Name: İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak tek hücreli optik aksiyon potansiyeli ölçümü protokolünü. Bu yöntem, geleneksel yama kelepçesi tekniklerine göre daha az karmaşık ve yüksek verimli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Cairn Research Ltd.'yi bu yayının üretim maliyetlerini kapsayan nazik finansal katkıları için kabul etmek istiyor. Ayrıca, Bayan Ines Mueller ve Bayan Stefanie Kestel'e mükemmel teknik destekleri için teşekkür ederiz.
Yazarların araştırmaları Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ve Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi - EXC 2067/1- 390729940) ve Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) kapsamında.

1. Hücresel hazırlıklar
NOT: Bu protokolde kullanılan insan iPSC'leri sağlıklı donörlerden türetilmiş ve daha önce açıklandığı gibi WNT sinyalizasyon ve laktat saflaştırma tekniklerinin tam tanımlı küçük molekül modülasyonu kullanılarak monolayerlerde farklılaştırılmıştır12,13,14. iPSC-CM'ler her 2-3 günde bir aşağıda özetlenen bir kültür ortamı ile sürdürülmektedir.
<ol><li>Bazal ortam (RPMI 1640) ve %2 takviye (B27) kültür ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın. Oda sıcaklığında (RT) kullanın.</li>
	<li>Bazal ortam (RPMI 1640), %2 takviye (B27) ve 1:2000 ROCK inhibitörü kaplama ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın. RT'de kullanın.</li>
	<li>Ceket sterilize 10 mm yuvarlak cam #0 kapaklar ile 150 μL 1:60 faktörsüz bodrum membran matrisi ve 4 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatır. NOT: Dökülmeyi önlemek için yeterli yüzey gerilimini korurken camın tamamının kaplanmasını sağlamak için kapak hacminin optimizasyonu gereklidir. 10 mm yuvarlak kapaklar için 150 μL önerilir. Parti boyutu, kapak tipi, kapak hacmi ve kültür plakası tipi deneycilerin ihtiyaçlarına uygun olabilir.</li>
	<li>EDTA tabanlı bir hücre ayrışması reaktifi ile iPSC-CM ayrışmaya başlayın. 1.000 μL pipetle hafifçe yıkanarak monolayerin tamamen ayrıldığından emin olun.</li>
	<li>Hücresel süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve çift hacimli kaplama ortamı ekleyin. 100 x g'da10 dakika santrifüj.</li>
	<li>Peletin kaplama ortamının istenen hacmi (resüspensyon hacmi) ile yeniden ıslatır. Hücreleri el ile veya elektronik olarak sayın.</li>
	<li>Daha sonra yalıtılmış hücresel analize izin verecek kapak sapanı başına en uygun yoğunluğu (15.000) seçin.</li>
	<li>Tüm kapakları istenen yoğunlukta kaplamak için gereken 'aktif' hücresel süspansiyonun (A) hacmini hesaplayın. Aşağıdaki formülü uygulayın ve ayrı bir tüpe çekin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Her kapak kapağını istenen bir hacme yerleştirmek için gereken ekstra kaplama ortamının (B) hacmini hesaplayın. Aşağıdaki formülü uygulayın ve elde eden hacmi aktif süspansiyon tüpüne ekleyin: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Matrisi kapaklardan çıkarın ve her kapak parçasına hücre süspansiyonunun (A+B) 'kapak hacmi'ni uygulayın. Hücresel dağılımı bile sağlamak için tüpte düzenli olarak yeniden diriltme.</li>
	<li>37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatır. Kuyuyu yavaşça kaplama ortamı ile doldurun.</li>
	<li>24 saat sonra, normal kültür ortamı ile medya alışverişi ve her 2-3 günde bir koruyun.</li>
</ol>2. Deneysel kurulum
<ol><li>Deneyler yapmak için ters epifluoresans mikroskobu 40x büyütme, yüksek sayısal diyaframlı lens (N.A: &gt; 0.75) ile donatın.</li>
