardından agarose jel elektroforez15.</li>
		<li>Sadece mikroplarında mutasyon içeren G0 yetişkinlerinden kaynaklanan G1 nimflerini saklayın ve diğerlerini atın.</li>
	</ol></li>
	<li>G1 nimflerinin/yetişkinlerinin bireysel genotiplemi<ol>
<li>G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 kuyulu plakalarda izole edin. %60–80 RH(Şekil 1D)tutmak için 24 kuyu plakalarını yukarıda açıklandığı gibi su kaynağı olan daha büyük bir kaba (örneğin, bu protokolde kullanılan orta büyüklükteki kap) yerleştirin. Yapay düzenli balık yemi tedarikini koruyun(Şekil 1D'). NOT: Bu adım nem ve yetişkin aşamalarının herhangi bir noktasında yapılabilmesine rağmen, yetişkinliğe ulaştıktan sonra ve eşleştirmeden hemen önce (enjeksiyondan 2,5 ay sonra) yapılması önerilir; Şekil 1B) çünkü ateş aşındırıcıları büyük bir kapta tutmak daha kolaydır. Aşağıdaki adımlarda her G1 nimfinin genotipini izlemek için bireysel yetiştirme gereklidir. Aynı G0 yetişkininden G1 nimfleri farklı mutasyonlara sahip olabilir.</li>
		<li>Cerci ve kaudal filamenti forseps kullanarak bir nimf / yetişkinden kıstırın ve çekin ve 50 μL EtOH içeren 0,2 mL'lik bir tüpe toplayın (toplanan numuneleri uzun süreli bir depolama için -20 ° C'de saklayın). NOT: Doku örnekleri EtOH'da toplanır, çünkü statik elektrik nedeniyle bu küçük numunelerin kaybını önler. Böceklerin hareketini durdurması gerekiyorsa, doku örnekleri alırken nemsiz / yetişkini buz üzerinde uyuşturun. T. domestica buz üzerinde uzun süreli soğudktan sonra hayatta kalamayacağından, onları bir dakikadan fazla uyuşturmayın ve hemen oda sıcaklığına geri taşıyın. Cerci ablasyon ve kaudal filament mortalite artışına neden olmaz.</li>
		<li>EtOH'u buharlaşmak için kapakları açık olan numune tüplerini 70 °C'de 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Genotipleme için 4.2.2–4.2.5 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Mutant bant deseninin gözlendiği PCR ürünlerini standart bir Sanger sıralama hizmetine gönderin.</li>
		<li>G1 nimflerini/yetişkinlerini istenen mutasyonlarla tutun ve diğerlerini atın (temsili bir sıralama sonucu için Şekil 4C'ye bakın).</li>
	</ol></li>
	<li>Bir çiftleşme kabında istenen mutasyonları içeren yetişkinleri geçin ve homozigöz bir mutant suşu oluşturmak için sonraki nesilleri elde edin.</li>
</ol>

<ol><li>Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019">http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019</a> (2019).</li>
<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+expression+pattern+of+labial%2C+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li>
<li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+%28Zygentoma%2C+Lepismatidae%29%3A+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li>
<li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes%2C+Clock+and+cycle%2C+in+the+firebrat+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%3A+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li>
<li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna%2C+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Biotechnology+and+Sericology%22%5BJournal%5D)">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica%3A+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+and+Development%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li>
<li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li>
<li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+balance+in+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29.+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li>
<li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+ecology+of+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+%28Packard%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhout%2C+HF+%22Insect+Hormones%22">Insect Hormones</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+detection%2C+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li>
<li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+notes+upon+the+firebrat%2C+Thermobia+domestica+Packard%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+New+York+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CRISPR/Cas9 ile istenen T. domestica mutantının başarılı bir şekilde üretilmesi için öncelikle enjeksiyon için yeterli sayıda aşamalı embriyo toplanması önemlidir. Yeterli sayıda T. domestica yumurtasının sürekli toplanması için anahtar, daha düşük bir nüfus yoğunluğuna sahip olmak için kabın uygun bir boyutunu seçmektir, çünkü her yetişkin eriyikten sonra tekrarlanan bir dizi karmaşık çiftleşme davranışının başarılı bir şekilde tamamlanmasına yardımcı olur13. Erkek bir T. do...

