Name: Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Keşfedin, Japon eriği melezlerinde tozlaşma gereksinimlerini belirlemek için floresan mikroskopisi ve moleküler genotipleme yöntemlerini. Bu teknik, kendine uyumsuz çeşitler için uygun tozlayıcıların belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ve RTA2017-00003-00) tarafından finanse edildi; Gobierno de Aragón—Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği (Grupo Consolidado A12-17R) ve Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero, México'lu Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'nın (CONACYT, 471839) bir bursu ile desteklendi.

1. Alanda el tozlaşması
<ol><li>
Polen ekstraksiyonu
	<ol>
<li>Polen elde etmek için, D24aşamasında çiçek tomurcukları toplayın BBCHölçeğinde57. NOT: Japon erikinde diğer Prunus türlerine göre daha fazla çiçek tomurcukları gereklidir, çünkü anterleri daha az polen üretir.</li>
		<li>Anterleri plastik bir ağ (2 mm x 2 mm gözenek boyutu) kullanarak çıkarın ve anter dehiscence olana kadar 24 saat oda sıcaklığında kağıda yerleştirin.</li>
		<li>Polen tanelerini ince bir ağdan (0,26 mm x 0,26 mm gözenek boyutu) elekleyin ve kullanıma kadar 4 °C'de kapaklı 10 mL cam tüpte saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Emasculated çiçeklerin tozlaşması
	<ol>
<li>Çiçeklerin% 10-% 20'si açık olduğunda, birkaç dal seçin ve etiketleyin. BbcHölçeğinde57.</li>
		<li>Tedavi başına 800 ila 1.000 çiçek tomurcuklarının yaprakları, sepals ve stamenlerini tırnak veya cımbızla çıkarın.</li>
		<li>Emasculation sonra 24 saat ince bir boya fırçası yardımıyla pistilleri elle tozlaşın. Pistillerin yarısını aynı kültivvarın polenleriyle, diğer yarısını da kontrol olarak diğer cultivardan uyumlu polenlerle içeren bazı dallar. Parmak ucini veya boya fırçasını diğer kültivvarlardan polen taneleriyle kirletmemeye dikkat edin.</li>
		<li>Meyve damlası desenini karakterize etmek ve her tozlaşma tedavisinde belirlenen nihai meyveyi ölçmek için çiçeklerin ve gelişmekte olan meyvelerin haftalık sayılarını kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alandaki tamamlayıcı tozlaşma
	<ol>
<li>İlk çiçekler açılmadan birkaç gün önce, tozlaşan böceklerin gelişini önlemek için seçilen ağaçları 0,8 mm'lik bir kafes kafesine koyun.</li>
		<li>% 10-% 20 çiçekler açık olduğunda, tozlaşma tedavisi başına birkaç dal seçin ve etiketleyin ve tedavi başına 1.000-1.500 çiçek bırakın.</li>
		<li>Ertesi gün, çiçekler açık olduğunda, her çiçeği ilgili polenli bir boya fırçası yardımıyla toz haline getirin (kendi kendine tozlaşma için aynı kültivardan polen ve çapraz tozlaşma kontrolü olarak diğer uyumlu kültivarlardan).</li>
		<li>Tüm çiçekler açılana kadar her gün tozlaşın.</li>
		<li>Meyve damlası desenini karakterize etmek ve her tozlaşma tedavisinde nihai meyve setini ölçmek için antezden hasata kadar çiçeklerin ve gelişen meyvelerin haftalık sayılarını kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Laboratuvarda el tozlaşmaları
<ol><li>Sahne D24'te 50-100çiçek toplayın , BBCHölçeğinde57.</li>
	<li>Laboratuvarda, tedavi başına 30 çiçek emasculate (kendi kendine ve çapraz tozlaşma). NOT: Pistillerde herhangi bir hasar oluşmaması için emasculation dikkatli bir şekilde devam edilmelidir.</li>
	<li>Bir parça ıslak çiçekçi köpüğüne (her tozlaşma tedavisi için bir parça köpük) yerleştirmeden önce su altındaki her çiçek pedikelinin tabanında taze bir kesim yapın.</li>
	<li>Her pistil 24 saat sonra daha önce toplanan polenlerle ince bir boya fırçası kullanarak elle tozlaşır (bkz. bölüm 1.1). Bir pistil kümesini aynı kültivardan polenlerle tozlaş, diğer seti ise kontrol olarak uyumlu bir kültvardan polenle toz haline.</li>
