Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon
5 Aralık 2020
Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.
Beyinciğin geleneksel moleküler çalışmaları, belirli serebellar bölgeler arasındaki herhangi bir ayrımı maskeleyebilen tüm serebellar ekstraktlar üzerinde yapılmıştır. Bu protokol, serebellumun farklı bölgelerinin ayrı ayrı değerlendirilmesini mümkün kılar ve çeşitli davranışlara ve hastalığın ilerlemesine benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, dört serebellar bölgenin, derin serebellar çekirdeklerin, Vermis'in ön ve arka serebellar korteksinin ve hemisferlerin serebellar korteksinin tekrarlanabilir ve hızlı diseksiyonuna izin vermesidir.
Ötenazi yapılan farenin başını kestikten sonra, başın medial sagital çizgisi boyunca burundan başlayıp geriye doğru devam eden bir jiletle bir kesi yapın. Cildi ayırın ve kulak kanallarını geçerek her iki taraftaki kasları kesmek için tıraş bıçağını kullanın. Diseksiyon makası kullanarak, beyinciklere zarar vermemeye özen göstererek, beyin sapının beyincik ile birleştiği yere kadar birçok omurilik bölgesini kesin.
Vasküler makas bıçaklarından birini beyin sapı ile omur sütunu arasındaki boşluğa yerleştirin ve dokuya verilen hasarı sınırlamak için keserken yukarı kaldırarak kulak kanalına doğru kesin. Kafatasının kenarı boyunca koku soğancıklarına doğru kesmeye devam edin. Künt forsepsleri kullanarak, beynin ve beyinciğin arka bölgesini ortaya çıkarmak için bu kafatasının arkasını nazikçe soyun.
Künt forsepsleri kafatasının kesik kenarı boyunca konumlandırın ve kafatasını yukarı ve beynin üzerine soyun. Kafatasının geri kalanını vasküler makas ve künt forseps ile kesin ve çoğunu beynin üstünden temizleyin. Kalan kafatasından koku alma ampullerini çıkarmak ve optik kanal liflerini ayırmak için beyni mikro spatula ile hafifçe kaldırın.
Beyin bu noktada kolayca serbest kalmalıdır. Beyni Petri kabına yerleştirin, buzun üzerine oturtun ve kalan kafatasını veya diğer kalıntıları temizleyin. Beyni, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde nazikçe beyin matrisine yerleştirin.
Matriste ayarlanan seviye olduğundan ve orta çizginin merkezde olduğundan emin olun. Bir tıraş bıçağını sagital orta hat boyunca yerleştirin ve bıçağın matrisin dibine kadar ittiğinden emin olun. İlk bıçağın yan tarafına bir milimetre daha tıraş bıçağı yerleştirin.
Beynin bir tarafına, hepsi bir milimetre aralıklı üç bıçak yerleştirilmesine neden olacak şekilde iki bıçak daha yerleştirin. Bunu diğer tarafta tekrarlayın. Tıraş bıçaklarının ön ve arka ucunu dikkatlice tutun ve matristen düz bir şekilde yukarı kaldırın.
Tıraş bıçaklarının dışındaki dokuyu atın. Doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat ederek her seferinde bir tıraş bıçağını diğerlerinden yavaşça ayırın. Mendil bölümünü tıraş bıçağından çıkarın ve mikro spatula ile cam sürgünün üzerine kaydırın.
Altı sagital beyin bölümü toplanmalıdır. En önde gelen yan bölümler DCN'ye görünür olacaktır. DCN'yi izole etmek için, DCN'nin üzerinde dik olarak 200 mikrolitrelik bir pipet ucu tutun ve her yöne sıkıca sallanan dokudan aşağı doğru itin.
Pipeti yukarı kaldırın ve uçtaki dokunun varlığını görsel olarak onaylayın. Bir parmağınızı ucun üstüne yerleştirin ve aşağı doğru bastırarak dokunun dışarı çıkmasına neden olun. Ucu doğru etiketlenmiş bir mikrofiş tüpüne yerleştirin ve doku zımbasının tüpün altına yerleştirildiğinden emin olun.
DCN zımbalarını aynı tüpe yerleştirerek kalan üç bölüm için bunu tekrarlayın. Flaş tüpü sıvı nitrojen içinde dondurun. DCN'nin çıkarıldığı bölümlerde beyincik etrafındaki beyin dokusunun geri kalanını uzaklaştırın.
Bu yarım küre serebellar korteks bölümlerini nazikçe almak için künt forseps kullanın ve bunları ilgili mikrofiş tüplerine yerleştirin, ardından hızlı dondurun. Son iki vermal bölüm için, sadece beyincik bırakmak için çevredeki beyin dokusunu itin. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ön dudakları arka dudaklardan ayıran bir kesim yapın.