Thermobia domestica, atalardan kalma ametabolöz ve kanatsız bir yaşam döngüsünü koruyan en bazal böcek emirlerinden biri olan Zygentoma'ya aittir. Bu bazal filogenetik pozisyon ve atasal özellikler, bu türü, tanımlanan hayvan türlerinin% 70'inden fazlasını kapsayan Dünyadaki böceklerin başarısının altında kalan mekanizmaları incelemek için çekici bir model olarak belirledi1. T. domestica, nispeten kısa bir yaşam döngüsü (embriyodan üreme yetişkinine 2,5-3,0 ay) gibi laboratuvar modeli olarak uygun özellikleri nedeniyle böcek fizyolojisinin ata özelliklerini incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır; Şekil 1A) ve kolay bir üreme. Son otuz yılda, vücut planı, nöral farklılaşma ve sirkadiyen ritimler 2,3,4gibi çeşitli özelliklerin ata özelliklerini araştırmak için kullanımı genişletilmiştir.
T. domestica'da ileri genetik araçların uygulanması, geniş bir araştırma alanında bu tür katkıları daha da hızlandırabilir. Embriyolarda, nimflerde ve yetişkinlerde başarılı RNA paraziti (RNAi)- aracılı gen devrilmesi T. domestica4, 5,6'da bildirilmiştir. Sistemik RNAi'nin verimliliği hala türlere son derece bağımlıdır — örneğin, genellikle coleoptera'da yüksektir, lepidoptera sırasında ise düşüktür7. T. domestica'daki RNAi nakavtının etkinliği ve süresi henüz değerlendirilmedi. RNAi'ye ek olarak, daha önce T. domestica8'debaşarılı bir CRISPR / Cas9 aracılı gen nakavt bildirdik. CRISPR/Cas sistemi, böceklerde genom düzenlemesi için özellikle hedeflenen gen nakavtları için yaygın olarak uygulanmıştır. Kullanımı, CRISPR/ Cas sisteminin bileşenlerini çekirdek9'ateslim etmek için bir protokol kurulduktan sonra eksojen yapıları devirerek gen muhabiri tahlili, hücre soyu takibi ve transkripsiyonal aktivitenin manipülasyonu gibi diğer uygulamalar için genişletilebilir. Yayınlanan genom derlemesi10ile birlikte, CRISPR/ Cas tabanlı genom düzenlemenin T. domestica'da geniş kullanımı ve daha da geliştirilmesi, böceklerin olağanüstü adaptif başarısının arkasındaki evrimsel mekanizmalara odaklanan çalışmaları kolaylaştıracaktır. Burada, embriyo mikroenjeksiyonu ve CRISPR/Cas9 kullanarak mutant suşu oluşturmak için yetişkin T. domestica'nın çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yeni yöntemi göz önünde bulundurarak, bu tekniklerin başarılı uygulamaları için geleneksel olmayan model türlerinin benzersiz biyolojisini göz önünde bulundurmanın önemini tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>83-3738</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R, Sp HiFi, Cas9, Nükleaz V3, 100 ve mikro; g</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu bir plakadan statik elektriği gidermek için</td><td>anti-statik temizleyici</td><td>Hozan</td><td>Z-292</td></tr><tr><td>Bariyer Kutusu 20.7L</td><td>AS</td><td>ONE 4-5606-01</td><td>Büyük konteyner</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Elektronik mikroenjektör</td></tr><tr><td>Femtotip II, enjeksiyon kılcal</td><td>Eppendorf</td><td>5242957000</td><td>Cam enjeksiyon kılcal</td></tr><tr><td>Yüksek Paket 2440mL</td><td>AS ONE</td><td>5-068-25</td><td>Orta boy konteyner</td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MIR-554-PJ</td><td>37 & °; C kuluçka. İnkübatörün içinde nemlendirmeye gerek yoktur.</td></tr><tr>Genotipleme için <td>KOD Fx Neo</td><td>Toyobo</td><td>KFX-101</td><td>PCR enzimi. Ham şablonlardan amplifikasyon için optimize edilmiştir.</td></tr>Mikromanipülatör <tr><td>Mikroyükleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatörü</td> tutmak için manyetik stand <td>Narishige</td><td>GJ-8</td> Mikroenjeksiyon için Narishige MM-3 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td>. Mikroenjeksiyon için 35X'ten fazla büyütme yeterlidir</td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>Shimadzu</td><td>MCE-202</td><td>Mikroçip elektroforez sistemi</td></tr><tr><td>NiceTac</td><td>Nichiban</td><td>NW-5</td><td>Yumurtaları cam slayt üzerine yerleştirmek için çift taraflı bant</td></tr><tr><td>Boya fırçası (at kılı)</td><td>Pentel</td><td>ZBS1-0</td><td></td></tr><tr><td>Bitki kültürü kabı</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>310100</td><td>Büyük ve orta boy kaplar için çiftleşme tabağı ve su kaynakları</td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, Pichia pastoris Roche'dan PCR Sınıfı Liyofilizat</td><td></td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>SZX 12 mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZX 12</td><td>Mikroenjeksiyon için 35X'ten fazla büyütme yeterlidir</td></tr><tr><td>Talk pudrası</td><td>Maruishi</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Gold Growth</td><td>Spectrum Markaları</td><td></td><td>Yapay düzenli balık yemi</td></tr></tbody></table>