	<li>Tozlaşmış pistilleri oda sıcaklığında tozlaştıktan sonra 72 saat bekletin. Çiçek köpüğü sürekli su ile ıslatılmalıdır.</li>
	<li>Pistilleri 4 °C'de en az 24 saat boyunca etanol/asetik asit (3:1) sabitleyici bir çözeltiye sabitle. Fiksatifi% 75 etanol ile değiştirin. Numuneler bu çözeltide 4 °C'de27kullanıma kadar korunabilir. NOT: Numunelerin tamamen çözeltiye batırıldığından emin olun.</li>
</ol>3. Mikroskobik gözlemler
<ol><li>
In vitro polen çimlenmesinin değerlendirilmesi
	<ol>
<li>Polen çimlenme ortamını detaylandırmak için, 250 mL damıtılmış su üzerinde 25 g sakkaroz çözün, ardından 0.075 g kalsiyum nitrat [Ca(NO3)2] ve 0.075 g borik asit (H3BO3)ekleyin.</li>
		<li>Çözeltiye 2 g agar ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın28.</li>
		<li>Ortamı sterilize etmek için 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklav edin. Ortamı soğutun ve katılaşmadan önce steril bir laminar akış davlumbazında steril Petri kabı başına 3 mL (55 mm x 12 mm) dağıtın. Orta katılaşmadan sonra, alüminyum folyoya sarılı Petri kaplarını kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Daha önce polen donörü olarak kullanılan her bir kültünün polenlerini iki Petri kabında kontrollü tozlaşmalara yayın ve 24 saat boyunca 25 °C'de kuluçkaya yayın. NOT: Aşılanmış kültür ortamı hemen sonra mikroskopi ile gözlemlenebilir veya kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir. Bu amaçla, Petri tabakları mikroskopi gözlemlerinden 24 saat önce dondurucudan buzdolabına değiştirilmelidir.</li>
		<li>Polen tanelerini gözlemlemek için, callose'u lekeleyen% 1 (v / v) anilin mavi çözeltisi hazırlayın. İlk olarak, 1.000 mL damıtılmış suda 7,97 g K3PO4çözerek 0,1 N potasyum fosfat tribasik (K3PO4) çözeltisi hazırlayın. % 1 (v/v) anilin mavisi çözeltisini detaylandırmak için, 1 mL anilin mavisini 0,1 N K3PO4'ün100 mL'sinde çözün.</li>
		<li>Her Petri kabı plakasına 2-3 damla anilin mavisi çözelti ekleyin ve UV epifluoresans mikroskobu altında BP340-390 ve bariyer filtresi LP425 kullanarak 5 dakika sonra gözlemleyin. Her bir alanda 100-200 polen tanesi içeren tabak başına üç alanda, her cultivar için iki Petri kabında uygulanabilir ve canlı olmayan polen tanelerini sayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polen tüpü büyümesi
	<ol>
<li>Sabit pistilleri damıtılmış suyla üç kez (her biri 1 saat, toplamda 3 saat) durulayın ve24saat boyunca 4 °C'de% 5 (w/v) sodyum sülfit (Na 2 SO3)aktarın. Bu çözeltiyi hazırlamak için, 5 g sodyum sülfürü 100 mL damıtılmış suda çözün.</li>
		<li>Dokuları yumuşatmak için pistilleri 120 °C'de % 5 (w/v) sodyum sülfürde 8 dakika boyunca otoklavlav.</li>
		<li>Kabak yumuşatılmış pistils bir damla içinde 1% (v/v) anilin mavi çözelti bir slayt üzerinde bir kapak camı altında nasır leke.</li>
		<li>Bp340-390 exciter filtresi ve bariyer filtresi LP425 kullanarak UV epifluoresans ile mikroskop altında stil boyunca polen tüpü büyümesini gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Uyumsuzluk ilişkilerinin belirlenmesi
<ol><li>Yapraklardan DNA ekstraksiyonu<ol>
<li>DNA çıkarmak için, tercihen ilkbaharda, alandaki her bir cultivarın 3-4 genç yaprağını toplayın. NOT: DNA olgun yapraklardan da çıkarılabilir, ancak genç yapraklardan DNA daha az fenolik bileşiklere sahiptir.</li>
		<li>Dna'yı ticari bir kit kullanarak izole edin ve sağlanan protokol kitini izleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>DNA konsantrasyonunu ölçün ve UV-Vis mikrovolum spektrofotometresinde her bir örneğin DNA kalitesini 260 nm olarak değerlendirin. DNA konsantrasyonu 10 ng/μL olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parça amplifikasyonu için PCR koşulları<ol>
