Name: Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, Xenopus laevis yumurta ekstrelerinde sitoplazmik dinamikleri canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücresel örgütlenme ve kendiliğinden oluşan uzamsal desenleri incelemek için maliyet etkin bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Kamenz, Y. Chen ve W. Y. C. Huang'a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, James E. Ferrell, Jr.'a verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 GM110564, P50 GM107615 ve R35 GM131792) gelen hibelerle desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Slaytların ve kapak fişlerinin hazırlanması
<ol><li>Bir rulo aplikatörlü cam slayta bir florlu etilen propilen (FEP) yapışkan bant tabakası uygulayın. Kenarlardaki aşırı bandı temiz bir tıraş bıçağı ile kesin. FEP bant kaplı kapak fişlerini de aynı şekilde hazırlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>Kızağın FEP bant kaplı tarafına çift taraflı yapışkan görüntüleme ara parçası uygulayın. Üstteki koruyucu astarı soyulmadan bırakın (Şekil 1A). NOT: Slaytlar ve kapak fişleri deneyden önce hazırlanmalıdır. Hemen kullanılabilir veya yüzeylerde toz birikmesini önlemek için kutularda saklanabilirler. Görüntüleme ara parçasındaki kuyu 120 μm derinliğindedir ve 9 mm çapındadır.</li>
</ol>2. İnterfaz tutuklu yumurta ekstraktlarının hazırlanması ve canlı görüntülenmesi
NOT: Aşağıdaki protokol Deming ve Kornbluth19, Murray20 ve Smythe ve Newport25'ten değişikliklerle uyarlanmıştır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
<ol><li>Yumurta toplamadan üç ila on gün önce, olgun dişi Xenopus laevis kurbağalarını deri altından dorsal lenf kesesine 100 IU hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) ile enjekte edin.</li>
	<li>Planlanan yumurta toplamadan on altı ila on sekiz saat önce, kurbağalara adım 2.1'den itibaren 500 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte edin. Kurbağaları yumurtlama tamponunda (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl2·2H 2 O,0.5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA) 18 °C'de bırakın, yumurta toplanana kadar pH7.4'te 20x stok çözeltisi olarak hazırlayın ve kullanımdan önce temiz kurbağa tankı suyuyla 1x'e kadar seyreltin).</li>
	<li>Deney gününde, yumurtaları büyük bir cam Petri kabında toplayın ve yumurta kalitesini değerlendirin. Beyaz kabarık toplara benzeyen veya bir dizede görünen yumurtaları atın (Şekil 1B). Yumurtaları bir stereoskop altında inceleyin, yumurtaları normal görünümde tutun (Şekil 1C) ve düzensiz veya benekli pigmentli olanları atın (Şekil 1D). NOT: Bu protokol, tipik olarak hCG enjeksiyonundan 16 saat sonra 25 mL yumurta bırakan tek bir kurbağadan toplanan yumurtalarla çalışır. Genellikle, toplam 3 ila 6 kurbağa hCG tarafından indüklenir ve ekstrakt hazırlama deneyi için en yüksek yumurta kalitesine sahip kurbağa seçilir.</li>
	<li>Yumurtaları 400 mL'lik bir cam behere aktarın ve dekantasyon yaparak mümkün olduğunca fazla yumurtlama tamponunu çıkarın.</li>
	<li>Yumurtaları 100 mL taze hazırlanmış jöle çözücü çözelti içinde (suda% 2 w / v L-sistein, NaOH ile pH 8.0'a ayarlayın) inkübe edin ve periyodik olarak hafifçe döndürün. Yaklaşık 3 dakika sonra, çözeltiyi dökün ve 100 mL taze jöle çözeltisi ekleyin. Yumurtalar sıkıca paketlenene kadar inkübasyona devam edin (yumurtalar arasında boşluk yoktur), ancak yumurtaları jöle çözeltisinde toplam 5 dakikadan fazla bırakmaktan kaçının.</li>
	<li>Dekantasyon yaparak jelleştirici çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve tamponu ekleyerek yumurtaları 0,25x MMR tamponunda (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, 10x stok çözeltisi olarak hazırlanmış, NaOH ile pH 7,8'e ayarlanmış ve kullanımdan önce Milli-Q suda seyreltilmiş) yıkayın, yumurtaları döndürün ve sonra tamponu dökün. Yıkamalar için toplam 1 L tampon kullanılıncaya kadar birkaç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Yumurtaları toplam 400 mL yumurta lizis tamponu ile birkaç kez yıkayın (250 mM sakaroz, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, taze yapılmış ve KOH ile pH 7,7'ye ayarlanmış). Yıkamalar arasında bir Pasteur pipet kullanarak anormal görünümlü yumurtaları çıkarın. NOT: Anormal görünüme sahip yumurtalar, beyaz kabarık toplara benzeyen (Şekil 1B), benekli pigmentasyona sahip (Şekil 1D), büyüyen beyaz bir bölgeyle bozulan (Şekil 1E) veya hayvan yarımküresinde koyulaşmış ve daralmış pigmentli alan gösterenleri ifade eder (Şekil 1F).</li>
	<li>Ucu tamamen açık kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak, yumurtaları 1 mL yumurta lizis tamponu içeren 17 mL'lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Yumurtaları paketlemek için tüpü 400 x g'de klinik bir santrifüjde 15 saniye boyunca döndürün.</li>
	<li>Bir Pasteur pipeti kullanarak paketlenmiş yumurtaların üstünden yumurta lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. NOT: Yumurta ekstraktının seyreltilmesini en aza indirmek için paketlenmiş yumurtalardan mümkün olduğunca fazla tampon çıkarmak önemlidir. Bazen bunu başarmak için artık tamponla birlikte bazı gevşek yumurtaların çıkarılması gerekir.</li>
	<li>Paketlenmiş yumurtaların yaklaşık hacmini belirleyin ve ardından doğrudan paketlenmiş yumurtaların üzerine 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin, 5 μg / mL sitokalkasin B ve 50 μg / mL sikloheksimid ekleyin. NOT: Aprotinin ve löpeptin proteaz inhibitörleridir. Sitokalasin B, aktin polimerizasyonunu inhibe ederek ekstraktın büzülmesini ve jelleşmesini önler26. Sikloheksimid, protein sentezini inhibe eder, böylece ekstraktı hücre döngüsünün interfazında tutar.</li>
	<li>Tüpü 12.000 x g, 4 ° C'de, sallanan bir kova rotorunda 15 dakika boyunca santrifüj ederek yumurtaları ezin. NOT: Santrifüjlemenin sonunda, yumurtalar yırtılmış ve lizat üç ana tabakaya ayrılmış olmalıdır: üstte sarı bir lipit tabakası, ortada sitoplazmik ekstrakt (ham ekstrakt olarak da adlandırılır) ve altta pigment granüllerini içeren koyu yoğun bir tabaka (Şekil 1G).</li>
	<li>Bir şırıngaya 18 gauge iğne takın. İğne ucu eğimi yukarı bakacak şekilde, tüpü sitoplazmik tabakanın altındaki taraftan delin ve yavaşça çizerek ekstraktı geri kazanın. NOT: Sarı lipit tabakasından kirletici içeriğin dahil edilmesini önlemek için sitoplazmik ekstraktı yavaşça çekin.</li>
	<li>Geri kazanılan sitoplazmik ekstraktı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun. Özü 1 saat içinde kullanın.</li>
	<li>Görüntülemeye hazır olduğunda, ekstraktı istenen reaktifler ve floresan görüntüleme probları ile destekleyin. NOT: Floresan görüntüleme probları, bir floresan mikroskobu ile görselleştirilebilmeleri için spesifik sitoplazmik yapıları etiketler.</li>
	<li>Üst koruyucu astarı, adım 1.2'de hazırlanan slayt üzerindeki görüntüleme aralayıcısından çıkarın ve kuyunun ortasına yaklaşık 7 μL ekstrakt biriktirin. Kuyuyu kapatmak için FEP bant kaplı kapak kapağını, FEP tarafı ekstrakta bakacak şekilde derhal uygulayın. Hızlı bir şekilde görüntülemeye geçin (Şekil 1H,I).</li>
	<li>Slaytı, motorlu bir sahne ve dijital kamera ile ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop üzerine ayarlayın. Ekstraktları hem parlak alan hem de floresan kanallarında istenen uzamsal konumlarda ve zaman aralıklarında görüntüleyin. NOT: Genellikle, görüntüleme için 5x hedefi kullanılır. Motorlu aşama, birden fazla tanımlanmış uzamsal konumda otomatik görüntü yakalama sağlar. Parlak alan mikroskobu, sitoplazmik yapıları farklı derecelerde şeffaflıkla görselleştirir. Floresan mikroskobu, adım 2.14'te eklenen floresan görüntüleme probları tarafından özel olarak etiketlenmiş sitoplazmik yapıları görselleştirir. Kamera bu yapıların hızlandırılmış görüntülerini kaydeder, böylece sitoplazmik organizasyonun dinamiklerini yakalar.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Xenopus laevis yumurta ekstreleri, çeşitli hücre altı yapıların 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 ve bir bütün olarak sitoplazmik organizasyonun görüntülenmesine dayalı çalışmalar için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır....

