Mikroakışkan Cihazlarda Elektrik Alan Kaynaklı SinirSel Öncül Farklılaşma
14 Nisan 2021
Bu çalışmada, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.
Bu çalışma, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral öncül hücrelerin farklılaşması için bir protokol sunun. Bu teknik, deneysel kurulum süresini, örnek hacmi ve reaktif hacmini azaltmak için yararlı bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, MOE çipi konfokal mikroskopi gözlemleri için uygundur.
Basit doğru akım darbe tedavisi fare sinirsel öncül hücrelerin kaderini kontrol edebilir ve sinir sistemi bozuklukları için terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabilir. Başlamak için, uygun yazılımı kullanarak tek tek PMMA katmanları ve çift taraflı bant için desenler çizin. Karbondioksit lazer katipini aç ve kişisel bir bilgisayara bağla.
Yazılımı kullanarak tasarlanmış desen dosyasını açın. PMMA levhalarını veya çift taraflı bandı lazer katibinin platformuna yerleştirin, ardından otomatik odaklama aracını kullanarak lazeri PMMA levhalarının yüzeyine veya çift taraflı bant üzerine odaklayın. Yazıcı olarak lazer katibi seçin, ardından PMMA sayfasında veya çift taraflı bantta doğrudan ablasyonu başlatmak için lazer katibi kullanın.
Koruyucu filmi PMMA levhalarından çıkarın ve azot gazı kullanarak yüzeyi temizleyin. Birden fazla PMMA levha katmanını birleştirmek için, bir milimetre PMMA levhadan üç parça istifleyin ve akış veya elektrik stimülasyon kanalı montajını oluşturmak için 110 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir termal bonder'da santimetrekare başına beş kilogram basınç altında yapıştırın. Hızlı etkili siyanoakrilat tutkallı MOE talaş tertibatının birinci katmanındaki ayrı açıklıklara 12 parça adaptör yapıştırın.
Çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama kullanarak bir milimetre PMMA substratlarını, çift taraflı bandı ve üç milimetre optik sınıf PMMA'yı dezenfekte edin. PMMA montajını tamamlamak için üç milimetre optik sınıf PMMA'daki bir milimetre PMMA substratlarını çift taraflı bantla yapıştırın. Temizlenmiş örtü örtüsünü çift taraflı bantla PMMA tertibatine yapıştırın.
Agar köprüsü adaptörlerinin açıklıklarını beyaz parmakla sıkı fişlerle kapatın. Düz alt konektörü orta giriş ve çıkış adaptörleri aracılığıyla MOE talaş tertibatine bağlayın, ardından koni Luer adaptörünü üç yönlü stopcock'lara bağlayın. Orta girişin üç yönlü stopcock'una bağlanan üç mililitrelik bir şırınna kullanarak iki mililitre% 0,01 PLL çözeltisi ekleyin ve orta çıkışın üç yönlü stopcock'una boş bir üç mililitre şırınna bağlayın.
Hücre kültürü bölgelerini PLL çözeltisi ile doldurun ve kaplama solüsyonunun ileri geri yavaşça pompalasının. Çözeltiyi kültür bölgelerinde kapatmak için iki üç yönlü stopcock'u kapatın. MOE çipini%5 karbondioksit atmosferiyle dolu bir inkübatörde bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
İki şırınna kullanarak kaplama solüsyonunu kanala ileri geri manuel olarak pompalayarak iki üç yönlü stopcock'u açın ve kanallardaki kabarcıkları boşaltın. Orta girişin üç yönlü stopcock'una bağlanan üç mililitrelik bir şırınna üç mililitrelik tam orta çizin ve hücre kültürü bölgelerindeki kaplama çözeltisini değiştirmek için ekleyin. Beyaz parmakla sıkı fişi Luer adaptörüyle değiştirin ve adaptörü doldurmak için %3 sıcak agarose enjekte edin.
Luer kilit şırıngasını Luer adaptörüne bağlayın ve Luer kilit şırıngasını doldurmak için siyah kauçuk nargileden% 3 sıcak agarose enjekte edin. Agarose'un soğuması ve katılaşması için 10 ila 20 dakika bekleyin. Hücre tohumlu MOE çipini, 37 santigrat derecede tutulan programlanabilir bir XYZ motorlu sahneye tutturulmuş şeffaf ITO ısıtıcısına takın.
