3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

Bu protokol, kanser hücrelerinin hücre dışı matrise istilasını düzenleyen mekanizmaları gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, küresel istila tahlilinin kurulumunu kolaylaştıran ve verimliliğini ve maliyetini artıran basit bir küresel görüntüleme cihazı kullanmasıdır. Meme karsinomunun modelini yapmak için küresel invazyon testini kullanarak gösterirken, bu test herhangi bir katı tümörün çevredeki sağlıklı dokuya istilası için mükemmel bir modeldir.

Ara çubuğun 3D baskısından sonra, plastik bir kapta çapraz bağlayıcıya 10:1 baz polimer oranını ağırlıklayın ve elde edilen PDMS çözeltisini fincanda iyice karıştırmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Kabı bir vakum odasına yerleştirin ve karışımın yüzeyine sıkışmış herhangi bir havayı çıkarmak ve kalan hava kabarcıklarını dağıtmak için vakum basıncını hızla serbest bırakın. Esnekliğini artırmak ve iki cam plakayı % 100 izopropanol ile temizlemek için 3D baskılı ara çubuğu beş dakika boyunca 100 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.

Aralayıcıyı iki temizlenmiş plaka arasında yıkanacak şekilde yerleştirin ve kalıbı plakaların dış kenarlarına kapatmak için alt kenara ve üst köşeye iki büyük bağlayıcı klipsi yerleştirin. Ara parçanın cam plakalarla yıkandığından emin olmak için kalıbın üst kısmını inceleyin ve PDMS karışımını kalıbın sol üst köşesine yavaşça ancak sürekli olarak eklemek için ucundan yaklaşık iki santimetre kesilmiş tek kullanımlık bir pipet kullanın. Tüm kalıp dolduğunda, PDMS'yi 100 santigrat derecede bir saat boyunca iyileştirmeden önce, oluşan hava kabarcıklarını çıkarmak için kalıbı vakum odasına yerleştirin.

Kuluçkanın sonunda, kalıbı oda sıcaklığına yerleştirin. Dokunmaya soğuk olduğunda, bağlayıcı klipslerini ve cam plakaları kürlenmiş PDMS'yi içeren ara tabaktan çıkarın ve aralayıcı ile cam plaka arasındaki kalıbın dört tarafında oluşturulan contayı kesmek için bir jilet kullanın. Ara parçadaki PDMS sayfasını ortaya çıkarmak için kalıbı ayırın ve PDMS sayfasını ara parçadan dikkatlice soymak için cımbız kullanın.

Levhayı bir kesme paspasına yerleştirin ve 17,5 milimetre çapında bir PDMS diski delmek için biyopsi zımbası kullanın, ardından diske eşit olarak dağılmış üç adet 5,5 milimetre delik açın. Her kesici uçtan toz parçacıklarını çıkarmak için bandı kullanın ve temizlenen kesici uçları çift taraflı bir bant parçasına yapıştırın. Bandı 10 santimetrelik petri kabının kapağına sarın ve kapağı açık 35 milimetre cam alt tabaklarla birlikte bir plazma makinesine yerleştirin.

Kesici uçları ve camı 300 militorrda bir dakikalık plazma tedavisi ile etkinleştirin ve her kesici ucun işlenmiş tarafını kesici uç başına bir işlenmiş cam alt kabın cam kısmına hızlı bir şekilde takmak için cımbız kullanın. Tüm kesici uçlar uygulandığında, kesici uçları bulaşıklara güvenli bir şekilde takmak için kabı döndürürken her kesici uçta eşit basınç uygulamak için işaretçi parmağını ve başparmağı kullanın. Tüm kesici uçlar sabitlendiğinde, ortaya çıkan küresel görüntüleme cihazlarını, gösterildiği gibi ikinci bir plazma tedavisi gerçekleştirmeden önce 60 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.

İkinci işlemden sonra, her kesici uç deliğine 35 mikrolitre taze hazırlanmış kaplama çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra kaplama solüsyonunun çıkarın ve cihazı damıtılmış suyla üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her deliğe 35 mikrolitre çapraz bağlama çözeltisi ekleyin.

Kuluçkanın sonunda, her cihazı UV ışığı altında 30 dakikalık bir inkübasyon için% 70 etanol ile doldurmadan önce, gösterildiği gibi cihazı damıtılmış suyla üç kez durulayın. Sterilizasyonun sonunda, cihazları damıtılmış suyla üç kez durulayın ve her cihaza 2,5 mililitre depolama çözeltisi ekleyin. Küreselleri kollajene gömmek için, cihazları yıkama başına üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, 30 mikrolitre taze hazırlanmış koleje bir sferoid eklemeden ve bir zamanlayıcıya başlamadan önce cihazların tamamen kurumasını bekleyin. Delikte sferoidin varlığını doğruladıktan sonra, gösterildiği gibi diğer iki deliğe küreseller ekleyin. PDMS sınırına yakın olan küreselleri daha yeni görmek veya birden fazla sferoid dağıtılırsa küreselleri ayırmak ve zamanlayıcıyı durdurmak için 10 mikroliter pipet ucu kullanın.

Sferoidi kollajen tabakasında dikey olarak ortalamak için, tohumlamadan sonra, cihazı ters çevirin ve kollajen polimerize olana kadar cihazı 37 derecede kuluçkaya yatırın, cihaz yönünü her iki dakikada bir toplam 30 dakika boyunca tersine çevirin, ardından cihaz başına 2,5 mililitre orta ekleyin ve sıfır saat zaman noktasında küresellerin bir görüntüsünü elde edin. Küresel bir görüntü cihazı kullanmak, kollajen içinde veya boyuna görüntüleme yoluyla kanser hücresi istilasının verimli bir şekilde gömülmesini ve zaman atlamalı kaydedilmesini kolaylaştırır. Bu sferoid altı gün boyunca sitoplazmik ve/veya nükleer floresan proteinlerin stabil ekspresyonunun gerekliliğini gerektiren uzunlamasına olarak görüntülenirken, boya etiketlemesi kullanılarak daha kısa bir süre boyunca benzer uzunlamasına görüntüleme yapılabilir.

Sferoidler de sabitlenebilir ve immünoblabeled olabilir. Örneğin, bu sferoidler epitel-cadherin, korteksin ve F-actin için immünolabeled edildi. Bu görüntülerde, zaman içinde küresel alanı ölçmek için Fiji makrosunu kullanarak görüntü işleme prosedürünün adım adım bir örneği gözlemlenebilir.

Küresel görüntüleme cihazının her deliğine tek bir küresel dağıttığından ve küreseli deliğin ortasına hem XY hem de Z yönlerinde konumlandıracağından emin olun. Cihaz tasarımı, deliklerin, kesici uçların ve cam alt tabakların boyutunu ve düzenini değiştirerek daha yüksek bir küresel verime uyum sağlayacak şekilde kolayca değiştirilebilir.