	<li>Mikroskobun iletilen aydınlatma portunu hızlı bir şekilde değiştiren sıcak beyaz LED'i bir ikiye birleyin. İletilen ışık yoluna basit bir kırmızı 660 nm filtre yerleştirin. NOT: Bu ışık, yeşil floresan sinyalini kirletmeden numuneyi gözlemlemek için fotometri deneyleri boyunca etkinleştirilebilir.</li>
	<li>Fotometri kaydı için hızlı geçişli 470 nm LED kafa takin. LED tarafından üretilen ışığı temizlemek için mikroskobun epifluoresan bağlantı noktasına 470/40 ekscitasyon filtresi yerleştirin. NOT: Optimum sinyal nicelemesi için optik çıkışın yüksek hızlı geri bildirim kontrolüne sahip bir aydınlatma sistemi önerilir.</li>
	<li>Mikroskop içindeki ayna ünitesi atlıkarıncasına 495 nm uzunluğunda geçiş ışını ayırıcı içeren bir mikroskop küpü yerleştirin.</li>
	<li>İlgi alanı seçimine izin vermek için mikroskop C montaj bağlantı noktasına ayarlanabilir bir alan diyaframı içeren bir algılama kolu takın.</li>
	<li>Mikroskop için ayrı ayrı bir fotomultiplier dedektörü (PMT) ve bir USB kamerayı birbirinden ayırın. Bu, emisyon tespit sisteminin temelini oluşturacaktır.</li>
	<li>PMT bağlantı noktasına 565 nm uzunluğunda geçiş ışını ayırıcısı ve 535/50 emisyon filtresi içeren bir filtre küpü yerleştirin. Bu, emisyon ışığını iki dedektör arasında böler. NOT: Emisyon algılama sisteminin iletilen bağlantı noktasına bağlı bir kamera, tüm deneyler boyunca brightfield altında iletilen ışığı algılayabilir.</li>
	<li>PMT'yi bir güç kaynağına ve bir PMT amplifikatörüne birleştirdi. PMT amplifikatör çıkışını bir veri toplama sisteminin analog giriş pimine bağlayın.</li>
	<li>PMT'den analog verileri 1 kHz veya daha yüksek bir hızda filtreleyin.</li>
	<li>Nyquist kriterlerini karşılamak ve takma adı önlemek için analog sinyalde (2 kHz veya daha yüksek) bulunan en yüksek frekansın en az iki katı olan bir frekansta verileri dijitalleştirin.</li>
</ol>3. VF2.1Cl ile hücresel yükleme
NOT: Bu boya ile ilgili tüm adımlar düşük ışık koşullarında yapılmalıdır.
<ol><li>Bir Tyrode banyo çözeltisi hazırlayın (mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glikoz, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7.35 ve 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>1.000x VF2.1Cl'lik 5 μL'lik ve 'lik çözünür poloksamer çözeltisinin 50 μL'sini karıştırarak mikrosantrifüj tüpünde bir aliquot yükleme çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>20 mm Petri kabına 5 mL ısıtılmış Tyrode çözeltisine (toplam 0,1x boya konsantrasyonu) 5 μL yükleme çözeltisi uygulayın. NOT: Son boya konsantrasyonu 0,1x'tir. Bu, üretici tarafından önerilen1/10'udur. Bu, kaynakları korur, ihmal edilebilir sitotoksiklik sağlar ve daha da önemlisi, yüksek sinyal ve gürültü oranlarına sahip yüklü hücrelerden gelen net optik sinyalleri korur.</li>
	<li>Çanağa tek bir iPSC-CM kapak fişi ekleyin ve 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Isıtılmış bir canlı hücre görüntüleme odasını birleştirin. Mikroskop aşamasına monte edin ve 500 μL taze Tyrode çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Kapak kapağını taze Tyrode çözeltisi ile 37 °C'de yıkayın.</li>
	<li>iPSC-CM kapak kapağını ince noktalı tokmaklar kullanarak önceden ısıtılmış banyo odasına dikkatlice uygulayın. NOT: Odanın ve içeriğinin her zaman fizyolojik sıcaklıklarda ısıtıldığından emin olun. İstenirse, ısıtılmış Tyrode çözeltisinin sürekli perfüzyonu ile başlayın.</li>
</ol>4. Elektrik alanı stimülasyonu
NOT: iPSC-CM'nin harici tetiklenmesi isteğe bağlıdır, ancak hücresel dinamiklerin ve deneysel parametrelerin standartlaştırılması için yararlıdır. Analiz kolaylığını arttırır ve frekansa bağlı etkilerin araştırılmasını sağlar.