MNPC'leri orta çıkış üzerinden MOE çipine manuel olarak pompalayarak aşıleyin, ardından ito ısıtıcısındaki hücre tohumlu MOE çipini dört saat boyunca kuluçkaya bırakın. Çip üzerindeki elektrotlar aracılığıyla MOE çipine bir EF çoklayıcı bağlamak için elektrik kablolarını kullanın. Kare dalga DC darbelerini çıkarmak için bir EF çoklayıcı ve bir fonksiyon üreteciyi bir amplifikatöre bağlayın.
MOE çipi üzerindeki tüm düz alt konektör ve adaptörleri çıkarın ve adaptörleri PBS ile doldurun, ardından adaptör açıklıklarını parafilm ile kapatın. İmmünasyondan sonra, konfokal floresan mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin. DC darbe stimülasyonu, kök hücre bakım ortamında eşzamanlı mNPC'lerin nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşmasına neden oldu.
Kontrol grubunda ve stimülasyon grubunda nöron, astrosit ve oligodendrositlerin yüzdeleri burada gösterilmiştir. DC nabız tedavisinden sonra, MNPC'ler DIV yedide önemli sayıda nöron, DIV üç'te astrositler ve DIV yedi ve DIV 14'te oligodendrositler stimülasyon gruplarında kontrol grubuna göre nispeten daha yüksek seviyelerde mevcuttu. MNPC farklılaşması başlatmak için 30 ila 40 hücrenin oluşturduğu nörosferler tercih edilir.
MNPC'lerin aşırı büyümesi, farklılaşma sürecinde hücre sağkalımını bozacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir mikroakışkan sistemde doğru akım darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral öncül hücrelerin farklılaşması için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik; deney düzeneği süresini, örnek hacmini ve reaktif hacmini azaltarak araştırma uygulamaları için verimli hale getirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Sinirsel öncül hücreler (NPC'ler), sinirsel gelişimin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Doğru akım darbe stimülasyonu, hücre kaderini etkileyebilir.
- Mikroakışkan sistemler, deneysel koşulların hassas kontrolüne olanak tanır.
- Bu yaklaşım, sinir sistemi bozuklukları için tedaviler geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- NPC diferansiyasyonu için güvenilir bir protokol oluşturmak.
- Hücre kaderini kontrol etme yöntemi olarak doğru akım stimülasyonunu kullanmak.
- Nörobilim araştırmalarında mikroakışkan bir sistemin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- PMMA katmanları ve çift taraflı bant için desenlerin tasarlanması.
- Fabrikasyon için karbondioksit lazer kazıyıcı kullanılması.
- NPC'lere doğrudan doğru akım darbe stimülasyonunun uygulanması.
- Analiz için konfokal mikroskopi gözlemlerinin yapılması.
Temel Sonuçlar
- Önerilen protokol kullanılarak NPC'lerin başarılı bir şekilde diferansiyasyonu.
- Deneysel kurulum süresinde ve kaynak kullanımında azalma.
- Mikroskopi için MOE çipinin kullanımının fizibilitesi.
- Sinir sistemi bozukluklarına yönelik terapötik stratejilerdeki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Protokol, NPC diferansiyasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunmaktadır.
- Doğru akım stimülasyonu, hücre kaderinin kontrol edilmesinde etkilidir.
- Mikroakışkan sistemler, nörobilimdeki deneysel verimliliği artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Özeti: Endüstriyel Uygunluk
Bu mikroakışkan platform, doğru akım darbe stimülasyonu kullanarak nöral öncül hücre farklılaşmasının hassas kontrolünü mümkün kılarak, nörodejeneratif hastalık araştırmalarında hedef doğrulaması için ölçeklenebilir ve kaynak açısından verimli bir model sunar. Deneysel karmaşıklığı ve reaktif tüketimini azaltarak, erken aşama mekanistik risk azaltma süreçlerini ve hücre kader modülasyon stratejilerindeki öngörücü güveni destekler. Sistemin uzun süreli stimülasyon ve otomatik görüntüleme ile uyumluluğu, sinir sistemi terapötiklerine odaklanan keşif iş akışlarına entegrasyonu için uygun bir konum sağlamaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Elektriksel sinyallerin nöral öncül hücre kaderini düzenleyen faktörler olarak sorgulanmasını sağlayarak, nörogelişimsel yolaklardaki hedef hipotezlerinin test edilmesini destekler.