<li>Etiket 0.2 mL PCR tüpleri ve kapakları.</li>
		<li>PCR reaktiflerini Tablo 1'e göre hazırlayın ve buzda çözülmelerine izin verin.</li>
		<li>Reaksiyon başına 16 μL'lik bir hacim göz önüne alındığında, reaksiyon sayısına ve fazlalıkların% 10'una göre 1,5 mL mikrotüpte her bir astar çiftinin bir ana karışımını ayarlayın. Tablo 1'deki sırayı takiben reaktifleri ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Negatif kontrol (C-) olarak 4 μL DNA şablonu veya 4 μL sterilize damıtılmış su içeren her 0,2 mL PCR tüpüne Aliquot 16 μL ana karışım. Pozitif kontroller olarak bilinen genotipli kültivarların DNA'larını kullanın. Yavaşça karıştırın, reaksiyon tüplerini kapaklarla kapatın ve reaksiyon tüpünün altındaki tüm hacmi toplamak için 30 s için 2.000 x g'da santrifüjlayın.</li>
		<li>Reaksiyon tüplerini termosiklete yerleştirin ve aşağıdaki sıcaklık profilini kullanarak PCR programını ayarlayın: 94 °C'de 3 dk başlangıç adımı, 94 °C'de 1 dk 35 döngü, 56 °C'de 1 dk ve 72 °C'de 3 dk ve 72°C'de 7dakikalık son adım 20 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroforezi ve parça boyutunun tahmini<ol>
<li>%1,7 (w/v) agarose mini jel hazırlamak için 0,68 g agarose ve 40 mL 1x TBE tamponu 100 mL Erlenmeyer şişesine çözün. Kaynamamak için çözeltiyi mikrodalga fırında 30 s aralıklarla 600 W'da ısıtarak eritin.</li>
		<li>Çözeltinin soğuması için bankta kalmasına izin verin ve ardından 3,5 μL nükleik asit boyama çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Jel tepsisini döküm standına yerleştirin ve seçilen tarağı jel kalıbına yerleştirin. Her PCR ürünü ve DNA merdiveni için yeterli kuyuya sahip olduğundan emin olun.</li>
		<li>Agarose çözeltisini jel kalıbına dökün ve polimerizasyona kadar soğumaya bırakın. Polimerize jelin tarağı çıkarın. Jeli, jelin yüzeyini kaplayacak kadar 1x TBE tampon içeren yatay elektroforez sistemine yerleştirin.</li>
		<li>İlk ve son kuyuları DNA moleküler ağırlık merdiveninin 2 μL'si (1 kb DNA Merdiveni) ile yükleyin. PCR'ın her ürününün 3 μL'yi diğer kuyulara yükleyin. Hazneyi kapatın, gücü açın ve jeli 30 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.</li>
		<li>Jel dokümantasyon sistemi kullanarak UV ışığı altında jeli gözlemleyin. Güçlendirilmiş parçanın boyutunu belirlemek ve ilgili alelleri tanımlamak için pozitif kontrollerle karşılaştırmak için DNA moleküler ağırlık merdivenini kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Çiçek tarihlerini izleme
<ol><li>Farklı yıllar boyunca çiçek açmada her cultivarın farklı ağaçlarının fenolojisini izleyin. Çiçekleme döneminin uzunluğunu ilkinden (yaklaşık% 5) son açık çiçeklere (yaklaşık% 95) kurun. Tam çiçeklenme, çiçeklerin en az% 50'si aşamada olduğunda kabul edilir F24, BBCHölçeğinde65.</li>
	<li>Uyumlu kültivarların çiçekli tarihlerini karşılaştırmak ve her yıl çiçekli zamanda çakışanları belirlemek için, birkaç yıllık verilerle çiçekli zamanların bir takvimini detaylandırın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Japon erik kültivatörlerinin tozlaşma gereksinimleri için burada açıklanan metodoloji, her bir kültivarın sahadaki veya laboratuvarda kontrollü tozlaşmalarla kendi kendine (in) uyumluluğunun belirlenmesini ve daha sonra polen tüpü büyümesinin floresan mikroskopi ile gözlemlenmesini gerektirir. Uyumsuzluk ilişkileri, S-alellerinin moleküler genotipleme ile karakterize edilmesiyle kurulur. Son olarak, pollinizerlerin seçimi, her yıl çiçekle çakışan kültivarları tespit etmek için izleme fenolojisi tarafından gerçek...