Kesimin labial six oluşumundan hemen sonra olduğundan ve labial 10'u içermediğinden emin olun. Künt forsepsler kullanarak, ön serebellar korteks bölümlerini ve arka serebellar korteks bölümlerini dikkatlice ilgili mikrofiş tüplerine yerleştirin ve tüpleri beş dakika boyunca sıvı nitrojen içinde bırakarak hızlı dondurun. Dokunun çok hızlı çözülmesini önlemek için mikrofiş tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve mikrofiş tüpüne 150 mikrolitre soğuk RNA izolasyon solüsyonu uygulayın, ardından sterilize edilmiş bir havaneli ile homojenize edin.
Doku homojenize edildikten sonra, geriye sağlam doku kalmadığından emin olmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin. Ayrıca, küçük doku parçalarını birkaç kez bir insülin şırıngasına çekerek parçalayın. 350 mikrolitre daha reaktif ekleyin, iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin.
Tüpe 150 mikrolitre kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın, ardından iki ila üç dakika dinlendirin. 10 dakika boyunca 15 santigrat derecede 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın ve santrifüjün sıcaklığını dört santigrat dereceye ayarlayın.
Opak interfazı bozmamaya dikkat ederek sadece berrak sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Tüplerde kalan çözeltiyi kaydedin veya atın. Bir ila iki oranında %100 izopropil alkol ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
RNA'yı çözeltiden çökeltmek için numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. 10 dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin, peleti görselleştirmeyi kolaylaştırmak için tüm tüpleri aynı yöne yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra, tüpleri dikkatlice çıkarın ve peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı pipetle çıkarın.
Pelet jel gibidir ve görülmesi zordur, bu nedenle santrifüjdeki tüplerin yönüne göre nerede olduğunu tahmin edin. Tüm süpernatanı çıkardıktan sonra, 500 mikrolitre% 75 etanol ekleyin, kısaca girdap yapın ve beş dakika boyunca 7, 500 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın, peleti bozmadan.
Numuneyi beş ila 10 dakika kurutmak için kapakları açık bırakın. Kuruduktan sonra, peleti DNA'nın serbest suyunda 20 mikrolitrede DCN örneklerine ve diğerleri için 30 mikrolitrede yeniden süspanse edin. Numuneleri daha fazla analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Bu protokol, fare beyinciğinin dört farklı bölgesini incelemek ve gen ekspresyonundaki bölgesel farklılıkları keşfetmek için kullanıldı. Aldolaz C, parvalbumin ve KCNG4 ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak değerlendirildi. Aldolaz C, posterior serebellar vermiste daha yüksek oranda eksprese edilir.
Ancak DCN'de ve vermisin ön bölgesinde toplu serebellar diseksiyon ile karşılaştırıldığında daha düşüktür. Parvalbumin, toplu serebellar ekstraktlarla karşılaştırıldığında, DCN anterior vermis, posterior vermis ve hemisfer serebellar kortekslerinde benzer şekilde bulunur. KCNG4, DCN ve iç vermiste önemli ölçüde zenginleştirilmiştir, ancak toplu ekstraksiyon ile karşılaştırıldığında posterior vermis veya hemisferlerde değildir.
Aldolaz C'nin serebellar korteks boyunca ekspresyonunu doğrudan karşılaştırmak için, ekspresyon seviyeleri anterior vermis ile karşılaştırıldı. Aldolaz C'nin ekspresyon seviyesi posterior Vermis'te anlamlı olarak daha yüksekti ve serebellar hemisferlerde daha yüksek eğilim gösterdi. Bu bölgelerden çıkarılan RNA, RNA dizilemede, deneylerde de kullanılabilir.
Bunları serebellar bölgeler için karşılaştıran RNA dizisi, bu bölgelerin altında yatan ayrık fonksiyonlar olan moleküler mekanizmalar hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlayacaktır. Hastalıktaki savunmasızlıklarındaki potansiyel farklılıkların yanı sıra.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, belirgin serebellar bölgelerin —özellikle hemisferlerin, vermis'in anterior ve posterior bölgelerinin ve derin serebellar çekirdeklerin — tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde diseksiyonu için bir yöntem sunmaktadır. Amaç, belirli serebellar bölgelerle ilişkili benzersiz davranışsal çıktıların temelini oluşturabilecek gen ifadesindeki moleküler farklılıkları aydınlatmaktır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Moleküler Biyoloji
- Gen Ekspresyonu
Arka Plan
- Serebellumun çeşitli davranışsal çıktılar üzerinde etkili olduğu bilinmektedir.
- Geleneksel çalışmalar sıklıkla tüm serebellum özütlerini analiz eder, bu da bölgesel farklılıkların gözden kaçmasına neden olabilir.
- Odaklanmış bir yaklaşım, farklı serebellum bölgelerindeki spesifik moleküler mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Belirli serebellar bölgelerden RNA izole etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Serebellar bölgeler arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırmak.
- Davranış ve hastalıkların moleküler temellerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntem, ötanize edilmiş farelerden serebellar bölgelerin diseke edilmesini içerir.
- Temel biyolojik model, fare serebellar dokularını kapsamaktadır.
- İzole edilen RNA, gen ekspresyon analizi için işlenir.
- Kritik prosedür adımları arasında dikkatli diseksiyon, hızlı dondurma ve dokunun homojenizasyonu yer almaktadır.
