Name: Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin, 3T3-L1 adipositlerinde ters transfeksiyon ile protein ve mikro-RNA modülasyonunu. Bu yöntem, insülin sinyalizasyonu ve glukoz alımı üzerinde fonksiyonel deneyler için yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma INSERM, Université Côte d'Azur ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından gelecekteki Mükemmellik Laboratuvarı yatırımları (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ve Mükemmellik Girişimi (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) programı aracılığıyla desteklenmiştir. J.J., Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) ve Fondation Benjamin-Delessert'in bağışlarıyla desteklenmektedir. J.G. ANR-18-CE14-0035-01 tarafından desteklenir. J-F.T., ANR hibesi ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ve Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes tarafından finanse edilen C3M Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve CBS IBiSA Mikroskopi ve Görüntüleme Platformu Côte d'Azur (MICA) tarafından da desteklenen Région PACA'ya teşekkür ediyoruz.

NOT: Protokolün tüm adımlarını laminer akış hücresi kültür başlığında gerçekleştirmek için steril teknikler kullanın. Tüm reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'nu görün.
1. Murine 3T3-L1 fibroblastlarının adipositlere farklılaştırılması
<ol><li>3T3-L1 fibroblastlarını kültür orta-DMEM'de 100 mm'lik yemeklerde piruvatsız, 25 mM glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisinin yetiştirin (Şekil 1A). Bulaşıkları bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin (%7 CO2 ve 37 °C).</li>
	<li>Birleşmesinden iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, piruvatsız DMEM ile değiştirin, 25 mM glikoz, %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 penisilin ve streptomisin 0.25 mM 3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX), 0.25 μM deksametason, 5 μg/mL insülin ve 10 μM rosiglitazone ile desteklenmiştir. NOT: Hücreler 100 mm çanak başına 300.000 hücrede tohumlandığında izdiah süresine ulaşmak 5 gün sürer.</li>
	<li>İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve 5 μg / mL insülin ve 10 μM rosiglitazon ile desteklenmiş% 1 penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Daha sonra, hücreleri her 2 günde bir DMEM ile piruvatsız, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin (Şekil 1B).</li>
	<li>3T3-L1 adipositlerini farklılaşma protokolünün başlangıcından 7-8 gün sonra transfect. NOT: Transfeksiyondan sonra kalan fibroblastların çoğalmasını önlemek için transfeksiyondan önce yüksek bir farklılaşma seviyesine (%>80) ulaşmak önemlidir, bu da sonuçları önyargılı hale getirecek karışık bir hücre popülasyonu sağlar.</li>
</ol>2. Ön kaplamalı plakaların hazırlanması
<ol><li>Transfeksiyondan bir gün önce veya birkaç saat önce, 1 mg / mL'deki bir stok çözeltisinden% 30 etanolde 100 μg / mL'de bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 μL ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 μL ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.</li>
	<li>Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Dulbecco'nun fosfat tamponlu saliniyle (D-PBS) iki kez yıkayın. NOT: Önceden kaplanmış plakalar satın alınabilir.</li>
</ol>3. Transfeksiyon karışımının hazırlanması
NOT: SiRNA'nın son konsantrasyonu 1 ila 100 nM arasındadır (12 kuyu plakasının kuyusu başına 1 ila 100 pmol siRNA). MiR mimikinin son konsantrasyonu 10 nM'dir (10 pmol/well). Hedef dışı etkileri önlemek için deneye başlamadan önce her bir siRNA, miR mimik veya diğer oligonükleotidlerin en iyi konsantrasyonunu belirleyin. Sonuçların istatistiksel analizini kolaylaştırmak için üç taraflı transfeksiyon deneyleri yapın. Pipetleme sırasında normal kaybı hesaba katmak için tüm reaktifleri fazla olarak hazırlayın.
<ol><li>SiRNA'yı (veya diğer oligonükleotidleri) geliştirilmiş Minimal Essential Medium(Tablo 1)ile pipetleme (hacim/hacim) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipet ekleyin (Tablo 1). Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır (bu süre zarfında bölüm 4'e geçin). Kollajen kaplı plakanın her kuyusuna transfeksiyon karışımını ekleyin.</li>
</ol>4. 3T3-L1 adipositlerin hazırlanması
<ol><li>100 mm Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin (100 mm çanak başına 1 mL), tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 s bekleyin ve trypsin'i dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için 100 mm'lik çanağa dokunun.</li>
	<li>Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 ml DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı borun.</li>
	<li>Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu 6,25 x 105 hücre /mL orta olarak ayarlayın. Transfeksiyon karışımını içeren 12 kuyulu bir plakanın (5 x 105 hücre) hücre süspansiyonunun/kuyusunun 800 μL'si veya 24 kuyulu bir plakanın (2,5 x 105 hücre) 400 μl'si. NOT: Bir adet 100 mm'lik Petri adipozit kabı, bir adet 12 kuyu plakasının veya bir adet 24 kuyu plakasının hazırlanmasına izin verecektir. 100 mm'lik bir tabak genellikle 12 kuyu plakasının kuyusu başına 5 x 10 5 adipositlere karşılık gelen6-7 x 106 adiposit içerir.</li>
	<li>Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe (%7 CO2 ve 37 °C) kuluçkaya yatırın ve hücreleri 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvatsız taze DMEM, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin ile dikkatlice değiştirin. NOT: Hücreleri kollajen ön kaplamalı 48 ve 96 kuyu plakalarına tohumlamak da mümkündür, ancak adipositlerin kopmasını önlemek için ortamı değiştirirken daha fazla önlem alın.</li>
</ol>5. Transfected 3T3-L1 adipositlerin fonksiyonel analizi
<ol><li>MRNA ve protein için siRNA veya miR mimik doğumundan sonra sırasıyla 24-48 saat ve 48-96 saat çalışma hedefi nakavt.</li>
	<li>İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez incelemek için transfected adipositlerin fonksiyonel analizlerini gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA'lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA'lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre hattı da dahil olmak üzere murin h...

Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar1dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR'lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Birçok araştırma çalışması protein kodlayan RNA'ların adiposit fizyolojislerindeki rolünü ve obezite ile ilişkisini araştırmıştır.
Daha yakın zamanlarda, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), özellikle mikro RNA'ların (MIR'ler) keşfi, gen ekspresyon programlarının düzenleme mekanizmasıyla ilgili yeni kavramlar ortaya çıkarmıştır. Çalışmalar, ncRNA'ların adiposit fonksiyonunun önemli düzenleyicileri olduğunu ve düzensizliklerinin metabolik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını göstermiştir4. Bu nedenle, adipositlerdeki proteinlerin ve ncRNA'ların manipülasyonu, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve T2D gibi patolojiler üzerindeki etkilerini çözmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, in vivo proteinlerin ve ncRNA'ların yanı sıra birincil adipozitlerde ekspresyonunun manipüle edilmesi, in vitro adiposit modellerinin kullanımını destekleyen son derece zorlu olmaya devam etmektedir.
Murine 3T3-L1 fibroblastları, adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılan iyi karakterize edilmiş bir hücre hattı olan olgun, fonksiyonel ve insülin duyarlı adipositlere kolayca farklılaşır (örneğin, insülin sinyali, glikoz alımı, lipoliz ve adipokines salgısı)5,6,7,8,9,10. Bu özellikler, 3T3-L1 adipositlerini, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerini çözmek için protein kodlama ve nc-RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için çekici bir model haline getirir. Ne yazık ki, 3T3-L1 fibroblastların ticari olarak mevcut reaktifler kullanılarak transfect'i kolayken, farklılaştırılmış 3T3-L1 adipositler transfect için en zor hücre çizgilerinden biridir. Bu nedenle 3T3-L1 hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle eden çok sayıda çalışma, adiposit fonksiyonu yerine adiposit farklılaşmasına odaklanmıştır.
Uzun bir süre boyunca, adipositleri transfect etmek için tek etkili teknik elektroporasyon5, sıkıcı, pahalı ve hücre hasarına neden olabilir. Bu makale, transfeksiyon için uygulamalı zamanı azaltan, hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan ve elektroporasyondan çok daha ucuz olan ortak bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ters transfeksiyon tekniğini rapor eder. Bu protokol, siRNA ve mikro-RNA mimikleri (miR mimikleri) ve anti-miR'ler gibi diğer oligonükleotidlerin transfeksiyonu için mükemmel bir şekilde uygundur. Ters transfeksiyon protokolünün prensibi, transfeksiyon reaktifini ve oligonükleotidleri kuluçkaya yatırarak hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak ve daha sonra olgun adipositleri kuyulara tohumlamaktır. Daha sonra, adipositler oligonükleotidler / transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden yapışır. Bu basit, verimli ve ucuz metodoloji, protein kodlayan RNA'ların ve MIR'lerin adiposit fonksiyonundaki rolünün ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerinin incelenmesine izin vermektedir.