<ol><li>Kayıt odasına 5 mm aralıklı iki platin elektrotlu bir stimülasyon kesici ucu takın.</li>
	<li>Harici bir uyarıcıyı stimülasyon kesici ucuna bağlayın. 0,5 Hz'de 5 ms bipolar alan darbelerine ayarlayın.</li>
	<li>Uyaranı 1 V'tan yukarı doğru artırarak optimum stimülasyon voltajını belirleyin. Eşik uyaranı, hücrelerin büznmeye başladığı en düşük voltaj olarak tanımlanır. Bu eşiğin yaklaşık % üzerinde voltaj uygulayın. Normal aralık 1 V ile 30 V arasındadır.</li>
	<li>Harici stimülatör ile stimülasyon frekansını düzeltin veya edinme yazılımı ile tetikleyin.</li>
</ol>5. Optik eylem potansiyeli kazanımı
NOT: Bu protokol, satın alma ve analiz için ticari bir yazılım kullanır.
<ol><li>İletilen ışık yolunu ve USB kamerayı kullanarak miyositleri parlak alan görünümünde görselleştirin.</li>
	<li>Yalıtılmış bir hücre seçin ve optik yolunu alan diyaframı ile sıkıca kırparak yalnızca ilgi hücresinden gelen ışığın izlenmesini sağlayın.</li>
	<li>PMT amplifikatörü etkinleştirin ve PMT beslemesini 750 V olarak ayarlayın.</li>
	<li>Satın alma yazılımıyla birlikte stimülasyon protokolünü çalıştırın (bkz. adım 4) ve aynı anda 470 nm uyarma ışığını etkinleştirin. İkincisi uzak bir panel üzerinden yapılabilir veya sabit bir yoğunlukta (TTL sinyali) otomatik olarak yapılabilir.</li>
	<li>Sinyalin doymadığını ve kayıt sisteminin algılama aralığı için optimize edilmiş olduğundan emin olmak için PMT amplifikatörünün kazancını ve uzaklığını ayarlayın.</li>
	<li>Kararlı eylem potansiyellerinin algılanmasını sağlayan 10 tarama kaydedin.</li>
	<li>Kaydetmeye devam edin ve hücrelerden yoksun bir bölgeden kısa bir süre arka plan sinyali almak için mikroskop aşamasını hemen hareket ettinin. Heyecan ışığını kapat. NOT: Bu arka plan değeri (Fuzaklığı), herhangi bir arka plan floresansını hesaba katmak için kullanılacaktır.</li>
	<li>İstenirse, farmakolojik manipülasyona hücresel yanıtları tanımlamak için 1 μM nifedipin gibi referans ilaçları yerel olarak perfuse edin.</li>
	<li>Sıralı bir şekilde, her seferinde yeni bir hücre seçerek 5.2–5.7 adımlarını yineleyin. Tek bir oturuşta yüksek deneysel ciro sağlamak için istenirse kapak örtülerini değiştirin. NOT: Yükleme ve görüntü alma protokolleri Şekil 2'de açıklanmıştır.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Analiz yazılımı ve tek bir hücreden uyarılmış eylem potansiyelleri içeren ortalama 10 tarama ile kaydedilmiş bir kayıt açın.</li>
	<li>Fuzaklığını temsil eden taban çizgisi sinyalinin bir ortalamasını alın ve bunu ortalama izlemeden çıkarın.</li>
	<li>aşağıdaki formülle ∆F/F0'yi hesaplayın (burada F floresan ölçülür ve F0 diyastolik floresandır): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>İzleme taban çizgisini (diyastolik) ve ilgi alanını (AP) tanımlayın ve istenen kardiyak etki potansiyeli parametrelerini ölçün. Bu, P (APD 50) ve</li><li><li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+fluorescent+voltage+indicators+for+studying+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
<li>Horváth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resting+membrane+potential+and+low+inward+rectifier+potassium+currents+are+not+inherent+features+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).</li>
<li>Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalama%2C+G+%22Science%22">Science</a>. 191 (4226), 485-487 (1976).</li>
<li>Hortigon-Vinagre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ratiometric+fluorescence+measurements+of+the+voltage+sensitive+dye+Di-4-ANEPPS+to+examine+action+potential+characteristics+and+drug+effects+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Miller, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+monitoring+voltage+in+neurons+by+photo-induced+electron+transfer+through+molecular+wires%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).</li>
<li>Bedut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+drug+profiling+with+voltage-+and+calcium-sensitive+fluorescent+probes+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hiPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Duncan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-mediated+shortening+of+action+potentials+in+LQTS2+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).</li>
<li>Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+acquisition+and+analysis+methods+in+multi-electrode+array+experiments+with+iPS+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kleinsorge, M., Cyganek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-directed+differentiation+of+human+iPSCs+into+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. , 100026(2020).</li>