Japon eriği (Prunus salicina Lindl.)Çin'eözgüdür 1 . 19. yüzyılda, bu ürün Japonya'dan Amerika Birleşik Devletleri'ne tanıtıldı ve burada diğer Kuzey Amerika diploid erikleri2ile kesişen . 20. yüzyılda, bu melezlerin bazıları dünyadakiılıman bölgelere yayıldı. Günümüzde, "Japon eriği" terimi, orijinal P. salicina arasındaki haçlardan elde edilen ve 15 adede kadar diğer diploid Prunus spp. 3 ,4,5ile türetilen çok çeşitli spesifik melezleri ifade eder.
Japon eriği, Rosaceae ailesinin diğer türleri gibi, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen Gametophytic Self-Incompatibility (GSI) sergiler6. S-locus, pistilde ifade edilen bir ribononikleaz(S-RNase)ve polen tanesinde ifade edilen bir F kutusu proteinini (SFB) kodlayan iki gen içerir7. Kendi kendine uyumsuzluk reaksiyonunda, polen tanesinde (haploid) ifade edilen S-alele pistil (diploid) ile ifade edilen ikiden biriyle aynı olduğunda, polen tüpünün stil boyunca büyümesi, polen tüpü RNA'nın S-RNase8'inetkisiyle bozulması nedeniyle tutuklanır. Bu işlem ovuledeki kadın gametofitin döllenmesini önlediğinden, GSI kültivarlar arasındaki çıkıntları teşvik eder.
Bazı Japon erik kültivarları kendi kendine uyumlu olsa da, şu anda yetiştirilen çoğu kültivar kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için inter-uyumlu donörlerden polen gerekir3. Badem9 , kayısı 10 ,11,12ve tatlı kiraz13 gibi Prunu cinsi taş meyve türlerinde, kültivarların tozlaşma gereksinimleri farklı yaklaşımlarla oluşturulabilir. Kendi kendine (in) uyumluluk, alandaki çiçeklerin kendi kendine tozlaşması ve daha sonra meyve setinin izlenmesi veya bir laboratuvarda kontrollü koşullarda yarı in vivo kendi kendine tozlaşma ve polen tüplerinin mikroskop altında gözlemlenmesi ile belirlenebilir14,15,16,17,18 . Kültivarlar arasındaki uyumsuzluk ilişkileri, potansiyel pollinizer kültivarının polenleri kullanılarak alandaki veya laboratuvarda çapraz tozlaşmalar ve her bir kültivarın S-allellerinin PCR analizi ile tanımlanması ile belirlenebilir14, 15,16,19,20,21,22 . Tatlı kiraz veya badem gibi türlerde, kendi kendine (in) uyumluluk, tatlı kiraz 13'te S 4' veya badem23'te Sf olarak, kendi kendine uyumlulukla ilişkili belirli Salellerinin tanımlanmasıyla da değerlendirilebilir.
Ana üretim ülkelerinden birkaç erik yetiştirme programı, birçoğu bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip bir dizi yeni kültivar2,14. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem alandaki hem de laboratuvardaki kendi kendine tozlaşmalar ve ardından floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin gözlemleri ile belirlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanmasını alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirir.