Sitoplazma, bir hücrenin ana hacmini oluşturur ve ayrı bir organizasyona sahiptir. Ökaryotik sitoplazmanın bileşenleri, mikrotübül asterleri ve Golgi aparatı gibi çok çeşitli mekansal yapılara kendiliğinden toplanabilir ve bunlar da hücrenin kimliğine ve fizyolojik durumuna bağlı olarak dinamik olarak düzenlenir ve döndürülür. Sitoplazmanın mekansal organizasyonunu ve hücresel fonksiyonlara olan bağlantısını anlamak, hücrenin nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Xenopus laevis yumurta ekstraktları geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8, ancak son çalışmalar onları sitoplazmik yapıların mekanik çalışmaları ve hücresel fonksiyonları için güçlü bir canlı görüntüleme sistemi olarak kurmaktadır 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Bu seyreltilmemiş ekstraktlar, sitoplazmanın birçok yapısını ve fonksiyonunu korurken, geleneksel hücre bazlı modellerde elde edilemeyen sitoplazmik içeriğin doğrudan manipülasyonlarına izin verir19,20. Bu, onları sitoplazmik fenomenleri karakterize etmek ve mekanik temellerini incelemek için ideal kılar.
Ekstraktları görüntülemek için mevcut yöntemler, kimyasal yüzey modifikasyonları veya mikroakışkan cihazların üretilmesini gerektirir. Bir coverslip bazlı yöntem, cam kapakların polietilen glikol (PEG) pasivasyonunu gerektirir21. Mikroemülsiyon bazlı bir yöntem, trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silanın cam yüzeylerde buhar birikimini gerektirir22,23. Mikroakışkan tabanlı sistemler, ekstrakt damlacıklarının hacminin, geometrisinin ve bileşiminin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, ancak özel mikrofabrikasyon tesisleri gerektirir11,12,24.
Burada, yumurta ekstraktlarını görüntülemek için uygulaması kolay ve kolayca temin edilebilen, düşük maliyetli malzemeler kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Bu, bir slayt ve florlu etilen propilen (FEP) bant ile kaplanmış bir kapak kapağı ile bir görüntüleme odasının hazırlanmasını içerir. Oda, stereoskoplar ve dik ve ters mikroskoplar dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi sistemleriyle ekstraktları görüntülemek için kullanılabilir. Bu yöntem, yukarıda tartışılan mevcut cam bazlı yöntemlerle elde edilen benzer optik netliği elde ederken yüzeylerin kimyasal olarak işlenmesini gerektirmez. Bir 2B alan boyunca eşit kalınlığa sahip bir ekstrakt katmanını görüntülemek için tasarlanmıştır ve 3B ekstrakt hacmini görüntülemek için kolayca genişletilebilir. Geniş bir görüş alanı üzerinde kolektif sitoplazmik davranışın hızlandırılmış görüntülenmesi için çok uygundur.
Görüntüleme yöntemimizi göstermek için interfaz tutuklamalı yumurta ekstraktları kullandık. Ekstrakt preparatı, Deming ve Kornbluth19 protokolünü takip eder. Kısacası, mayoz II'nin metafazında doğal olarak tutuklanan yumurtalar, düşük hızlı bir spin ile ezilir. Bu spin, sitoplazmayı mayotik arrestten serbest bırakır ve ekstraktın interfaza geçmesine izin verir. Normalde, F-aktin oluşumunu inhibe etmek için ezme spininden önce sitokalasin B eklenir. Bununla birlikte, F-aktin isteniyorsa atlanabilir. Sikloheksimid, interfaz ekstraktının bir sonraki mitoza girmesini önlemek için ezme spininden önce de eklenir. Ekstraktlar daha sonra yukarıda belirtilen görüntüleme odalarına yerleştirilir ve mikroskop üzerine yerleştirilir. Son olarak, görüntüler mikroskopa bağlı bir kamera tarafından belirli aralıklarla zaman içinde kaydedilir ve 2D alanda ekstraktın dinamik davranışını yakalayan hızlandırılmış görüntü serileri üretir.