<li>Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monophasic+action+potential+recordings+from+intact+mouse+heart%3A+validation%2C+regional+heterogeneity%2C+and+relation+to+refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).</li>
<li>Leopold, J. A., Loscalzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+precision+medicine+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+Leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+atrial+arrhythmogenesis+in+patients+with+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation.</a> Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162(2020).</li>
<li>Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurement+of+the+membrane+dipole+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential.</a> Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).</li>
<li>Matiukas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+voltage-sensitive+fluorescent+dyes+optimized+for+optical+mapping+in+blood-perfused+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium.</a> Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).</li>
<li>Mutoh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally-resolved+response+properties+of+the+three+most+advanced+fret+based+fluorescent+protein+voltage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes.</a> PLoS One. 4 (2), 4555(2009).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li>
<li>Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomerically+pure+tetramethylrhodamine+voltage+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).</li>
<li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectra%2C+membrane+binding%2C+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).</li>
<li>Fromherz, P., Muller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+fluorescence+of+amphiphilic+hemicyanine+dyes+in+neuron+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).</li>
<li>Salama, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

Cairn Research Ltd, video dosyasının üretim maliyetlerini karşılayarak bu yayını destekledi.

Burada, elektrofizyolojik modelleme ve kardiyak ilaç taraması için uygun izole iPSC-CM'lerden ayrıntılı AP profillerini kolayca elde etmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Seyrek tohumlu iPSC-CM'lerimizden hem gösterge işlevselliğini hem de metodolojik doğruluğu öneren düzenli ve sağlam AP'ler tespit ediyoruz.
iPSC yeniden programlama için geniş ticari metodoloji yelpazesi ve kardiyak farklılaşma protokolleri için standardizasyon eksikliği nedeniyle, iPSC tabanlı modeller işlevlerinde ve m...

Kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik modellemesi ve kardiyak ilaç taraması için verimli platformların inşası, çeşitli aritmik bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesi için gereklidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı genişlemesi, izole hasta türevli kardiyomiyositler (iPSC-CM) kullanılarak insan hastalığı modellemesi ve farmakolojik araştırmalara umut verici yollar üretmiştir. Bu hücrelerin yama kelepçesi (akım kelepçesi) yoluyla elektrofizyolojik karakterizasyonu için "altın standart" teknikler, eylem potansiyelini (AP) morfolojiyi ve süresini ölçebilir, ancak bu yöntem inanılmaz derecede karmaşık ve yavaştır ve yüksek verimli veri toplama için uygun değildir1. iPSC-CM'lerin düzenli olarak yetişkin yerli kardiyomiyositlere kıyasla diastolik membran potansiyelinin ve artan sızıntı akımının arttığı bildirilmektedir2. iPSC-CM'lerde gözlenen daha küçük hücre büyüklüğü ve azaltılmış membran kapasitansının, akım kelepçe tekniğini kullanırken, belki de bu sapmaları açıklarken bazı sistematik hatalar üretebileceği öne sürülmüştür3. Bir iPSC-CM platformunun kullanışlılığını en üst düzeye çıkarmak için, iPSC-CM'lerde transmembran voltaj değişikliklerini tek bir hücre düzeyinde karakterize ederken verimi artırmak ve veri doğruluğunu sağlamak için ek bir yöntem değerlidir.
Voltaja duyarlı boyalar (VSD) uzun zamandır geleneksel tekniklerle karşılaştırmalı olarak kardiyak AP kinetiğinin daha hızlı, non-invaziv ve eşdeğer analizini sağlamak için önerilen bir yöntemdir4. Yeni bir çalışma, kardiyak AP 5'i doğru bir şekilde ölçmek için oranmetrik voltaja duyarlı prob fotometrisinin uygunluğunugöstermiştir. Ayrıca, optik fotometri yaklaşımlarını kolayca ölçeklendirme yeteneği, bu tekniği terapötik ilaç geliştirmede kritik öneme sahip büyük ölçekli kardiyotoksikite ekranlarına (örneğin, CiPA) ödünç verir. Mikroelekrod dizisi ve voltaj algılama optik teknikleri kullanılarak körleştirilmiş çok sahalı bir çalışmada standartlaştırılmış kardiyotoksiklik protokollerinin geliştirilmesi bu yaklaşımın temel değerini göstermiştir6.