<table><tbody><tr><td>12 kuyulu Doku Kültürü Plakası</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>%2.5 Tripsin (10x)</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td>, D-PBS 2-Propanol Sigma I9516 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> ile 5x'e seyreltilmiş <tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Hedeflemeyen Havuz</td><td>Horizon Keşfi</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Baldır derisinden kollajen tip I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Modifiye Eagles'ın Orta (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4.5 g/L D-Glikoz; L-Glutamin; Piruvat</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FAM etiketli Negatif Kontrol si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Serbest Gliserol Reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol Standart</td><td>Çözelti Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Seyreltme: 0.5 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin, İnsan Rekombinant</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN mikro-RNA,</td><td>Horizon Discovery'yi</td><td></td><td></td>taklit eder</tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit,</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II, RT Kiti</td>, <td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Tahliller Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Tahliller Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Yeşil PCR Kiti</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızısı O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Fare Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Keşif</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin-1 antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3470</td><td>Seyreltme : 1/1000</td></tr><tr><td>Petri kabı 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9272</td><td>Seyreltme : 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Fosfo Thr308 antikor</td><td>Hücresi Sinyalizasyon</td><td>9275</td><td>Seyreltme: 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulin antikoru</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Seyreltme: 0.5 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB5136</td><td>Seyreltme : 0.1 & mikro; g/mL</td></tr></tbody></table>

protein ve mikro-rna modülasyonunun adipozit İşlevi Üzerindeki etkisini incelemek için bir adiposit hücre kültürü modeli

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.

3T3-L1 adipositlerdeki proteinlerin veya mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için burada açıklanan ters transfeksiyon prosedürünü kullanarak, adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir (Şekil 1B,C). Gerçekten de, transfeksiyondan 2 gün sonra, adipositler iyi yayılmış ve plakaya tutturulmuş ve olgun 3T3-L1 adipositlerin bir özelliği olan çok damarlı lipit damlacıkları sunulmuştur. Lipid içeriği trans...

