Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri
6 Haziran 2021
Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.
Bu yöntem, kurbağa yumurtası ekstraktları kullanılarak sitoplazmik dinamiklerin canlı görüntülenmesi için uygundur ve sitoplazmadaki mekansal desen bilgisinin incelenmesini sağlar. Numuneler, düzgün ve ayarlanabilir kalınlığa sahip bir katman halinde şekillendirilebilir ve bir 2B alan veya 3B hacim boyunca görüntülenebilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve uygulanması kolaydır.
Bir rulo aplikatörlü bir cam slayda bir FEP yapışkan bant tabakası uygulayarak başlayın. Kenarlardaki aşırı bandı temiz bir tıraş bıçağı ile kesin. Ardından, FEP bant kaplı kapak fişlerini aynı şekilde hazırlayın.
Ardından, kızağın FEP bant kaplı tarafına çift taraflı yapışkan bir görüntüleme aralayıcısı uygulayın ve koruyucu astarı soyulmadan bırakın. Yumurtaları 400 mililitrelik bir cam behere aktarın ve dekantasyon yaparak mümkün olduğunca fazla yumurtlama tamponunu çıkarın. Daha sonra yumurtaları 100 mililitre taze hazırlanmış dejelleme çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın ve yavaşça döndürün.
Yaklaşık üç dakika sonra, çözeltiyi dökün ve 100 mililitre taze jelleşme çözeltisi ekleyin. Yumurtalar sıkıca paketlenene kadar inkübasyona devam edin, ancak yumurtaları jöle çözeltisinde toplam beş dakikadan fazla bırakmaktan kaçının. Kuluçkadan sonra, jelleştirici çözeltiyi mümkün olduğunca çıkarın ve yumurtaları 0.25x MMR tamponunda yıkayın.
Yumurtaları döndürün, sonra tamponu dökün. Yıkamalar için toplam bir litre tampon kullanılıncaya kadar birkaç kez tekrarlayın. Daha sonra, yumurtaları birkaç kez toplam 400 mililitre yumurta lizis tamponu ile yıkayın, yıkamalar arasında anormal yumurtaları çıkarın.
Ardından, yumurtaları bir mililitre yumurta lizis tamponu içeren 17 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarmak için geniş kesim uçlu bir transfer pipeti kullanın. Yumurtaları paketlemek için tüpü 400 g'da klinik bir santrifüjde 15 saniye boyunca döndürün. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak yumurta lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
Paketlenmiş yumurtaların yaklaşık hacmini belirleyin. daha sonra aprotinin, leupeptin ve cytochalasin B'nin her birine mililitre başına beş mikrogram ve doğrudan paketlenmiş yumurtaların üzerine mililitre sikloheksamidin başına 50 mikrogram ekleyin. Sallanan bir kova rotorunda tüpü 12.000 g ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca merkezleyerek yumurtaları ezin.
Ardından, bir şırıngaya 18 gauge iğne takın. İğne ucu eğimi yukarı bakacak şekilde tüpü sitoplazmik tabakanın altındaki taraftan delin ve yavaşça çizerek ekstraktı geri kazanın. Geri kazanılan sitoplazmik ekstraktı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun.
Görüntülemeye hazır olduğunda, ekstraktı istenen reaktifler ve floresan görüntüleme probları ile destekleyin. Üst koruyucu astarı hazırlanan slayt üzerindeki görüntüleme aralayıcısından çıkarın ve kuyunun ortasına yaklaşık yedi mikrolitre ekstrakt biriktirin. Kuyuyu kapatmak ve hızlı bir şekilde görüntülemeye devam etmek için FEP bant kaplı kapak kaymasını derhal FEP tarafı ekstrakta bakacak şekilde uygulayın.
Slaytı, motorlu bir sahne ve dijital kamera ile ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop üzerine ayarlayın. Ekstraktları hem parlak alan hem de floresan kanallarındaki zaman aralıklarında istenen uzamsal konumlarda görüntüleyin. İnterfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için xenopus laevis yumurta ekstraktlarını kullanan hızlandırılmış bir deney burada gösterilmiştir.
Oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakikalık inkübasyondan sonra, ışık saçılan sitoplazmik bileşenlerin tükendiği alanlar hem parlak alanda hem de mitokondri kanallarında görülebiliyordu. Oda sıcaklığında yaklaşık 60 dakika boyunca, hücre benzeri bölmelerden oluşan mekansal bir desen, içi boş çelenk benzeri bir yapı oluşturan mikrotübüller ve her bölmeye açıkça yerleştirilmiş mitokondri ile iyi bir şekilde kurulmalıdır. Cam üzerinde FEP bantları olan ve olmayan görüntüleme odalarındaki ekstrakt performansının karşılaştırılması burada gösterilmiştir.
FEP bantlı camdan yapılmış odada, ekstrakt normal hücre benzeri desenlere kendi kendini organize etti. Cam yüzeylerin FEP bandı ile kaplanmadığı odada, ekstrakt zamanla giderek daha fazla bozulan anormal parlak alan ve mikrotübül desenleri gösterdi. GST-mCherry-NLS proteininin nükleer ithalatında anlamlı bir fark gözlenmedi.
Hatırlanması gereken önemli şeyler, cam yüzeyleri FEP bant ile pasifleştirmek ve ekstrakt hazırlama sırasında tüm kötü yumurtaları çıkarmaktır. Bu sistemle, ekstrakt numunesinin kalınlığını kolayca kontrol edebilir, ışık tabakası mikroskobu kullanarak sitoplazmik kalıpları 3D olarak görüntülemenin yolunu açabiliriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için optimize edilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, sitoplazmik dinamiklerin ve sitoplazma içindeki uzamsal modellerin gelişiminin incelenmesine olanak tanıyarak hücresel organizasyona dair içgörüler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Mikroskopi
- Gelişim biyolojisi
Arka Plan
- Sitoplazmik dinamikler, hücresel organizasyonun anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Kurbağa yumurtalarından elde edilen ekstraktlar, bu süreçlerin incelenmesi için uygun bir sistem sunar.