<table><tbody><tr><td>Asetik Asit Buzul</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biyoteknoloji</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Anilin mavisi</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit (H3BO 4)</td> <td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Nitrat 4-hidrat (Ca (NO(NO3) 2 &orta nokta; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>Görüntüleme Geliştirme Sistemleri</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kamera Yazılım Paketi</td><td>Görüntüleme Geliştirme Sistemleri</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Karışımı, her biri 10 mM</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA polimeraz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96&derece;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>1Kb DNA Merdiveni (ABD Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td> <td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Boyut: 250 ve mikro; g; Bütün: 1.0 ve mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>Jel Dokümantasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>El Sayacı</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Laboratuvarı Yazılımı</td><td>Jel Dokümantasyon Sistemi için</td><td>Bio-Rad</td><td></td> Görüntü Analiz Sistemi</tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td>UV</td> ile Z605212 <td></td></tr><tr><td>Mikroskobu epiflurescence</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Uyarıcı filtre BP340-390, Bariyer filtre LP425</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini Elektroforez Sistemi</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minisantrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Tribazik (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer ileri 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer ileri Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific Primer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ters 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Nükleik Asit Boyama Solüsyonu</td><td>iNtRON Biyoteknoloji</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfit susuz (Na2SO3)</td> <td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools bitki DNA ekstraksiyon Kiti</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Tampon (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Dikey Otoklav Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