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Bu protokol, adipositler işlevindeki rollerini incelemek için proteinleri veya mikroRNA ekspresyonunu farklılaştırılmış adipositlerde manipüle etmeyi mümkün kılar. Bu ters transfeksiyon yöntemi, oligonükleotidleri fare 3T3-L1 adipositlerine geçirmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntem, adipositlere farklılaştırılmış insan preadipositlerine de uygulanabilir.Prosedürü gösteren melanie Gaudfrin, laboratuvarımızdan bir teknisyen. 3T3-L1 fibroblastlarını DMEM'de 100 milimetrelik yemeklerde piruvat, 25 milimolar glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan yetiştirin. Bulaşıkları 37 santigrat derecede ve yüzde yedi karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bir araya geldikten iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, yerine piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz, % 10 FCS ve 0,25 milimoler IBMX, 0,25 mikromoler deksametazon, milimetre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazone ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin kullanın. Bulaşıkları iki gün kuluçkaya yatır. İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve mililitre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazon ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve iki gün daha kuluçkaya yatırın.Hücreleri her iki günde bir dmem ile piruvatsız, 25 milimolar glikoz, %10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin ve hücreleri inkübatörde tutun. Transfeksiyondan bir gün veya birkaç saat önce, mililitre başına bir miligramda bir stok çözeltisinden% 30 etanolde mililitre başına 100 mikrogramda bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 mikrolitre kollajen veya 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 mikrolitre ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Daha sonra D-PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için geliştirilmiş minimum esansiyel ortama sahip siRNA pipeti.Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş minimal esansiyel ortamı karıştırmak için siRNA ve pipete ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her kuyusuna ekleyin.100 milimetre Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin, tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsinleri dikkatlice çıkarın.Petri kabını inkübatörde 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika kuluçkaya bırakın. Ardından hücreleri ayırmak için çanağa dokunun ve hücre hasarını önlayın. Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 mililitre DMEM, 25 milimolar glikoz, % 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisin ekleyin.Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı boruya takın. Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu mililitre orta başına 0.625 milyon hücreye ayarlayın. 12 kuyulu bir plakanın kuyusu başına hücre süspansiyonunun 800 mikrolitresini veya transfeksiyon karışımını içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 400 mikrolitre hücre süspansiyonunu tohumlayın.Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvat, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan taze DMEM ile dikkatlice değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri verin. SiRNA veya miR teslimatından sonra hedef devirmeyi tespit etmek için tipik zaman noktaları mRNA için 24 ila 48 saat ve protein için 48 ila 96 saattir.İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez dahil olmak üzere transfected adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapılabilir. Adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, adipositler transfected ve transfected olmayan adipositler arasında farklı olmayan lipid içeriğine sahip çok damarlı lipit damlacıkları sundular.Çeşitli farklılaşma belirteçlerinin mRNA ekspresyasyonu transfected hücrelerde transfected olmayan adipositlere kıyasla değişmedi. Ters transfeksiyon protokolü, adipositlerin %70'inden fazlası transkraklı olduğu için etkilidir. Perilipin-1'e karşı siRNA ile transfeksiyondan üç gün sonra Perilipin-1'in mRNA seviyesi %70, protein seviyesi ise %63 Perilipin-1 ekspresyonu transeksiyondan dört gün sonra floresan mikroskopi ile analiz edilmiş ve kontrol mezhebislerindeki ifadesine göre %92 oranında azaldığı tespit bulunmuştur.MiR-34a ekspresyonunu yukarı düzenlemek için mikroRNA taklit eden oligonükleotidler ile adipositlerin ters transfeksiyonları burada gösterilmiştir. MiR-34a'nın aşırı ekspresyonu VAMP2 protein ekspresyonunun %50 azalmasına yol açtı Perilipin-1'in 3T3-L1 adipositlerinde devrilmesi bazal lipolizde artışa yol açarken, miR-34a'nın aşırı ekspresyonu insülin kaynaklı protein kinaz B fosforilasyonunun ve glikoz alımının inhibisyonuna yol açtı. Yeni farklılaştırılmış adipositler üzerinde transfeksiyon gerçekleştirmek ve tripin ile adipositlerin tedavisini dikkatle izlemek için yüksek düzeyde adiposit farklılaşmasına ulaşmak önemlidir.Transfeksiyondan sonra, proteinlerin veya mikroRNA manipülasyonunun insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz üzerindeki etkisini incelemek için adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapmak mümkündür.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yağ dokusu (AT) tüm vücut homeostazını etkileyebilir, bu nedenle adiposit farklılaşması ve fonksiyonunun moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir. İndüklenmiş adiposit apoptozu için bir model olarak adiposit homeostazı, farklılaşması ve hipoksi maruziyetini analiz ederek bu süreçlere yeni bakış açıları kazandırmak için bir protokol sunuyoruz.

Farklılaşma ve Apoptoz Homeostazis sayesinde Yetişkin Organizmalar içinde Adiposit Numaraları Yönetmeliği Mekanizması

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Biz adipoz doku metabolik fenotip katkıda matris ve adiposit lerin rollerinin diseksiyon sağlayan bir 3D insan ekstrasellüler matriks-adiposit in vitro kültür sistemi açıklar.

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Olgun adipositlerin büyüklüğü ve kırılganlığı, çalışmaları ve izolasyonları için mevcut teknik ve araçları sınırlamıştır. Burada, farklı yağ depoları ve fare diyetleri için kolayca uyarlanabilen olgun murin adipositlerinin izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Bilgisayar üretilen bir model olarak kullanarak Jacky ejderha uyaranlara.

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Keşfedin, 3T3-L1 adipositlerinde ters transfeksiyon ile protein ve mikro-RNA modülasyonunu. Bu yöntem, insülin sinyalizasyonu ve glukoz alımı üzerinde fonksiyonel deneyler için yüksek verimlilik sağlar.

Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Daha fazla video keşfet