İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerin hızla gelişen teknolojisine uygun bir şekilde hücresel elektrofizyolojinin yüksek verimli ölçümlerini sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel yama kelepçe tekniğinden daha az karmaşık ve daha az emek yoğun olması, ancak eşdeğer sonuçlar üretebilmesidir. Bu nedenle bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositleri kullanan büyük ölçekli toksisite tarama programları için genişletilebilir.

Örneğin, kapsamlı in vitro proaritmi testi. Deney için indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyosit kültürlerini hazırlamak için, önce 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 150 mikrolitre 1:60 bazal membran matrisi ile tek tek 10 milimetre yuvarlak cam numaralı sıfır kapak fişlerini kaplayın ve kapak fişlerini dört santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, fazla matrisi kapak fişlerinden çıkarın ve her bir kapak fişine uygun hacimde hücre uygulayın.

37 santigrat derecede bir saat sonra, her bir kuyucuğu dikkatlice kaplama ortamı ile doldurun ve plakayı inkübatöre geri koyun. Voltaja duyarlı boya görüntülemeye hazırlanmak için, ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobunu 40x büyütmeli yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir lensle donatın ve hızlı değişen sıcak beyaz bir LED'i iletilen aydınlatma portuna bağlayın. İletilen ışık yoluna basit bir kırmızı 660 nanometre filtre yerleştirin ve fotometri kaydı için hızlı anahtarlamalı bir 470 nanometre LED kafası monte edin.

LED tarafından üretilen ışığı temizlemek için epifloresan portuna bir 470/40 uyarma filtresi yerleştirin ve mikroskop içindeki ayna ünitesi karuseline 495 nanometre uzunluğunda geçiren bir ışın ayırıcı içeren bir mikroskop küpü yerleştirin. İlgilenilen bölge seçimine izin vermek için C montaj bağlantı noktasına ayarlanabilir bir alan diyaframı içeren bir algılama kolu takın ve bir PMT dedektörü ile bir USB kamerayı mikroskoba bağlayın. Emisyon ışığını iki dedektör arasında bölmek için 565 nanometre uzunluğunda geçiş huzmesi ayırıcı ve 535/50 emisyon filtresi içeren bir filtre küpünü PMT bağlantı noktasına yerleştirin.

PMT'yi bir güç kaynağına ve bir PMT amplifikatörüne bağlayın ve PMT amplifikatör çıkışını bir veri toplama sisteminin analog giriş pinine bağlayın. Nyquist kriterlerini karşılamak ve örtüşmeyi önlemek için, PMT'den gelen analog verileri bir kilohertz veya daha yüksek bir hızda filtreleyin ve verileri, analog sinyalde bulunan en yüksek frekansın en az iki katı olan bir frekansta sayısallaştırın. Hücreleri voltaja duyarlı boya ile yüklemek için, beş mikrolitre 1000x FluoVolt ve 50 mikrolitre güç yükü çözeltisini karıştırın ve elde edilen yükleme çözeltisinden üç mikrolitreyi bir petri kabında üç mililitre ısıtılmış Tyrode çözeltisine ekleyin.

Tabağa tek bir indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit kaplı örtü ekleyin ve tabağı 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede yerleştirin. Isıtılmış bir canlı hücre görüntüleme odasını mikroskop tablasına monte edin ve hazneyi 500 mikrolitre taze Tyrode solüsyonu ile doldurun. Ardından kapak astarını 37 santigrat derecede taze Tyrode solüsyonu ile yıkayın ve kapak astarını önceden ısıtılmış banyo odasına dikkatlice aktarmak için ince uçlu forseps kullanın.

Hücresel dinamikleri ve deneysel parametreleri standartlaştırmak için, odaya beş milimetre aralıklarla iki platin elektrot yerleştirin ve elektrotları harici bir stimülatöre bağlayın. Stimülatörü 0,5 hertz'de beş milisaniye bipolar alan darbesine ayarlayın ve hücreler kasılmaya başlayana kadar uyaranı bir volttan artırın. Ardından voltajı bu eşiğin yaklaşık %25 üzerine ayarlayın.

Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için, miyositleri parlak alan koşullarında görselleştirmek için iletilen ışık yolunu ve USB kamerayı kullanın. İzole edilmiş bir hücre seçin ve optik yolunu sıkıca kırpmak için alan diyaframını kullanın, böylece yalnızca ilgilenilen hücreden gelen ışığın izlenmesini sağlayın. PMT amplifikatörünü etkinleştirin ve PMT beslemesini 750 volta ayarlayın.

470 nanometre uyarma ışığını etkinleştirirken aynı anda stimülasyon protokolünü edinme yazılımıyla birlikte çalıştırın. Kararlı aksiyon potansiyellerinin tespit edildiğinden emin olmak için 10 tarama kaydedin. Son taramadan sonra, hücrelerden yoksun bir bölgeden kısa bir süre arka plan sinyali almak ve uyarma ışığını kapatmak için kayıt yapmaya devam ederken mikroskop aşamasını hemen hareket ettirin.

Aksiyon potansiyeli verilerini analiz etmek için, uygun analiz yazılımında kaydedilmiş bir kaydı açın ve tek bir hücreden uyarılmış aksiyon potansiyellerini içeren ortalama 10 tarama. Ortalama izden floresan ofsetini temsil eden temel sinyalin ortalamasını çıkarın, ardından F0 olarak diyastolik floresan kullanarak floresanstaki değişikliği hesaplamak için formülü kullanın. Diyastolik ve aksiyon potansiyeli ilgi alanlarını belirleyin ve %50 ve %90 repolarizasyon süresi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere istenen kardiyak aksiyon potansiyeli parametrelerini ölçün. Ardından, bu tek hücredeki verileri bir elektronik tablo programına aktarın.

Bu yöntem, hücresel iyonik anormallikler hakkında değerli bilgiler sağlayabilen repolarizasyon mekaniğinin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir. Belirgin birinci faz özellikleri, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerinkinden morfolojik olarak farklı olan murin kardiyomiyositlerinden gelen optik sinyallerde gözlenebilir. Ek olarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, bilinen bir L-tipi kalsiyum kanal antagonisti olan nifedipin ile farmakolojik manipülasyona yanıt verir.

Sürekli ilaç uygulaması sırasında, %90 repolarizasyonda aksiyon potansiyeli süresinde %41,5'lik bir azalma gözlenmiştir, bu da floresan voltaj göstergesi tabanlı görüntülemenin prospektif yüksek verimli kardiyak ilaç tarama çalışmaları için bir platform olarak işlevselliğini düşündürmektedir. Bu çalışmada kullanılan voltaja duyarlı boyanın diğerlerinden daha az sitotoksik olmasına rağmen, hücresel canlılığı korumak için uyarma ışığının yine de idareli kullanılması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Bu protokolde kullanılan modülatör fotometri ekipmanı inanılmaz derecede çok yönlüdür.

Örneğin, hücre içi kalsiyum gibi diğer elektrofizyolojik parametrelerin eşzamanlı ölçümleri için kullanılabilir.