fenolojik İzleme, el tozlaşmaları, floresan mikroskopisi ve moleküler genotipleme ile japon eriğinde tozlaşma gereksinimlerinin oluşturulması

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Yaygın olarak yetiştirilen Japon erik kültivatları, orijinal Prunus salicina ile diğer Prunus türleri arasındaki haçlardan elde edilen spesifik melezlerdir. Çoğu melez, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen gametofitik kendi kendine uyumsuzluk sergiler. Ekili melezlerin çoğu kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için uyumlu bir donörden polene ihtiyaç duyarlar. Japon eriği tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi, bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip yeni kültivarların yüksek sayısı nedeniyle giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem sahada hem de laboratuvarda el tozlaşmaları ile belirlenir, ardından floresan mikroskopi ile polen tüpü uzaması ve ayrıca alandaki meyve olgunlaşması izlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanması ile alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirilerek değerlendirilir. Kültivarların tozlaşma gereksinimlerini bilmek, yeni meyve bahçelerinin tasarımı için kültivarların seçimini kolaylaştırır ve kurulan meyve bahçelerinde tozlaşma eksikliği ile ilgili verimlilik sorunlarının erken tespitini sağlar.

Her Japon erik çiçeği tomurcukları 1-3 çiçekli bir çiçek salkım içerir. Diğer taş meyve türlerinde olduğu gibi, her çiçek dört whorls oluşur: çiçeğin tabanında bir fincan oluşturan kaynaşmış karpel, stamens, yaprakları ve sepals. Çiçek yapıları diğer taş meyvelerden daha küçüktür, az miktarda polen tanesi içeren stamenlerle çevrili kısa ve kırılgan bir pistil vardır. Tam çiçeklenmede, her çiçeklenmenin çiçekleri kısa saplarda ayrılır ve beyaz yaprakların anesteziden önceki günlerde yeşil sepals (aşama D, 57 BBCH) (<stron...

Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji, floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin alan ve laboratuvar tozlaşmalarını ve gözlemlerini, S-genotiplerinin PCR tarafından tanımlanması ve tozlayıcıların seçimi için çiçeklenmenin izlenmesi ile birleştiren bir metodoloji açıklanmaktadır.

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Bu protokol, bilinmeyen tozlaşma gereksinimleri olan çok sayıda yeni, kendi kendine uyumsuz Japon erik çeşidi nedeniyle giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, tarla ve laboratuvar koşullarında iki tamamlayıcı yaklaşımı birleştirerek çeşitlerin tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesine izin vermesidir. Bu yaklaşım, tozlaşma gereksinimlerini ve kayısı veya tatlı kiraz gibi kendi kendine uyumsuz diğer meyve ağacı türlerini belirlemek için de uygulanabilir.Polen ekstraksiyonu için, çiçek tomurcuklarını BBCH ölçeğinde 57. aşamaya göre balon aşamasında toplayın. Anterleri plastik bir ağ kullanarak çıkarın ve anter ayrışmasına kadar 24 saat oda sıcaklığında kağıda koyun. Polen tanelerini ince bir ağdan geçirin ve kullanana kadar dört santigrat derecede kapaklı 10 milimetrelik bir cam tüpte saklayın.Çiçeklerin% 10 ila 20'si açık olduğunda, tozlaşma tedavisi başına 1.000 ila 1.500 çiçek bırakarak birkaç dal seçin ve etiketleyin. Ertesi gün, daha fazla çiçek açıldığında, her çiçeği kendi kendine tozlaşma için aynı çeşitten polen ve çapraz tozlaşma kontrolü olarak diğer çeşitlerden polen içeren bir boya fırçası kullanarak tozlaştırın. Tüm çiçekler açılana kadar her gün tozlaşın.Meyve dökümü modelini karakterize etmek ve her tozlaşma işleminde nihai meyve tutumunu ölçmek için antezden hasada kadar haftalık çiçek ve gelişmekte olan meyve sayımlarını kaydedin. BBCH ölçeğinde 57. aşamaya göre balon aşamasında 50 ila 100 çiçek toplayın. Kendi kendine ve çapraz tozlaşma için laboratuvarda tedavi başına 30 çiçek ekme edin.Her çiçek pedikülünün tabanında su altında yeni bir kesim yapın ve bir parça ıslak çiçekçi köpüğü üzerine yerleştirin. Her tozlaşma işlemi için bir parça köpük kullanın. 24 saat sonra, her bir pistili ince bir boya fırçası kullanarak daha önce toplanan polenlerle elle tozlaştırın.Bir set pistili aynı çeşitten polenle ve diğer seti kontrol olarak başka bir uyumlu çeşitten polenle tozlaştırın. Bu tozlaşan pistilleri, dört santigrat derecede en az 24 saat boyunca sabitleyici bir etanol ve asetik asit çözeltisine sabitleyin. Daha önce polen donörü olarak kullanılan her çeşidin polenini tozlaşmalarda iki Petri kabına yayın ve 25 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.Polen tanelerini gözlemlemek için, her bir Petri kabına iki ila üç damla anilin mavisi çözeltisi ekleyin ve beş dakika sonra UV epifloresan mikroskobu altında gözlemleyin. Her bir tarlada her çeşit için iki Petri kabında yaklaşık 100 ila 200 polen tanesi içeren Petri kabı başına üç alanda canlı ve cansız polen tanelerini sayın. Polen tüplerini gözlemlemek için, yumuşatılmış pistilleri bir slayt üzerinde bir kapak camının altında% 1 anilin mavisi çözeltisi damlatın.Uyarıcı filtre BP340-390 ve bariyer filtre LP425 kullanarak UV epifloresan ile mikroskop altında stil boyunca polen tüpü büyümesini gözlemleyin. Tarladaki her çeşitten üç ila dört genç yaprak toplayın ve yapraklardan DNA çıkarın. 1,5 mililitrelik mikro tüplerde her bir astar çifti için bir ana karışım oluşturun.Tüm reaktifleri ekleyin ve iyice karıştırın. Bu ana karışımın 16 mikrolitresini, dört mikrolitre DNA şablonu veya kontrolü içeren her 200 mikrolitrelik PCR tüpüne ekleyin. Yavaşça karıştırın, kapakları kapatın ve 30 saniye boyunca 2.000 kez G'de santrifüjleyin.Tüpü termocycler'a yerleştirin ve metin el yazmasında belirtildiği gibi PCR programını çalıştırın. Jel elektroforezi ile parça boyutunu tahmin etmek için, ilk ve son kuyucuklara iki mikrolitre DNA merdiveni ve diğer kuyucuklara üç mikrolitre PCR ürünü yükleyin. Hazneyi kapatın ve jeli 30 dakika boyunca 100 voltta çalıştırın.Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak jeli UV ışığı altında gözlemleyin. Amplifiye edilmiş parçaların boyutunu tahmin etmek ve bunu pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırmak için DNA merdivenini kullanın. Farklı çiçeklenme yıllarında her çeşidin farklı ağaçlarının fenolojisini izleyin.İlk açık çiçeklerden son açık çiçeklere kadar çiçeklenme döneminin uzunluğunu belirleyin. BBCH'deki 65. aşamaya göre çiçeklerin en az% 50'si F aşamasında olduğunda tam çiçeklenme kabul edilir. Emaskülasyon veya ek tozlaşmadan sonra elle tozlaşan çiçeklerin meyve damlası deseni, çoğu çiçeğin tozlaşmadan iki ila üç hafta sonra düştüğünü, ancak kendi kendine tozlaşan çiçeklerin% 4'ünün ağaçta kaldığını gösterdi, bu da bu çeşidin kendi kendine uyumlu olduğunu gösteriyor.Canlı polen taneleri, kültür ortamında 24 saat sonra uzunluğundan daha uzun bir polen tüpü gösterdi ve canlı olmayan polen taneleri çimlenmedi. Tozlaşma sırasında polen taneleri stigmaya aktarıldı. Çimlenen her polen tanesi, pistil yapıları boyunca büyüyen bir polen tüpü üretti.Kendinden uyumsuz çeşitlerde, polen tüpü stilin üst üçte birinde büyümeyi durdurdu. Bununla birlikte, kendi kendine uyumlu çeşitlerde, polen tüpü stil boyunca büyüyebilir, yumurtalığa ulaşabilir ve bir yumurtayı dölleyebilir. PCR analizi, tatlı kiraz ve Japon eriğinin sRNA'larının korunmuş bölgelerinden elde edilen primerler kullanılarak gerçekleştirildi ve bu da her bir çeşitteki S-alellerinin boyutunun belirlenmesini mümkün kıldı.Toplam dört yıl boyunca çiçeklenme döneminin uzunluğu hesaplandı. Meyve bahçesi koşullarında çiçeklenme, her yıl çiçeklenme zamanında hangi çeşitlerin çakıştığının belirlenmesine izin verdi. Bu protokolü denerken, meyve tutumu yüzdesi diğer Prunus türlerine göre çok düşük olduğundan, el tozlaşması için daha fazla sayıda Japon eriği çiçeği kullandığınızdan emin olun.Moleküler yaklaşımlarla kendi kendine uyumsuzluğu belirlemek mümkün değildir. Bazı S-alellerinin kendi kendine uyumluluk ile ilişkili olup olmadığını değerlendirmek için S-alel diziliminin daha fazla çalışması gereklidir. Tarla ve laboratuvar yaklaşımlarının kombinasyonu, yeni ticari meyve bahçelerinin tasarımı için değerli bilgilerle sonuçlanmıştır ve diğer meyve ağacı türlerinde de kullanılabilir.

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz Setaris viridis'e (S. viridis) haçları gerçekleştirmek için bir metodoloji geliştirdik. Yöntem, uygun bir polen öldürmek için önce bir sıcak su tedaviye salkım budama içerir. Haçlar iyi-kontrollü bir büyüme rejimi aşağıdaki gerçekleştirilen ve genellikle 1 tohum / s salkımda başına çapraz tozlaşma 7 kurtarma neden vardır.

In Cross Sahne Yöntemleri<em&gt; Setaris viridis&#39;in</emOtlar için&gt; Yeni Bir Model Sistemi

Belirli bir bitki türünün tozlaştırıcılar etkinliğini göstermek için, saha deneyleri birden çok yöntem geliştirilmiştir. Bu çalışma Lycoris sanguinea var. Sanguinea vaka çalışması ve yeni tozlaşma mekanizması, kırma-tomurcuk tozlanma kullanarak tozlaşma ekoloji için tarla denemeleri temel yöntem gösterilmektedir.

Tozlaşma Ekoloji Saha Deneyleri: Örneği<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Burada, çiçekli phytotron koşullar altında mandalina ağaçları içindeki zorlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Su stresi, yüksek Aydınlatma şiddeti ve kısa bir süre içinde elde edilecek uygun çiçek izin bir simüle bahar photoperiod. Bu yöntem 1 yıl içindeki birkaç çiçekli dönemleri araştırmacılar sağlar.

Phytotron koşullar altında mandalina ağaçlarında çiçeklenme zorla

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Flüoresan mikroskopi ile öz-genotiyon un belirlenmesini birleştiren kayısı(Prunus armeniaca L.) çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini niçin pcr analizi ile s-genotipinin tanımlanması ile biraraya getiren bir metodoloji salıyoruz.

El-Tozlaşma, Mikroskopi ve Genetik Analizleri Birleştiren Kayısıda Öz ve İnter-(in)Uyumluluk İlişkilerinin Belirlenmesi

Bu protokol, narenciye çeşitlerinde polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için hızlı bir yöntem sağlar.

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi

Burada, Arabidopsis thaliana'da polen tüpü rehberliğini ve alımını gözlemlemek için ovüllerin alıcılığını artıran yarı in vitro (SIV) yöntemin geliştirilmesini açıklıyoruz. Yüksek verimli SIV cum septum yöntemi, dinamik döllenme sürecini izlemek için gametofit işaretleyici çizgileri ve genetik olarak kodlanmış biyosensörlerle birleştirilebilir.

Arabidopsis Polen Tüpü Alımı ve Çift Döllenmenin Semi-In Vitro Cum Septum Yöntemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Arabidopsis thaliana'da polen hidrasyon profillerini ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. Yeni yöntem daha yüksek çözünürlük sunar, invaziv değildir ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Protokol, tozlaşmanın erken aşamalarını düzenleyen süreçlerin daha ince bir diseksiyonu için yeni bir aracı temsil etmektedir.

Arabidopsis thaliana için Yüksek Çözünürlüklü, Tek Taneli, In Vivo Polen Hidrasyon Biyotahlili

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Kuş embriyonik gelişiminin geç aşamalarında yolk kesesi zarlarında lipid kullanım mekanizmasını incelemek için, birincil bir Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültürü sistemi kurduk.

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

Keşfedin, Japon eriği melezlerinde tozlaşma gereksinimlerini belirlemek için floresan mikroskopisi ve moleküler genotipleme yöntemlerini. Bu teknik, kendine uyumsuz çeşitler için uygun tozlayıcıların belirlenmesine yardımcı olur.

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

Daha fazla video keşfet