- Canlı görüntüleme teknikleri, sitoplazmadaki uzamsal örüntülerin araştırılmasını geliştirmektedir.
Kullanılan Yöntemler
- Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması.
- Görüntüleme sırasında örnek stabilitesi için FEP bant kullanımı.
- Floresan belirteçler ve açık alan mikroskobisi kullanılarak canlı görüntüleme.
Temel Sonuçlar
- Sitoplazmik ekstraktlarda zaman içindeki kendi kendine organizasyonun başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- Belirli mikrotübül yapılarına sahip hücre benzeri kompartmanların oluşturulması.
- Yüzey işlemlerine dayalı görüntüleme performansının karşılaştırılması, ekstrakt organizasyonu üzerinde önemli etkiler olduğunu göstermiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, sitoplazmik yapıların ve dinamiklerin görüntülenmesi için pratik bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, hücresel süreçlere dair anlayışımızı geliştirmekte ve hazırlama tekniklerinin önemini vurgulamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Bu yöntem, Xenopus laevis yumurta ekstraktlarındaki sitoplazmik dinamiklerin canlı görüntülemesine olanak tanıyarak, hücresel organizasyonla ilgili uzaysal patern oluşumu ve kendi kendini organize etme süreçlerini incelemek için ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir sistem sunar. Kimyasal yüzey işlemleri ihtiyacını ortadan kaldıran ve seri üretim sarf malzemeleri kullanan bu yöntem, kontrollü bir in vitro ortamda mikrotübül, nükleer ve mitokondriyal organizasyonun tekrarlanabilir, yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini destekler. Bu yaklaşım, sitoplazmik davranışın mekanistik çalışmalarındaki öngörü güvenilirliğini artırarak, keşif süreçlerindeki erken evre hedef doğrulamayı ve assay geliştirmeyi destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sitoplazmik öz-organizasyon ve mekansal örüntüleme mekanizmalarıyla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fizyolojik olarak ilgili bir ekstrakt sisteminde dinamik sitoplazmik organizasyonun görselleştirilmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Translasyonel Biyobelirteç: Fonksiyonel hücresel durumlarla ilişkili olabilecek dinamik sitoplazmik özelliklerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Deney Standardizasyonu: FEP bant pasivasyonu kullanarak, tekdüze kalınlıkta ve stabiliteye sahip ekstraktların hazırlanması için tekrarlanabilir bir platform sağlar.
- Kantitatif Çıktılar: Zaman ayarlı (time-lapse) parlak alan ve floresan görüntüleme yoluyla sitoplazmik dinamiklerin ve uzaysal organizasyonun ölçülmesine olanak tanır.
- Tarama Hazırlığı: Bileşik etkilerinin değerlendirilmesi için geniş alan ve konfokal mikroskopi ile uyumlu, ölçeklenebilir ve düşük maliyetli bir sistem sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: Hücresel bölünme ve organizasyonla ilgili korunmuş sitoplazmik süreçlerin incelenmesi için mekanistik bir model görevi görür.
- Öngörü Güveni: Ekstraktın kendi kendine organizasyonunun doğrudan görselleştirilmesi yoluyla, hücre iskeleti regülasyonu ve uzaysal desen oluşumunda rol oynayan hedeflerin risklerinin azaltılmasını destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Tutarlı ve görüntülemeye hazır bir sitoplazmik model oluşturarak, keşif aşamasındaki gözlemler ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; erken hedef hipotez testlerinden assay geliştirmeye ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürecine, özellikle de hücre iskeleti dinamiklerini ve hücre altı organizasyonunu etkileyen hedefler için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: İnterfaz ekstraktlarında mikrotübül ve mitokondriyal dinamiklerin doğrudan görselleştirilmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Kimyasal yüzey işlemleri gerektirmeksizin, standartlaştırılmış ekstrakt hazırlama ve stabil görüntüleme koşulları aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Sitoplazmik organizasyon hakkında kantitatif uzamsal ve zamansal veriler üreterek farklı koşullar arasında karşılaştırmalı analize imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş hücresel organizasyon süreçlerini incelemek için tutarlı bir model sunarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef ve tarama kampanyasına uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir ve düşük maliyetli bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sitoplazmik organizasyon çalışmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış ekstrakt hazırlama ve FEP bant tabanlı yüzey pasivasyonu yoluyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Sitoplazmik dinamikler üzerindeki fenotipik etkilerin erken görselleştirilmesini sağlayarak karar süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hücresel organizasyonu etkileyen bileşiklere ilişkin mekanistik içgörüler sunarak riskten arındırılmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Xenopus yumurta işlemleri, ekstrakt hazırlama ve canlı görüntüleme teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Santrifüjlere, mikroskopi sistemlerine (geniş alan/konfokal), FEP yapışkan bantlara ve görüntüleme ara parçalarına erişime bağlıdır.
- Yumurta yıkama, jel temizleme ve ekstrakt geri kazanım protokollerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- 3D görüntülemeye uyarlanması, ışık levhası mikroskopisi ile entegrasyonu ve örnek kalınlığı kontrolünün optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında yumurta kalitesine olan hassasiyet ve ekstrakt tutarlılığını sağlamak için hazırlık sırasında anormal yumurtaların ayıklanması gerekliliği yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