Birçok potansiyometrik boya ticari olarak mevcuttur ve yeni probların devam eden sentetik gelişimi, çeşitli kardiyak ve sinirsel yapılarda etkinliklerini kolaylaştırmak için heyecan verici bir potansiyel göstermektedir. İdeal VSD artırılmış kinetik ve hassasiyete sahip olurken, azaltılmış kapasitif yük, fotobleaching ve sitotoksiklik gösterecektir. Yakın zamanda sentezlenen VF2.1Cl (FluoVolt), bu faydalı özelliklerin çoğunu büyük ölçüde yeni VoltageFluor (VF) ailesinin diğer üyeleri tarafından paylaşılan yeni tel tabanlı moleküler yapısı nedeniyle ifade eder7. Basit probların plazma zarına moleküler ve elektriksel olarak eşleştiği yaygın elektrokromik VSD'lerin aksine, bu boya, elektron bakımından zengin bir donörü modifiye floresan florofor (FITC) ile eşleştiren pasif olarak yerleştirilmiş, membran yayılan sentetik bir telden oluşur. Mekanistik detaylar Şekil 1 'de verilmiştir. Bu boya, membran voltaj dalgalanmalarına karşı mükemmel hassasiyet gösterir ve karşılaştırılabilir hızlarda diğer yaygın problarda görülen ~ % 10'un aksine 100 mV başına emisyon yoğunluğunda%27'likbir değişiklik gösterir 7 . Buna ek olarak, tel tabanlı PeT sistemleri, hücresel kapasitif yükte minimum elektrik paraziti ve ihmal edilebilir değişiklikler üreten hücresel elektrik alanıyla doğrudan etkileşime girmez.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Şekil 1: VF2.1Cl boyanın kimyasal, spektral ve mekanistik parametreleri. (A) VF2.1Cl.'nin kimyasal yapısıKamuyel özellikler, plazma membranına takılmayı kolaylaştıran fenilen vinilen moleküler tel içinde birden fazla alkil grubu içerir. FITC probuna konjuge edilen negatif yüklü sülfinik asit grubu, hücre dışı yüzeyde florofor stabilizasyonu sağlar ve lipid bilayer'in elektrik alanına göre dik yerleştirmeye yakın yardımcı olur. (B) Hedef hücrenin plazma zarına gömülmek için dik VF2.1Cl'nin basitleştirilmiş şeması. (C) VF2.1Cl boya emilimi ve emisyon spektrumu. Spectra, standart FITC ve GFP problarıyla aynıdır. (D) VF2.1Cl'nin mekanistik eylem modunun tasviri. Dinlenme koşullarında (hiperpolarize), negatif hücre içi gerilimler serbest elektronları rostral florofora doğru yönlendirmektedir. Elektron bolluğu, foto-indüklenen elektron transferinin (PeT) optik uyarılmadan sonra heyecanlı durumdan bir çıkış yolu olarak tercih edilmesini sağlar ve floresanlığı etkili bir şekilde söndürür. Buna karşılık, depolarize bir membran potansiyeli, optik ekssitasyon üzerine floresandan yana aşağı doğru elektron hareketini etkiler. Ortaya çıkan floresan yanıt doğrusal olarak membran voltajı ile ilgilidir ve hücresel elektrofizyolojik kinetik hakkında ayrıntılı zamansal bilgi toplamak için hassas bir şekilde kullanılabilir. (E) Temsili brightfield (üst) ve floresan 470 nm (alt) görüntülerde leporin kardiyomiyositler VF2.1Cl. (F) Z yığını tek bir yüklü kardiyomiyosit yığını. Oklar, VF2.1Cl'nin hücresel zara net lokalizasyon alanlarını gösterir. Görüntüler, 50 μm pim deliği desenli bir X-lightv3 dönen disk konfokal kafasından oluşan bir dönen disk konfokal sistemi ile elde edildi; LDI-7 aydınlatıcı; Prime95B kamera ve PlanApo Lambda 100x hedef. Ölçek çubuğu: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
VF2.1Cl'ye eşlenen FITC probu, standart ve GFP filtre yapılandırmaları altında etkin bir şekilde kullanılabilmesini sağlar ve her ikisi de floresan görüntüleme platformlarının ortak özellikleri olan tek bir kanal alma sistemi gerektirir. Bu boya ile yoğun insan iPSC-CM monolayerlerinin analizi son zamanlardabildirilmiştir 8,9,10,11. Protokolümüz, yoğun senkriyal monolayerlerin elektriksel ve parakrin etkilerinden etkilenmeyen tek, izole iPSC-CM'leri araştırmamız ve karmaşık konfokal veya geniş alan görüntüleme düzenlemelerinin aksine uygun fiyatlı ve özelleştirilebilir bir fotometri sistemi kullanmamız nedeniyle bu çalışmalardan farklıdır.