firebrat thermobia domestica'da genom düzenleme için yumurta mikroenjeksiyon ve verimli Çiftleşme

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Ateş aşındırıcı Thermobia domestica, yeryüzünde başarılı evrimsel radyasyonlarına yol açan böceklerin gelişim mekanizmalarını incelemek için uygun ametabolous, kanatsız bir türdür. Genom düzenleme gibi genetik araçların uygulanması, Evo-Devo yaklaşımında evrimsel geçişlerden sorumlu olan genetik değişiklikleri anlamanın anahtarıdır. Bu yazıda, T. domestica'nınmutant suşlarını üretmek ve sürdürmek için mevcut protokolümüzü açıklıyoruz. Bildirilen ıslak enjeksiyon yöntemine alternatif olarak, enjekte edilen embriyolarda stably yüksek sağkalım oranları elde etmemizi sağlayan bir kuru enjeksiyon yöntemi rapor ediyoruz. Ayrıca yetişkinleri çiftleşmek ve sonraki nesilleri yüksek verimlilikle elde etmek için optimize edilmiş bir ortam ayarı bildiriyoruz. Yöntemimiz, genom düzenleme yöntemlerinin geleneksel olmayan model organizmalara başarılı bir şekilde uygulanması için her türün benzersiz biyolojisini dikkate almanın öneminin altını çizmektedir. Bu genom düzenleme protokollerinin T. domestica'nın bir laboratuvar modeli olarak uygulanmasına ve bu türdeki yararlı genetik araçların geliştirilmesini ve uygulanmasını daha da hızlandırmaya yardımcı olacağını öngörüyoruz.

Elimizde, yeterli ipucuna sahip olduğunda yaklaşık 100 yumurta tek bir enjeksiyon kılcal damarı ile iyi enjekte edilebilir (Şekil 3C). Yumurtlamadan sonraki ilk 8 saat içinde embriyolarda gRNA/Cas9 ribononiklioprotein kompleksi enjeksiyonu gRNA hedefli bölgede indels ile sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin (G0) bazı hücrelerinde biallelik mutasyonlara neden olur ve bu nedenle mutant mozaik fenotipleri genellikle G0'de elde edilir. Örneğin, bu protokol beyaz geni hedeflemek için ta...

