Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma
12 Ocak 2021
Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.
Sistem, araştırmacıların optogenetik deneyler için ucuz ve çok yönlü bir aydınlatma sistemini kolayca inşa etmelerini sağlar. Bu tekniğin avantajları, LED aydınlatma zamanlamasını, görünür yakın IR spektrumunu kapsayan mevcut dalga boylarıyla programlama yeteneğini ve LED'lerin çeşitli bağlamlarda kullanılabileceğini içerir Bir elektrik devresi oluşturmak için, baskılı devre kartını yardım ellerine klipsleyin ve jumper tellerini yerleştirin, bunları A1 ve A3 iğne deliklerini oluşturacak şekilde birbirine bağlayın. D2 jumper teli D6 iğne deliğine ve güç kaynağı artı yedi numaralı jumper kablosu A7 iğne deliğine girer. Terminalleri 45 derece bükün ve akı ekleyin.
Lehimlemeden sonra, tellerin arkalarını kesin. Lehimli dişi telin bir ucunu konektörü A5 deliğine bağlayın. Ardından direncin bir ucunu A5 deliğine bağlayın.
Konektörün diğer ucunu toprağa bağlayın. Ardından direncin diğer ucunu toprağa bağlayın ve bağlantıyı lehimleyin. Arduino konektörü için, telin uçlarını kablo konektörlerine sıkın ve kıvrımlı uçları dikdörtgen konektörden geçirin.
LED'leri ayarlamak için, üstten lehim eklerken aşağıdan ısıtarak bir tel teneke kutulayın. Büyük lehimleme ucunun üzerine bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanı akı içeren temasta ısıtmak için ucu kullanın. Birkaç saniye sonra, lehimi her temas boyunca ayrı ayrı sürükleyin ve siyah teli bir saç tokası kullanarak katoda sabitleyin.
Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanındaki lehim eriyene kadar ucu telin üzerine bastırın. Teli basılı tutun ve teli yerinde tutarken havyayı çıkarın. LED bağlantıları için pedlerin üzerine az miktarda lehim macunu yerleştirin ve LED'i pedlerin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın.
Önceden konserve edilmiş kırmızı teli anot üzerinde tutun ve teli kesmek için bir saç tokası kullanın. Gösterildiği gibi büyük uca lehim ekleyin ve LED tabanındaki lehim eriyene ve lehim macunu eriyip gümüş olana kadar ucu bağlantıya bastırın. LED telleri yapmak için, uzunluğa kadar kesilmiş telin üzerine 4,76 milimetrelik bir büzülme tüpü ve tel konektörü için tel üzerine 3,18 milimetrelik bir büzülme tüpü yerleştirin.
Şeritleyin ve tel uçlarına akı ekleyin. Teli kabloya bağlamak için yardım ellerini kullanın ve konektör ucunu bir tel ucuyla döndürün. Malzemeleri birlikte lehimleyin ve diğer teli kuruluma aynı şekilde takın ve lehimleyin.
Ardından LED kablolarını, LED tabanının altındaki bantla yardım ellerine klipsleyin. Daha sonra, epoksiyi üreticinin talimatlarına göre karıştırın ve epoksiyi lehimli LED'in üstüne yayın. Kürek matkap ucunu kullanarak, LED'in yerleştirileceği kutunun üstünden 1,5 santimetrelik bir delik açın ve LED teline yer açmak için deliğin bir tarafında bir çentik yapmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın.
LED'in aydınlatacağı deliği kaplayan kara kutuya 25 ila 30 milimetrelik bir gizlilik filmi parçası bantlayın ve LED'i deliğin üstündeki kara kutunun dışına bantlayın. Dört LED kontrol sistemi için, kutunun kapağına 3,81 santimetre arayla dört adet 0,83 santimetre delik açın ve sol üst köşeye 1,19 x 1,90 santimetrelik dikdörtgen bir delik açmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın. Bir kürek matkap ucu kullanarak, kutunun arkasına 1,5 santimetrelik bir delik açın ve deliğe bir rommet yerleştirin.
Bilgisayar kontrollü LED'ler için, mikrodenetleyicinin yapıştırılacağı alanı zımpara kağıdı kutuya ve mikrodenetleyici tutucusunun alt tarafına yerleştirin. Mikrodenetleyiciyi tutucunun üzerine oturtun, ardından tutucuyu kara kutuya sabitlemeden önce tutucuyu ve kutuyu epoksi yapın. Ardından klipsin üzerine çift taraflı bant yerleştirin ve klibi kutunun içine sabitleyin.
Fitokrom B'yi eksprese etmek için transfekte edilen ancak fikosiyanin bilin olmayan örneklerde, muhabir DNA miktarı arttıkça sızıntı artar. Ek olarak, fikosiyanin iki krom üreten plazmid de dahil olmak üzere tüm fitokrom B gen anahtarı uzak kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da transfeksiyon karışımı içindeki muhabir yapısının artan miktarları ile artar. Benzer şekilde, ışığa duyarlı hücreler kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da artan muhabir miktarı ile artar.
Kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerin indüksiyon seviyelerini uzak kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerle karşılaştırırken, artan miktarda muhabirle birlikte kıvrım aktivasyonunda küçük bir azalma bulunur. Elektrik devresini oluştururken her adımı dikkatlice takip etmek ve her bir bileşeni lehimlemeden önce iğne deliği numaralarını satır satır iki kez kontrol etmek önemlidir. Bu protokol, çeşitli dalga boyları kullanarak birçok numune türünün veya optogenetik araçların optik stimülasyonu için kullanılabilir ve aydınlatma programlarının programlanmasına izin verir.
Genel Bakış
Bu protokol, optogenetik deneyler için çok yönlü bir aydınlatma sisteminin yapımını açıklar ve kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunun kontrolünü sağlar. Sistemin yapımı ve LED aydınlatmasının programlanması için adım adım talimatlar verilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optogenetik
- Gen ekspresyonu kontrolü
- Aydınlatma sistemleri
Arka Plan
- Optogenetik, ışık kullanarak hücresel fonksiyonların hassas kontrolünü sağlar.
- PhyB ve PIF3, ışığa duyarlı gen düzenlemesindeki anahtar bileşenlerdir.
- LED'ler çeşitli aydınlatma programları için programlanabilir.
- Bu sistem, farklı deneysel kurulumlar için uygun maliyetli ve uyarlanabilir olarak tasarlanmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Optogenetik aydınlatma sistemi yapımı için detaylı bir protokol sağlamak.
- Araştırmacıların belirli ışık dalga boylarını kullanarak gen ekspresyonunu kontrol etmelerine olanak tanımak.
- Çeşitli deneysel bağlamlarda optogenetik araçların kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- LED kontrolü için bir elektrik devresinin yapımı.
- LED aydınlatma zamanlamasının ve dalga boylarının programlanması.
- Otomatik kontrol için bir mikrokontrolörün montajı.
- Sistemin çeşitli raporör yapıları ile test edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Esnek bir aydınlatma sisteminin başarılı bir şekilde yapılması.
- Daha yüksek raporör DNA miktarları ile artan lüsiferaz ekspresyonunun gözlenmesi.
- Kırmızı ve uzak kırmızı ışık kullanarak gen ekspresyonunun kontrolünün gösterilmesi.
- Sistemin farklı numune türleri boyunca optik stimülasyona olanak tanıması.
Sonuçlar
- Protokol, optogenetik deneyler için güvenilir bir yöntem sunar.
- Araştırmacılar, bu sistemi gen düzenlemesinde çeşitli uygulamalar için kullanabilir.
- Protokole dikkatli bir şekilde uyulması başarılı sonuçlar sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
