İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Bu protokol, tümör-bağışıklık hücresi kesişmelerini görselleştirmek ve izlemek ve anti-kanser tedavilerinin etkilerini analiz etmek için mikro cihazlarda kontrol edilebilir 2D ve 3D ortak kültürler gerçekleştirmek için deneysel ortamlar sağlar. Bu teknoloji, bağışıklık hücresi alımının ve etkileşimlerinin gerçek zamanlı ve kolay bir şekilde görselleştirilmesini sağlar ve insan ve hasta kaynaklı numuneler için kullanılabilir. Son teknoloji mikroskopilerin çoğuyla uyumludur.

Prosedürü gösteren, Onkoloji ve Moleküler Tıp Bölümü, Istituto Superiore di Sanita'da doktora öğrencisi Francesco Noto ve Universita Cattolica del Sacro Cuore, Translasyonel Tıp ve Cerrahi Bölümü'nde doktora öğrencisi Nicoleta Manduca ve Esther Maccafeo olacak. Talaşlar daha önce temiz odada bir plazma temizleyici veya reaktif demir aşındırma makinesinde plazma ile aktive edilir. Murin-dalak hücreleri ve bir tümör hücre hattı, metinde açıklanan protokolleri taklit etmek için burada kullanılır.

Hücre süspansiyonlarını yüklemeden önce, ortamı altı rezervuarın hepsinden çekin. Daha sonra, sol üst rezervuarda ve alt kuyuda 10 ila 50 mikrolitre büyüme ortamında yeniden askıya alınan 5. tümör hücrelerine yavaşça 1 x 10 yükleyin. Sağ tarafta, 50 mikrolitre büyüme ortamında iki kuyucuğa yeniden askıya alınan 1 x 10 ila 6. yüzen bağışıklık hücrelerine yavaşça pipet yapın.

Tüm hücreler eklendiğinde, her çipin altı rezervuarını 100 ila 150 mikrolitreye kadar büyüme ortamı ile doldurun ve hücrelerin her kültür bölmesinde doğru şekilde dağıtıldığını kontrol edin. Hızlandırılmış kayıttan önce sistemin stabilize olmasını sağlamak için çipi bir saat boyunca inkübe edin. Canlı hücre görüntülemesi için, tümör bağışıklığını mikroskop aşamasındaki çip plakasına monte edin.

Incucyte Canlı Hücre Analiz Yazılımı gibi mikroskop yazılım arayüzündeki edinme iş akışı ayarını özelleştirin. Deney için uygun parametrelere ve incelenen hücre tiplerine bağlı olarak gözlem pencerelerini, optimum kare hızını ve zaman süresini seçin. Uygun deneysel zaman dilimi için hücreleri görüntüleyin.

Soğuk uçları kullanarak iki deneysel koşul için bir ilaç veya bir ilaç kombinasyonu içeren ortamla seyreltilmiş iki matrigel alikotu hazırlayın. Canlı uyumlu, floresan boya boyalı tümör hücrelerini, hücrelerin homojen bir dağılımını elde etmek için buz üzerinde matris çözeltisinde asılı duran nazikçe pipetleyin. Çip plakası bir soğutma bloğu veya buzlu bir sepet üzerindeyken, ilaçla tedavi edilen tümör hücresi matris çözeltisini, soğuk 10 mikrolitrelik mikropipet uçları kullanarak sol ve sağ jel portlarına yavaşça enjekte edin.

Matris çözeltisini kanalın bir tarafından diğerine itmek için hafif basınç uygulayın. Tüm tümör hücreleri yüklendiğinde, cihazı inkübatöre 30 dakika boyunca dik konumda yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, matris jelasyonu tamamlandıktan sonra, altı rezervuarın tümünün orta kanallarını 50 mikrolitre kültür ortamı ile doldurun.

Polimerize jel bütünlüğünü ve tümör hücresi dağılımını mikroskop altında kontrol edin. Daha sonra cipsleri bağışıklık hücresi hazırlığı tamamlanana kadar bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin.

Ucu orta orta kanalın girişine yakın bir yere yerleştirin ve zıt bir floresan boya ile etiketlenmiş 6. bağışıklık hücrelerine 10 mikrolitre 10 mikrolitreyi nazikçe enjekte etmek için orta basınç kullanın. Yanal kanalların dört kuyusunun her birine ortamın 50 ila 100 mikrolitresini, ortamın 40 ila 90 mikrolitresini üst merkez kuyucuğuna ve ortamın 50 ila 100 mikrolitresini alt merkez kuyucuğuna enjekte edin. Tüm kuyucuklar yüklendiğinde, bağışıklık hücresi dağılımının merkezi odayla sınırlı kaldığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın.

Daha sonra cihazı, görüntülemeye kadar hücre kültürü inkübatöründe düz bir yüzeye dikkatlice yerleştirin. Tümör bölmelerine sızan floresan boyalı canlı bağışıklık hücrelerinin derecesini hesaplamak için, floresan mikroskobu ile cihazı belirli ilgi noktalarında görüntüleyin ve Nikon NIS-Elements gibi mikroskop görüntüleme yazılımında uygun kamera parametrelerini ayarlayın. Ayrıca etiketli bağışıklık hücreleri için parametreleri ayarlayın.

Lökositlerin mikroakışkan platformdaki uygun şekilde inşa edilmiş mikrokanal köprülerinden hedef hücrelerine doğru hareketi, video mikroskobu ile izlenebilir. Bu izleme analizinde, bireysel PBMC'lere ölmekte olan doksorubisin ile tedavi edilen veya canlı PBS ile tedavi edilen kanser hücreleri ile meydan okundu. İlgili kemotaksis değerleri ve migrasyon grafikleri otomatik olarak oluşturuldu ve doksorubisin veya PBS'ye maruz kalan meme kanseri hücreleri ile birlikte yüklendiğinde bağışıklık hücreleri için farklı bir göç profili gözlendi.

PBMC'ler apoptotik kanser hücreleri ile karşı karşıya kaldıklarında, mikrokanalları ölmekte olan ve ölü hücrelere doğru geçtiler, ancak canlı, tedavi edilmemiş hücrelere geçmediler. 24 ila 48 saat içinde artan yoğunluğa sahip lökositlerin bir kısmı, doxo ile tedavi edilen kanser hücreleri ile uzun süreli temaslar sergiledi. Bu analizde, epigenetik ilaçların anti-kanser kombinasyonlarına yanıt olarak bağışıklık hücrelerinin işe alımını ölçmek için yeni bir 3D immünokompetan tümör modeli kullanılmıştır.

Kırmızı boya etiketli PBMC'ler daha sonra homojen olarak merkezi akışkan odasına dağıtıldı. İki tümör kitlesinin PBMC'leri çekme kabiliyeti daha sonra karşılaştırıldı ve PBMC'ler bu deneyde sağ taraftaki mikrokanala sağlam bir şekilde dahil edildi. 3D model için, çözeltiyi hidrojel ve buz üzerindeki hücrelerle karıştırın, kabarcıklardan ve ön polimerizasyondan kaçının.

Aşırı basınç olmadan yavaşça enjekte edin. Polimerizasyon adımlarını kullanılan matrise göre ayarlayın. Süpernatantlardan canlı/ölü hücre tahlilleri ve sitokin sekresyon profillemesi uygulanabilir.

Konfokal görüntüleme için immünofloresan, immün alt tipleri sınıflandırmak ve aktivasyon ve tükenme olgunlaşmasının ekspresyon belirteçleri için yapılabilir.