Ana Sonuçlar
- Protokol, serebellar bölgeler arasındaki moleküler farklılıkların belirlenmesine olanak tanır.
- Bulgular, belirli bölgelerin davranışa nasıl özgün katkılarda bulunabileceğine dair içgörüler içerir.
- Bu işlem, serebellar fonksiyonla ilgili gen ekspresyon değişimlerinin incelenmesine imkan sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, moleküler çalışmalar için serebellar bölgelerin diseksiyonu ve analizi için yeni bir yöntem sunmaktadır.
- Bu yaklaşım, serebellar bölgeye özgü mekanizmalar ile davranışsal sonuçlar arasındaki ilişkinin anlaşılmasını kolaylaştırmaktadır.
- Elde edilen bulgular, serebellumun çeşitli hastalıklardaki rolünün moleküler temellerine dair bilgilerin ilerlemesini sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Uygunluk
Serebellumun bölgesel diseksiyonu, tüm doku ekstraktlarının fonksiyonel heterojeniteyi maskelediği nörobilim araştırmalarındaki temel bir kısıtlamayı gidererek, farklı beyin bölgelerinin hassas moleküler analizine olanak tanır. Bu yaklaşım, gen ekspresyon modellerini hareket, biliş, afekt ve ödül yollarıyla ilişkili spesifik serebellar alt bölgelere bağlayarak hedef doğrulamayı destekler. Tanımlanmış anatomik bölgelerden dokunun tekrarlanabilir şekilde izole edilmesini sağlayan bu yöntem, preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır ve MSS ilaç keşif programlarında mekanistik risk azaltma süreçlerine veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Motor kontrol ve nöropsikiyatrik fonksiyonlarla ilişkili serebellar bölgelerden moleküler imzaların izole edilmesini sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Derin serebellar çekirdeklerin, vermis korteksinin ve hemisferik korteksin diseksiyonu için standardize bir iş akışı sağlayarak, sonraki omiks analizlerindeki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: qPCR ve RNA-seq için uygun, bölgeye özgü RNA girdileri oluşturarak serebellar alt bölgeler arasında gen ekspresyonunun kantitatif karşılaştırmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Şok dondurma ve tutarlı homojenizasyon protokolleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu destekleyerek laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Anatomik olarak tanımlanmış serebellar bölgeler arasındaki moleküler profilleri karşılaştırarak, hastalık modellerindeki bölgesel hassasiyetin araştırılmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Diseke edilen dokuların −80°C'de biyobankalanmasına olanak tanıyarak, hedef doğrulama süreçlerindeki boylamsal çalışmaları ve deneyler arası karşılaştırmaları destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, serebellumdan anatomik olarak çözümlenmiş moleküler veriler sağlayarak, hipotez odaklı hedef belirleme ve preklinik doğrulamayı destekler ve erken keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Gen ekspresyonunun (örneğin, Aldolase C, parvalbumin, KCNG4) bölgesel serebellar fonksiyonla korelasyonunu sağlayarak yolak aydınlatılmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Yüksek hassasiyetli tespit için uygun standartlaştırılmış RNA ekstraktları üreterek, farklı deneysel koşullar arasındaki moleküler durumların güvenilir şekilde karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
- Analitik: qPCR ve RNA-seq'ten elde edilen kantitatif verilerle, ekiplerin hedef etkileşimini ve yolak modülasyonunu bölgesel hassasiyetle değerlendirmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerinde duygu, biliş ve motor koordinasyonla ilişkili bölgelerin analizini mümkün kılarak, moleküler bulguları davranışsal fenotiplerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla fare soyu ve hastalık modeli genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir diseksiyon çerçevesi oluşturarak mükerrer yöntem geliştirme sürecini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tüm beyincik analizlerinde maskelenen bölgeye özgü moleküler mekanizmaları ortaya çıkararak hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş diseksiyon, dondurma ve RNA izolasyon adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği artırır ve teknik varyasyonu minimize eder.
- Stratejik Değer: Beyincik hedefleri üzerinde mekanistik netlik sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir ve MSS programlarındaki geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Bölgesel ekspresyon modellerine ve hastalıkla ilişkisine dayalı olarak hedeflerin riskle ayarlanmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Serebellar bölgelerin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak için nöroanatomi ve mikrocerrahi diseksiyon teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Doku işlemleri için kriyojenik ekipmanlara (sıvı azot, −80°C dondurucu) ve hassas araçlara (vektör makas, küt uçlu pens, mikro spatula) erişime bağlıdır.
- Doku punch derinliği ve bölge tanımlamasında tutarlılığı korumak için ekipler arasında standardize edilmiş eğitim gereklidir.
- İşleme süresini minimize ederek ve diseksiyondan resüspansiyona kadar soğuk zinciri koruyarak RNA degradasyonu riskleri dikkate alınmalıdır.
- DCN gibi küçük bölgelerden elde edilen doku verimi ile sınırlıdır; bu durum, düşük girdi RNA-seq gibi alt uygulamalar için girdi miktarlarının optimizasyonunu gerektirir.
