Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Bu protokol önemlidir, çünkü kullanıcının genetik olarak izlenebilir Drosophila larvalarında mekanik nosisepsiyon tepkilerini hassas bir şekilde ölçmek için kullanılabilecek bir araç oluşturmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, alt eşik değerinden tam duyarlı aralığa kadar mekanik nosisepsiyonunu ölçmek için kullanılabilecek özel araçlar oluşturmak için basit malzemeler kullanmasıdır. Bu araçlar ve yöntemler, yaralanma veya hastalığı takiben temel mekanik nosisepsiyon ve nosiseptif duyarlılığı ölçmek için kullanılabilir.

Larvaları özel filamentlerle araştırmak pratik gerektirir. Kullanıcılar, bir deney denemeden önce kontrol larvaları ile doz-yanıt eğrileri oluşturabilmelidir. Mekanik bir prob oluşturmak için, her bir Nitinol filamentini uzun eksenine dik olarak belirtilen uzunlukta kesmek için küçük bir tel kesici kullanın.

Filamentler önceden ayarlanmış üç farklı çapta gelir. Larva derisinde doku hasarına neden olabilecek ve kalibrasyonu engelleyebilecek keskin veya düzensiz kenarların kalmadığından emin olmak için filamentlerin ucunu stereo mikroskop altında inceleyin. Ardından, keskin düzensizlikler devam edene kadar probun kenarlarını manuel olarak düzleştirmek için bir bileme taşı kullanın.

Ardından, tahta bir buzlu şeker çubuğunun ucuna yakın bir delik açmak için hipodermik bir iğne kullanın. Tek bir Nitinol filamentine ahşap tutkalı uygulayın ve tutkal kaplı filamenti iğne yuvasına yerleştirin. Yapıştırıcı kuruduğunda, gram cinsinden kaydedilebilecek maksimum kuvveti belirlemek için prob bükülene kadar probu ölçeğe doğru bastırın.

Kaydedilen kütleyi milinewton cinsinden kuvvete dönüştürmek için formülü kullanın. Ardından, hesaplanan kuvveti kilopaskal basınca dönüştürmek için ölçülen kuvveti filament ucunun yüzey alanına bölün. Farklı çap ve uzunluklarda filamentler kullanarak birden fazla prob hazırlamak, Drosophila larvaları için duyarlı aralığı kapsayan tam bir set oluşturacaktır.

Drosophila larvalarını bir deneye hazırlamak için, larva döllerini standart gıda üzerinde 25 santigrat derece inkübatörde yaklaşık 96 saat boyunca büyütün. Larvalar üçüncü instar aşamasına ulaştığında, larvaların test edilmesi için küçük bir Petri kabında bir sinek yemi fişi hazırlayın ve orta büyüklükteki orta-üçüncü instar larvalarını daha küçük ikinci ve erken üçüncü instardan ve daha büyük geç veya dolaşan üçüncü instar larvalarından nazikçe ayırmak için forseps kullanın. Daha sonra forsepsleri kullanarak 20 ila 30 orta üçüncü instar larvalarını oda sıcaklığında suyla nemlendirilmiş küçük bir sinek yemi tıkacı içeren küçük bir Petri kabına aktarın.

Mekanik bir nosisepsiyon testi yapmak için, bir Brightfield stereo mikroskobu altında koyu ince bir vinil ped üzerine orta üçte birlik bir larva yerleştirmek için forseps kullanın ve mikroskop objektif lensleri ile ped arasına fiber optik ışıklar düzenleyin. Larvaları çevreleyen fazla suyu silmek için bir kağıt havlu kullanın ve larvanın başını ve ağzını araştırmacının baskın olmayan eline doğru yönlendirmek için pedi hareket ettirin. Mekanik bir prob seçin ve probu, larvanın arka dorsal tarafına yaklaşık abdominal segment A8'de bir ila iki saniye boyunca uygulayın, prob bükülene ve daha önce ölçülen basınç miktarını ortaya çıkarana kadar larvayı prob temas noktasında alttaki pedin içine dikkatlice sıkıştırın.

Larva, üç saniye içinde vücudunun ekseni boyunca 360 derecelik tam bir tirbuşon rulosu gösterirse, pozitif bir nosiseptif yanıt belirtilir. Her larva için davranışsal yanıtı kaydedin. Daha sonra test edilen larvaları atın ve bir sonraki larvayı test için hazırlayın.

Nitinol filamentli bu özelleştirilmiş mekanik problar, mekanik olarak uyarılmış davranışları ortaya çıkarmak ve değişen yoğunlukta hem zararsız hem de zararlı mekanik problar kullanarak tam bir davranışsal doz-yanıt eğrisi oluşturmak için kullanılabilir. Bu davranışsal tahlil sonuçlarının gösterdiği gibi, 200 kilopaskal veya daha az basınç uygulayan problar, Drosophila larvalarında caydırıcı bir yuvarlanma tepkisine neden olmaz. Beklendiği gibi, bu eşik altı veya zararlı olmayan mekanik problar görünür nöronal doku hasarına neden olmaz.

Tersine, süper eşikli veya zararlı problar, doza bağlı bir şekilde periferik duyusal nöronların kendilerine doku hasarının yanı sıra artırılmış bir davranışsal yanıt ortaya çıkarır. Bu problar, yaralanma sonrası mekanik aşırı duyarlılığı ölçmek için de kullanılabilir. Larvaların yaklaşık% 20'si UV tedavisinden iki saat sonra caydırıcı yuvarlanma ile yanıt verirken,% 50'si sahte UV ışınlanmış hayvanlara kıyasla dört saat yanıt vermiştir.

Bu analiz için kullanılan prob normalde eşik altı 200 kilopaskal olduğundan, bu yanıt mekanik allodini olarak kabul edildi. Daha sonraki zaman noktalarında, UV ile muamele edilmiş larvaların davranışsal tepkisi biraz artar, ancak sahte ışınlanmış kontrol grubununkinden istatistiksel olarak farklı değildir. UV tedavisini takiben dört, sekiz ve 16 saat sonra 462 kilopaskal prob ile incelenen larvalar, uyaran başlangıçta zararlı olduğu için davranışsal aşırı duyarlılığın zirvesi olan dört saat ile caydırıcı yuvarlanma tepkisinde önemli bir artış gösterir.

Yanıt mekanik hiperaljezi olarak kabul edildi. Prob hazırlığı ve larva seçimi ve sıkıştırması, işlemin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu problar kullanılarak başlangıç nosisepsiyon getirildi ve yaralanma sonrası mekanik nosiseptif aşırı duyarlılık ölçülebilir.

Bu araçlar ve tahliller kullanılarak, mekanik nosisepsiyon ve nosiseptif aşırı duyarlılığın moleküler ve genetik temelleri, genetik olarak izlenebilir Drosophila modelinde ölçülebilir.