<table><tbody><tr><td>17 ml santrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm kare # 1 kapak camı</td><td>Corning</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>MilliporeSigma</td><td>10236624001</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>MilliporeSigma</td><td>01810</td><td>Protein sentezi inhibitörü</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>MilliporeSigma</td><td>C6762</td><td>Aktin polimerizasyon inhibitörü</td></tr><tr><td>Dişi Xenopus laevis kurbağaları</td><td>Nasco</td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Floresan HiLyte 488 etiketli tübulin proteini</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>Mikrotübül hücre iskeletini görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Floresan HiLyte 647 etiketli tübülin proteini</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>Mikrotübül hücre iskeletini görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Florlu etilen propilen (FEP) optik olarak şeffaf bant</td><td>CS Hyde şirketi</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>İnsan koryonik gonadotropin (hCG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme ara parçası</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>MilliporeSigma</td><td>11017101001</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>MilliporeSigma</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Kırmızı CMXRos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7512</td><td>Mitokondriyi görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Hamile kısrak serumu gonadotropin (PMSG)</td><td>BioVendor</td><td>RP1782725000</td><td></td></tr><tr><td>Rulo aplikatörü</td><td>Amazon</td><td>B07HMBJSP8</td><td>FEP bandını cam slaytlara ve lamellere uygulamak için</td></tr><tr><td>Tek kenarlı tıraş bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Aşırı FEP bandını çıkarmak için</td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis dinamik sitoplazmik organizasyonu görselleştirmek için yumurta ekstresi hazırlama ve canlı görüntüleme yöntemleri