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Thermobia domestica bazal bir böcek olduğu için, bu tür üzerinde yapılan genetik çalışmalar, böceklerdeki motorlu uçuş ve metamorfozlar gibi önemli yeniliklerin evriminin altında yatan mekanizmaları aydınlatacaktır. Bu protokol, Thermobia'yı bir laboratuvar model türü olarak uygulamak için kültür bakımından yumurta mikroenjeksiyonuna kadar temel teknikleri kapsar. Bu yöntem aynı zamanda RNI aracılı gen yıkımı ve termobide transgenez gibi diğer genetik araçların uygulanması için de kullanılabilir.Yabani tip ve mutant popülasyonları, normal yapay balık yemi, üstünde havalandırma deliği olan plastik kaplarda su, böcekleri saklamak için katlanmış bir kağıt ve yumurtlamak için katmanlı pamuk içeren büyük bir plastik kapta tutun. Tüm T.domestica kültürlerini 37 derece Santigrat derece kuluçka makinelerinin içinde tutun ve her bir kabın içindeki bağıl nemi %60 ila 80'e ayarlayın Yumurta toplama kolonilerini hazırlamak için yaklaşık 20 erkek ve 20 dişi yetişkini yiyecek, su kaynağı, katlanmış bir kağıt ve yumurtlamak için küçük bir parça katmanlı pamuk içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın. Kısa bir süre içinde çok sayıda aşamalı embriyo elde etmek için birkaç koloni oluşturun.Enjeksiyon gününde, kapların içindeki pamuğu yeni pamukla değiştirin. Sekiz saat sonra, forseps kullanarak katmanları ayırarak yumurtaları katmanlı pamuktan toplayın. Yumurtalar arasında iki milimetre mesafe bırakarak ıslak bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çift taraflı bant üzerine hizalayın.Tüm yumurtalar, bir yumurtanın uzunlamasına ekseni enjeksiyon tarafına bakacak şekilde yönlendirilmelidir. Enjeksiyon sırasında sıkıca tutmak için yumurtaları bir boya fırçası ile hafifçe bastırın. İki mikrolitre gRNA CAS9 solüsyonunu bir mikro yükleyici ile bir cam enjeksiyon kılcal damarına yükleyin.Enjeksiyondan önce solüsyonda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Gerekirse, baloncukları çıkarmak için iğneye hafifçe vurun. Tıkanmayı önlemek ve bir dizi enjeksiyon boyunca daha iyi dayanıklılık elde etmek için iğne ucunun şeklini forseps ile hafifçe kırarak optimize edin.İğneyi bir yumurtanın uzunlamasına ekseninin orta noktasına yerleştirin ve az miktarda çözelti enjekte edin. İğne ucunun şekline bağlı olarak enjeksiyon sırasında elektronik mikro enjektörün konfigürasyonunu ayarlayın. Enjekte edilen yumurtaları 37 santigrat derecede %60 ila 80 bağıl neme sahip uygun büyüklükte bir kapta saklayın.Enjekte edilen yumurtaları periyodik olarak kontrol edin ve mantar oluşumunu önlemek için hasarlı yumurtaları atın. Bir yumurta üzerinde çok fazla mantar büyüyorsa, yumurtanın yüzeyini %70 etanol ile temizleyin. Yumurtadan çıkmadan önce, çift taraflı bandın yüzeyini kaplamak için enjekte edilen yumurtalarla birlikte cam slaytı talk pudrasına batırın.Bu, yumurtadan çıkan nimflerin istiflenmesini önleyecektir. Toz boyalı cam slaytları yiyecek, su ve katlanmış bir kağıt içeren orta büyüklükte bir kaba aktarın. G1 nimflerini bir aspiratör veya boya fırçası ile 24 oyuklu plakaya izole edin.Yapay düzenli balık yemi tedarikini sürdürün. 24 oyuklu plakayı% 60 ila 80 nem için su kaynağı olan daha büyük bir kaba yerleştirin Forseps kullanarak bir peri veya yetişkinden bir cercus sıkıştırın ve çekin ve bunları 50 mikrolitre etanol içeren 0.2 mililitrelik bir tüpe toplayın. Toplanan numuneleri uzun süreli saklama için eksi 20 santigrat derecede saklayın.Etanolü buharlaştırmak için numune tüplerini kapakları açık olarak 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir termal blok üzerine yerleştirin. Yumurtlamadan sonraki ilk sekiz saat içinde embriyolara gRNA CAS9 ribonükleoprotein kompleksinin enjeksiyonu, gRNA hedeflenen bölgede indellerle sonuçlanır. Bu, enjekte edilen neslin bazı hücrelerinde bialelik mutasyonlara neden olur ve genellikle mutant mozaik fenotipler elde edilir.Bu protokol, beyaz geni hedeflemek için tasarlanmış bir gRNA'yı enjekte etmek için kullanıldığında, G0 nimflerinin% 32.6'sı bileşik gözlerinde ve sırt bölgelerinde kısmi bir pigmentasyon kaybı gösterdi. G0 yetişkinlerinin ve mutasyona uğramış G1 bireylerinin germ hattı dönüşümünün değerlendirilmesi genomik PCR ile yapıldı ve ardından hetero dupleks hareketlilik testi yapıldı. G1 örneklerinde, vahşi tip ve mutasyona uğramış örnekler arasındaki diferansiyel bant modelleri açıkça ayırt edilebilir.Thermobia'da genom düzenleme, böceklerin erken özelliklerinin altında yatan genetik mekanizmaları analiz etmek için sağlam bir yaklaşım sağlar. Onların ve bizim olağanüstü başarımızın ardındaki sırları keşfetmeye yardımcı olur.

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Öğrenin Thermobia domestica'da yumurta mikroenjeksiyonu ve verimli çiftleşme yöntemleriyle genom düzenleme tekniklerini. Bu protokol, mutant suşların oluşturulması ve sürdürülmesi için laboratuvar modeli olarak kullanımı kolaylaştırır.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Daha fazla video keşfet