Burada, izole edilmiş insan iPSC türevi kardiyomiyositlerden ve yerel kardiyomiyositlerden sağlam optik AP'lerin hızlı bir şekilde alınması ve analizi için protokolümüzü açıklıyoruz (bkz. Ek Dosya). Tek hücreli fotometri ölçümleri için VF2.1Cl'i özelleştirilebilir bir sanat platformuyla birleştiğinde kullanıyoruz. Bu deneysel protokoller Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi etik kurulu tarafından onaylanmıştır (No. 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 Tripsin EDTA & nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>B27 Takviyesi&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Susuz glukoz & nbsp; BioChemica</td><td>ITW Reaktifleri</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt Membran Potansiyel Kiti&nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen ve nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü Y27632</td><td>Stemolekül</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dikroik Işın Ayırıcı ve nbsp;</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifikatör ve nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Daire Lamelleri, Kalınlık 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift OptoLED Güç Kaynağı&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET470/40x Uyarma Filtresi&nbsp;</td><td>Chroma</td><td></td><td></td>Technology</tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma</td><td></td><td></td>Technology</tr><tr><td>Kazınmış Neubauer Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre Küpleri&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Ters Mikroskop&nbsp;</td><td>Olimpos&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoLED</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok Bağlantı Noktalı Adaptörler&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miyopacer Hücre Stimülatörü&nbsp;</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask Deklanşör&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optoscan Sistem Kontrol Cihazı</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-1 Sıcaklık Kontrollü Platform&nbsp; &nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı Dedektör&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Amplifikatör Eki</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Tedarik Eki</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Açık Banyo Odası&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SA-OLY/2AL Sahne Adaptörü&nbsp;</td><td>Olimpos&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Dikroik Işın Ayırıcı&nbsp;</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dikroik Işın Ayırıcı</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Çift Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı&nbsp;</td><td>npi Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Objektif</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0 Renkli Kamera&nbsp;</td><td>Görüntüleme Kaynağı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Moleküler Cihazlar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Moleküler Cihazlar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IC Yakalama 2.4&nbsp;</td><td>Görüntüleme Kaynağı&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prizma 8</td><td>Grafik Pedi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde tek hücreli optik eylem potansiyeli Ölçümü

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Kardiyomiyosit elektrofizyolojisini ölçmek için geleneksel hücre içi mikroelektrot teknikleri son derece karmaşık, emek yoğun ve tipik olarak düşük verimde gerçekleştirilir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı ve sürekli genişlemesi kardiyovasküler araştırmalarda yeni bir standart sunun ve elektrofizyolojik verilerin verimini tek bir hücre düzeyinde artırmak için alternatif yöntemler artık gereklidir. VF2.1Cl, membran potansiyelindeki dalgalanmalara hızlı bir tek kanallı, yüksek büyüklükte tepki sağlayan yakın zamanda türetilmiş voltaja duyarlı bir boyadır. Diğer mevcut voltaj göstergelerinden daha üstün kinetiklere sahiptir ve geleneksel mikroelekrod tekniklerine eşdeğer işlevsel verileri kullanıma sunmaktadır. Burada, modüler ve son derece uygun fiyatlı bir fotometri sistemi kullanarak harici tempolu insan iPSC türevli kardiyomiyositlerde basitleştirilmiş, invaziv olmayan eylem potansiyeli karakterizasyonunu gösteriyoruz.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Şekil 3: İzole edilmiş yerli kardiyomiyositlerin optik eylem potansiyeli (AP) profilleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (iPSC-CM). (A) APD 50 ve APD90'ın Ortalama ± SEM'i(n = 7, sağ) ile tek bir murine kardiyomiyosit (ortada) temsili optik AP. (B) TEK bir insan iPSC türetilmiş kardiyomiyosit (ort...