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılan Xenopus laevis yumurta ekstraktları, sitokinezi, mitotik iğ oluşumu ve çekirdeğin montajı gibi sitoplazmik fenomenleri incelemek için güçlü bir görüntüleme tabanlı araç olarak ortaya çıkmıştır. Seyrek zaman noktalarında örneklenen sabit ekstraktları görüntüleyen erken yöntemlere dayanarak, son yaklaşımlar hızlandırılmış mikroskopi kullanarak canlı ekstraktları görüntüleyerek gelişmiş zamansal çözünürlükle daha dinamik özellikler ortaya çıkarır. Bu yöntemler genellikle görüntüleme kabının sofistike yüzey işlemlerini gerektirir. Burada, kimyasal yüzey işlemi gerektirmeyen yumurta ekstraktlarının canlı görüntülenmesi için alternatif bir yöntem sunuyoruz. Uygulanması kolaydır ve görüntüleme için seri üretilen laboratuvar sarf malzemelerini kullanır. Hem geniş alan hem de konfokal mikroskopi için kullanılabilecek bir sistemi tanımlıyoruz. 2 boyutlu (2D) bir alanda ekstraktları görüntülemek için tasarlanmıştır, ancak 3D'de görüntülemeye kolayca genişletilebilir. Sitoplazma içindeki mekansal desen oluşumunu incelemek için çok uygundur. Temsili verilerle, bu yöntem kullanılarak hazırlanan interfaz ekstraktlarında mikrotübüllerin, çekirdeklerin ve mitokondrilerin tipik dinamik organizasyonunu gösteriyoruz. Bu görüntü verileri, sitoplazmik dinamikler ve mekansal organizasyon hakkında nicel bilgiler sağlayabilir.