- Operasyonel Değer: Mikroakışkan sınırlama yoluyla örnek ve reaktif hacimlerini azaltarak, erken hedef tarama kampanyalarındaki maliyetleri düşürür.
- Öngörücü Değer: Nöronal, astrositik ve oligodendrositik farklılaşmaya dair kantitatif veriler sunarak, modülatör hedefler üzerinde veri odaklı devam/durdur kararlarının alınmasını sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz optimizasyonuna uygun, kontrollü elektrik alanı parametreleri altında standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir farklılaşma çıktıları üretir.
- Operasyonel Değer: Kanal tabanlı tasarımlar aracılığıyla çoklu koşul testlerini kolaylaştırarak bileşik veya stimülasyon değerlendirmelerinde işlem hacmini artırır.
- Analiz Hazırlığı: Uzun süreli kültüre ve zaman geçirmeli (time-lapse) görüntülemeye destek vererek, analiz doğrulama için farklılaşma dinamiklerinin kinetik profillenmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Belirli bir mikroortamda fare nöral öncül hücrelerini kullanarak in vivo nöral farklılaşma süreçleriyle olan ilgiyi artırır.
- Preklinik Modelleme: Ortak bir progenitörden glial ve nöronal soy hatlarının oluşturulmasını destekler, bu da sinir sistemi hastalıklarının modellenmesi için faydalıdır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Stimülasyon altında farklılaşma eğiliminin değerlendirilmesine olanak tanıyarak mekanistik güvenlik ve etkinlik profillemesine bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle hücre kader düzenleyicilerinin mekanizmasının anlaşılmasının kritik olduğu hedef doğrulama ve öncü bileşik tanımlama aşamaları olmak üzere, erken keşif sürecine uygundur. Elektriksel veya farmakolojik modülatörlerin biyolojik aktivitelerini değerlendirmek için kontrollü ve nicelendirilebilir bir sistem sunarak tarama kampanyalarını destekler. Platformun çıktısı olan soyağacına özgü farklılaşma metrikleri, nöral onarım mekanizmalarında öngörücü güvenle hedefleri önceliklendirmek için kullanılan analitik veri hatlarını besler.
- Keşif Biyolojisi: Nöral öncül hücrelerdeki biyoelektrik sinyalizasyon yolları üzerine hipotez testlerini destekleyerek hedef mekanizmadaki belirsizliği azaltır.
- Tarama: Tanımlanmış elektriksel stimülasyon altında tekrarlanabilir, kantitatif farklılaşma analizlerine olanak tanıyarak analiz güvenilirliğini artırır.
- Analitik: Farklı koşullar arasında karşılaştırmalı analiz için ölçülebilir uç noktalar (örneğin, % nöronlar, astrositler, oligodendrositler) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Sinir sistemi bozukluklarıyla ilgili farklılaşma dinamiklerini modeller ve preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çoklu deneysel koşullar altında tekrarlı kullanım için tasarlanmış olup standardizasyonu ve projeler arası tutarlılığı teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre kaderinin belirlenmesinde elektriksel stimülasyonu tanımlanmış bir değişken olarak izole ederek hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Mikroakışkan hassasiyeti aracılığıyla farklılaşma protokollerini standartlaştırarak farklı merkezler ve ekipler arasındaki tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Soy hattı taahhüdüne ilişkin erken dönem mekanistik veriler sağlayarak go/no-go kararlarını hızlandırır ve geç evre başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Nöral farklılaşmayı modüle eden hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlayarak nörobilim portföylerinde sermaye verimliliğini artırır.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkan cihaz montajı, elektrofizyoloji ve nöral kök hücre kültürü konularında uzmanlık gerektirir.
- Lazer üretim araçlarına, ITO ısıtıcılara, EF çoklayıcılara ve evirmiş mikroskopi sistemlerine erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için deneyler genelinde elektriksel parametrelerin (darbe genişliği, frekans, genlik) standartlaştırılması gereklidir.
- İnsan kaynaklı nöral öncül hücrelere adaptasyon, stimülasyon parametrelerinin ve kültür koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Kronik stimülasyon çalışmalarında uzun vadeli elektrot stabilitesi ve biyokirlenme, dikkate alınması gereken pratik sınırlamaları temsil eder.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