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerin hızla gelişen teknolojisine uygun bir şekilde hücresel elektrofizyolojinin yüksek verimli ölçümlerini sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel yama kelepçe tekniğinden daha az karmaşık ve daha az emek yoğun olması, ancak eşdeğer sonuçlar üretebilmesidir. Bu nedenle bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri kullanan büyük ölçekli toksisite tarama programları için genişletilebilir.Örneğin, kapsamlı in vitro proaritmi testi. Deney için indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyosit kültürlerini hazırlamak için, önce 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 150 mikrolitre 1:60 bazal membran matrisi ile tek tek 10 milimetre yuvarlak cam numaralı sıfır kapak fişlerini kaplayın ve kapak fişlerini dört santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, fazla matrisi kapak fişlerinden çıkarın ve her bir kapak fişine uygun hacimde hücre uygulayın.37 santigrat derecede bir saat sonra, her bir kuyucuğu dikkatlice kaplama ortamı ile doldurun ve plakayı inkübatöre geri koyun. Voltaja duyarlı boya görüntülemeye hazırlanmak için, ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobunu 40x büyütmeli yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir lensle donatın ve hızlı değişen sıcak beyaz bir LED'i iletilen aydınlatma portuna bağlayın. İletilen ışık yoluna basit bir kırmızı 660 nanometre filtre yerleştirin ve fotometri kaydı için hızlı anahtarlamalı bir 470 nanometre LED kafası monte edin.LED tarafından üretilen ışığı temizlemek için epifloresan portuna bir 470/40 uyarma filtresi yerleştirin ve mikroskop içindeki ayna ünitesi karuseline 495 nanometre uzunluğunda geçiren bir ışın ayırıcı içeren bir mikroskop küpü yerleştirin. İlgilenilen bölge seçimine izin vermek için C montaj bağlantı noktasına ayarlanabilir bir alan diyaframı içeren bir algılama kolu takın ve bir PMT dedektörü ile bir USB kamerayı mikroskoba bağlayın. Emisyon ışığını iki dedektör arasında bölmek için 565 nanometre uzunluğunda geçiş huzmesi ayırıcı ve 535/50 emisyon filtresi içeren bir filtre küpünü PMT bağlantı noktasına yerleştirin.PMT'yi bir güç kaynağına ve bir PMT amplifikatörüne bağlayın ve PMT amplifikatör çıkışını bir veri toplama sisteminin analog giriş pinine bağlayın. Nyquist kriterlerini karşılamak ve örtüşmeyi önlemek için, PMT'den gelen analog verileri bir kilohertz veya daha yüksek bir hızda filtreleyin ve verileri, analog sinyalde bulunan en yüksek frekansın en az iki katı olan bir frekansta sayısallaştırın. Hücreleri voltaja duyarlı boya ile yüklemek için, beş mikrolitre 1000x FluoVolt ve 50 mikrolitre güç yükü çözeltisini karıştırın ve elde edilen yükleme çözeltisinden üç mikrolitreyi bir petri kabında üç mililitre ısıtılmış Tyrode çözeltisine ekleyin.Tabağa tek bir indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit kaplı örtü ekleyin ve tabağı 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede yerleştirin. Isıtılmış bir canlı hücre görüntüleme odasını mikroskop tablasına monte edin ve hazneyi 500 mikrolitre taze Tyrode solüsyonu ile doldurun. Ardından kapak astarını 37 santigrat derecede taze Tyrode solüsyonu ile yıkayın ve kapak astarını önceden ısıtılmış banyo odasına dikkatlice aktarmak için ince uçlu forseps kullanın.Hücresel dinamikleri ve deneysel parametreleri standartlaştırmak için, odaya beş milimetre aralıklarla iki platin elektrot yerleştirin ve elektrotları harici bir stimülatöre bağlayın. Stimülatörü 0,5 hertz'de beş milisaniye bipolar alan darbesine ayarlayın ve hücreler kasılmaya başlayana kadar uyaranı bir volttan artırın. Ardından voltajı bu eşiğin yaklaşık %25 üzerine ayarlayın.Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için, miyositleri parlak alan koşullarında görselleştirmek için iletilen ışık yolunu ve USB kamerayı kullanın. İzole edilmiş bir hücre seçin ve optik yolunu sıkıca kırpmak için alan diyaframını kullanın, böylece yalnızca ilgilenilen hücreden gelen ışığın izlenmesini sağlayın. PMT amplifikatörünü etkinleştirin ve PMT beslemesini 750 volta ayarlayın.470 nanometre uyarma ışığını etkinleştirirken aynı anda stimülasyon protokolünü edinme yazılımıyla birlikte çalıştırın. Kararlı aksiyon potansiyellerinin tespit edildiğinden emin olmak için 10 tarama kaydedin. Son taramadan sonra, hücrelerden yoksun bir bölgeden kısa bir süre arka plan sinyali almak ve uyarma ışığını kapatmak için kayıt yapmaya devam ederken mikroskop aşamasını hemen hareket ettirin.Aksiyon potansiyeli verilerini analiz etmek için, uygun analiz yazılımında kaydedilmiş bir kaydı açın ve tek bir hücreden uyarılmış aksiyon potansiyellerini içeren ortalama 10 tarama. Ortalama izden floresan ofsetini temsil eden temel sinyalin ortalamasını çıkarın, ardından F0 olarak diyastolik floresan kullanarak floresanstaki değişikliği hesaplamak için formülü kullanın. Diyastolik ve aksiyon potansiyeli ilgi alanlarını belirleyin ve %50 ve %90 repolarizasyon süresi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere istenen kardiyak aksiyon potansiyeli parametrelerini ölçün. Ardından, bu tek hücredeki verileri bir elektronik tablo programına aktarın.Bu yöntem, hücresel iyonik anormallikler hakkında değerli bilgiler sağlayabilen repolarizasyon mekaniğinin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir. Belirgin birinci faz özellikleri, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerinkinden morfolojik olarak farklı olan murin kardiyomiyositlerinden gelen optik sinyallerde gözlenebilir. Ek olarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, bilinen bir L-tipi kalsiyum kanal antagonisti olan nifedipin ile farmakolojik manipülasyona yanıt verir.Sürekli ilaç uygulaması sırasında, %90 repolarizasyonda aksiyon potansiyeli süresinde %41,5'lik bir azalma gözlenmiştir, bu da floresan voltaj göstergesi tabanlı görüntülemenin prospektif yüksek verimli kardiyak ilaç tarama çalışmaları için bir platform olarak işlevselliğini düşündürmektedir. Bu çalışmada kullanılan voltaja duyarlı boyanın diğerlerinden daha az sitotoksik olmasına rağmen, hücresel canlılığı korumak için uyarma ışığının yine de idareli kullanılması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Bu protokolde kullanılan modülatör fotometri ekipmanı inanılmaz derecede çok yönlüdür.Örneğin, hücre içi kalsiyum gibi diğer elektrofizyolojik parametrelerin eşzamanlı ölçümleri için kullanılabilir.

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada özellikle ventriküler benzeri indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes içinde optik görüntü Aksiyon potansiyelleri, bir yöntem mevcut. Bu yöntem bir voltaj duyarlı floresan protein organizatörü tahrik ifade üzerinde dayanır.

Pluripotent kök hücre kaynaklı ventriküler Cardiomyocytes alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları insan indüklenen

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Lazer porasyon ve mikroelektrot dizilerinin (MEA) kombinasyonu, ekili birincil ve kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli benzeri kayıtlarına izin verir. Dalga formu şekli, test bileşiklerinin hareket tarzı hakkında standart kayıtlardan daha üstün bir fikir verir. Gelecekte kardiyo güvenliği araştırmalarını daha da optimize etmek için yama kelepçesi ve MEA okumasını birbirine bağlar.

Güvenlik Farmakolojisinin Artan Predivititesi için Mikroelektrot Dizileri Üzerindeki Kardiyomiyositlerin Lazerle İndüklenen Aksiyon Potansiyeli Benzeri Ölçümleri

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Optik çözünürlüklü foto akustik mikroskobu (OR-PAM), görüntüleme optik soğurma yeteneğine sahip gelişmekte olan bir teknoloji...

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Öğrenin, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak tek hücreli optik aksiyon potansiyeli ölçümü protokolünü. Bu yöntem, geleneksel yama kelepçesi tekniklerine göre daha az karmaşık ve yüksek verimli bir alternatif sunar.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Daha fazla video keşfet