Xenopus laevis yumurta ekstreleri, interfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Şekil 2A, başarılı bir deneyin sonuçlarını göstermektedir. İnterfaz çekirdeklerinin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için fazlar arası tutuklanmış ekstraktları, fazlar arası çekirdeklerin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için 27 çekirdek / μL ve 0.38 μM saflaştırıl...

Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.

Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Bu yöntem, kurbağa yumurtası ekstraktları kullanılarak sitoplazmik dinamiklerin canlı görüntülenmesi için uygundur ve sitoplazmadaki mekansal desen bilgisinin incelenmesini sağlar. Numuneler, düzgün ve ayarlanabilir kalınlığa sahip bir katman halinde şekillendirilebilir ve bir 2B alan veya 3B hacim boyunca görüntülenebilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve uygulanması kolaydır.Bir rulo aplikatörlü bir cam slayda bir FEP yapışkan bant tabakası uygulayarak başlayın. Kenarlardaki aşırı bandı temiz bir tıraş bıçağı ile kesin. Ardından, FEP bant kaplı kapak fişlerini aynı şekilde hazırlayın.Ardından, kızağın FEP bant kaplı tarafına çift taraflı yapışkan bir görüntüleme aralayıcısı uygulayın ve koruyucu astarı soyulmadan bırakın. Yumurtaları 400 mililitrelik bir cam behere aktarın ve dekantasyon yaparak mümkün olduğunca fazla yumurtlama tamponunu çıkarın. Daha sonra yumurtaları 100 mililitre taze hazırlanmış dejelleme çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın ve yavaşça döndürün.Yaklaşık üç dakika sonra, çözeltiyi dökün ve 100 mililitre taze jelleşme çözeltisi ekleyin. Yumurtalar sıkıca paketlenene kadar inkübasyona devam edin, ancak yumurtaları jöle çözeltisinde toplam beş dakikadan fazla bırakmaktan kaçının. Kuluçkadan sonra, jelleştirici çözeltiyi mümkün olduğunca çıkarın ve yumurtaları 0.25x MMR tamponunda yıkayın.Yumurtaları döndürün, sonra tamponu dökün. Yıkamalar için toplam bir litre tampon kullanılıncaya kadar birkaç kez tekrarlayın. Daha sonra, yumurtaları birkaç kez toplam 400 mililitre yumurta lizis tamponu ile yıkayın, yıkamalar arasında anormal yumurtaları çıkarın.Ardından, yumurtaları bir mililitre yumurta lizis tamponu içeren 17 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarmak için geniş kesim uçlu bir transfer pipeti kullanın. Yumurtaları paketlemek için tüpü 400 g'da klinik bir santrifüjde 15 saniye boyunca döndürün. Daha sonra bir Pasteur pipeti kullanarak yumurta lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.Paketlenmiş yumurtaların yaklaşık hacmini belirleyin. daha sonra aprotinin, leupeptin ve cytochalasin B'nin her birine mililitre başına beş mikrogram ve doğrudan paketlenmiş yumurtaların üzerine mililitre sikloheksamidin başına 50 mikrogram ekleyin. Sallanan bir kova rotorunda tüpü 12.000 g ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca merkezleyerek yumurtaları ezin.Ardından, bir şırıngaya 18 gauge iğne takın. İğne ucu eğimi yukarı bakacak şekilde tüpü sitoplazmik tabakanın altındaki taraftan delin ve yavaşça çizerek ekstraktı geri kazanın. Geri kazanılan sitoplazmik ekstraktı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun.Görüntülemeye hazır olduğunda, ekstraktı istenen reaktifler ve floresan görüntüleme probları ile destekleyin. Üst koruyucu astarı hazırlanan slayt üzerindeki görüntüleme aralayıcısından çıkarın ve kuyunun ortasına yaklaşık yedi mikrolitre ekstrakt biriktirin. Kuyuyu kapatmak ve hızlı bir şekilde görüntülemeye devam etmek için FEP bant kaplı kapak kaymasını derhal FEP tarafı ekstrakta bakacak şekilde uygulayın.Slaytı, motorlu bir sahne ve dijital kamera ile ters çevrilmiş veya dik bir mikroskop üzerine ayarlayın. Ekstraktları hem parlak alan hem de floresan kanallarındaki zaman aralıklarında istenen uzamsal konumlarda görüntüleyin. İnterfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için xenopus laevis yumurta ekstraktlarını kullanan hızlandırılmış bir deney burada gösterilmiştir.Oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakikalık inkübasyondan sonra, ışık saçılan sitoplazmik bileşenlerin tükendiği alanlar hem parlak alanda hem de mitokondri kanallarında görülebiliyordu. Oda sıcaklığında yaklaşık 60 dakika boyunca, hücre benzeri bölmelerden oluşan mekansal bir desen, içi boş çelenk benzeri bir yapı oluşturan mikrotübüller ve her bölmeye açıkça yerleştirilmiş mitokondri ile iyi bir şekilde kurulmalıdır. Cam üzerinde FEP bantları olan ve olmayan görüntüleme odalarındaki ekstrakt performansının karşılaştırılması burada gösterilmiştir.FEP bantlı camdan yapılmış odada, ekstrakt normal hücre benzeri desenlere kendi kendini organize etti. Cam yüzeylerin FEP bandı ile kaplanmadığı odada, ekstrakt zamanla giderek daha fazla bozulan anormal parlak alan ve mikrotübül desenleri gösterdi. GST-mCherry-NLS proteininin nükleer ithalatında anlamlı bir fark gözlenmedi.Hatırlanması gereken önemli şeyler, cam yüzeyleri FEP bant ile pasifleştirmek ve ekstrakt hazırlama sırasında tüm kötü yumurtaları çıkarmaktır. Bu sistemle, ekstrakt numunesinin kalınlığını kolayca kontrol edebilir, ışık tabakası mikroskobu kullanarak sitoplazmik kalıpları 3D olarak görüntülemenin yolunu açabiliriz.

xenopus-laevis-egg-extract-preparation-live-imaging-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ham ve fraksiyone Xenopus yumurta özleri, morfolojik ve biyokimyasal analiz için hücresel süreçleri yeniden maddeler sağlamak için kullanılabilir. Yumurta parçalama ve diferansiyel santrifüj teslim fraksiyone özü ve hafif membran preparatları hazırlamak için kullanılan ham elde etmek için kullanılır.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Xenopus embriyonik ektoderm hücre polarite çalışmaları için cazip bir model haline gelmiştir. Bir tahlil floresan proteinlerin hücre içi dağıtım ektoderm hücreler değerlendirilir olduğu açıklanmıştır. Bu protokol adresi sorular sinyal mekansal kontrolü ile ilgili yardımcı olacaktır.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Hücresel ve hücre içi ölçekleme mekanizmaları hala belirsizliğini koruyor. Xenopus embriyo ekstraktlarının kullanımı, organel boyutu düzenleme mekanizmalarını aydınlatmak için giderek daha yaygın hale gelmiştir. Bu yöntem, embriyo ekstraktının hazırlanmasını ve nükleer boyut düzenleme mekanizmalarının tanımlanabildiği yeni bir nükleer ölçekleme testini tanımlar.

Kullanılarak hücresiz Deneyi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyo Nükleer Boyut Yönetmeliğin Mekanizmaları Eğitim için ayıklar

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Xenopus laevis embriyolarından izole edilmiş derin ektoderm hücrelerinden mukozisel epitel organoidleri geliştirmek için basit bir protokol uyguluyoruz. Çok güçlü atalar epitel goblet hücre öncüllerini yeniler ler ve organoidlerin yüzeyinde hücre geçişlerinin başlatılmasıve ilerlemesinicanlı olarak izlemesağlarlar.

Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, Xenopus laevis yumurta ekstrelerinde sitoplazmik dinamikleri canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücresel örgütlenme ve kendiliğinden oluşan uzamsal desenleri incelemek için maliyet etkin bir sistem sunar.

Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal

Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet