Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları
February 9th, 2021
Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.
Bu protokol, genlerin sosyal bir ortamda iletişim ve davranıştaki işlevini anlamak için genetiği değiştirilmiş karıncalar üretmemizi sağlar. Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etmek zordur, çünkü birçok tür laboratuvar ortamlarında çiftleşmez ve çoğalmaz. Karınca hipernazal hücre tabanındaki çarpıcı fenotip plastisitesi, CRISPR aracılı mutant çizgiler oluşturmamızı sağlar.
Prosedürü gösteren, bir laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olan Kayli Sieber olacak. H.saltator'un vahşi tip kolonilerini, 22 ila 25 santigrat derece arasında bir karınca yetiştirme odasında şeffaf plastik kutularda ve 12 saatlik bir ışık, 12 saatlik karanlık aydınlatma programında tutun. Bireysel işçileri veya küçük kolonileri desteklemek için küçük kutular ve daha büyük kolonileri desteklemek için orta veya büyük kutular kullanın.
Yuva kutuları oluşturmak için, zeminleri yapmak için sıva kullanın. Islak sıva ortamda ve büyük kutularda kuruduğundan, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemek için sıvaya birkaç santimetre derinliğinde ve kutunun arkasından birkaç santimetre uzakta bir köpük blok bastırın. Sıva kuruduktan sonra, belirlenen yuva bölgesini kare bir cam parçası ile örtün.
Kolonileri haftada iki kez canlı cırcır böcekleriyle besleyin ve bir yıkama şişesi kullanarak plastik yuva kutusu döşemesine düzenli olarak su uygulayın. Beslenme gerçekleştiğinde, çöpleri ve ölü bireyleri çıkarın. Bu malzemeleri normal çöp olarak atmadan önce tüm atıkları ve ölü karıncaları gece boyunca eksi 30 santigrat derecede dondurun.
Larvaların yavrulaşırken larvalara yardımcı olmak ve işçilerin yuva kutusunu temiz tutmalarına yardımcı olmak için periyodik olarak kolonilere bir tutam kurutulmuş talaş ekleyin. Cam mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için mikro pipet çektirici kullanın. Kullanılan camın tozsuz ve temiz bir ortamda saklandığından emin olun.
Mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için iki aşamalı bir işlem kullanın. İlk adım için, ısıyı 575'e, filamenti 3'e, hızı 35'e, gecikmeyi 145'e ve çekmeyi 75'e ayarlayın. İkinci adım için, ısıyı 425'e, filamenti 0'a, hızı 15'e, gecikmeyi 128'e ve çekmeyi 200'e ayarlayın.
Elde edilen iğnenin 2 milimetrelik bir konik ve 0,5 mikrometrelik bir uca sahip olduğundan emin olun. İğneleri çektikten sonra, kullanana kadar tozsuz ve temiz bir ortamda saklayın. Kazein proteinlerinin ve in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'ların mikroenjeksiyon karışımını hazırlayın.
Bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleme zamanı gelene kadar karışımı buz üzerinde tutun. Kullanılmadığında, mikroenjeksiyon karışımını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Enjeksiyon parametrelerini 140 hektopaskal enjeksiyon basıncına, 70 hektopaskal sabit basınca ve 0.4 saniyelik bir süreye ayarlayın.
Sabit basıncı, malzemenin yalnızca bir yönde akacağı şekilde ayarlayın ve enjeksiyon basıncını ve süresini yalnızca iğneden embriyoya hiçbir malzeme akmıyorsa ayarlayın. Mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak karışımın iki mikrolitresini içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Karışımda kabarcık oluşmadığından emin olmak için bunu yavaşça yapın.
İğnenin sadece ucunu bandın kenarı boyunca kırın, böylece dar bir konik hala korunur. İğnenin, ucun açılacağı kadar kırıldığından emin olun, ancak konikliğin kırıldığı kadar değil. Ardından iğneyi mikro manipülatöre monte edin.
Sinsityal aşamadan mikroenjeksiyon için embriyoları seçin, bu da çekirdeklerin sitokinezi olmadan bölündüğü zamandır. Embriyoları, bir cam mikroskop slaytına yapışmış çift taraflı bir bant plakası üzerine hizalayın ve enjeksiyon sırasında hareketi önlemek için banda iyi sabitlendiklerinden emin olun. Embriyoları, her embriyonun yanal tarafı bandın kenarında olacak şekilde dikey bir yönde yerleştirin.
Slaytı ve sıralanmış embriyoları, belirlenmiş bir mikroenjeksiyon iş istasyonunda mikroskop sahnesine yerleştirin. İğneyi mikromanipülatör kullanılarak enjekte edilecek ilk embriyo ile hizalayın ve ilk embriyoyu mikroskop altında dorsal veya ventral ekseni boyunca yanal olarak delin. Mikroenjeksiyon karışımını enjekte edin ve embriyonun hafif hareketini arayın, bu da enjekte edilen sıvı nedeniyle iç basınçta bir artış olduğunu gösterir.
Ek olarak, embriyonun dış zarında görünür doku veya lipit izleri içeren küçük bir damlacık oluşumunu izleyin. İğneyi embriyodan yavaşça çıkarın ve mikroskop slaytının konumunu ayarlayarak bir sonraki embriyoya geçin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar tekrarlayın.
Slayttaki tüm embriyolar başarıyla enjekte edildikten sonra, slayttan çıkarılmadan önce embriyolara iyileşmeleri için zaman tanımak için slaytı bir saat boyunca nemli bir kutuya aktarın. Kuluçkadan sonra, slaytı etanol ile yıkayın, enjekte edilen embriyoları tüy ağırlıklı forseps kullanarak banttan yavaşça çıkarın ve az miktarda% 70 etanol ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Tüpü birkaç kez ters çevirin.
Küçük ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak, enjekte edilen tüm embriyoları% 2 antibiyotik antimikotik ile% 1 agar plakalarına aktarın. Plakaları yaklaşık dört hafta boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin ve kuluçka için düzenli olarak kontrol edin. İlk embriyo bir larvaya yumurtadan çıktıktan sonra, tüm embriyoları ve larvaları, yavrulara bakmak için birkaç genç hemşire işçisiyle birlikte bir yuva kutusuna geri döndürün.
Daha önce gösterilen yöntemleri izleyerek koloniyi koruyun. Bu protokol, Harpegnathos tuzlayıcı embriyolarında genom düzenlemeyi başarıyla gerçekleştirmek için kullanıldı. Sonuçlar, enjekte edilen embriyolardan ekstrakte edilen DNA'nın PCR ve pGEM klonlaması ve ardından DNA dizilimi ile doğrulandı.
Bu protokolü kullanarak somatik mutagenezin etkinliği yaklaşık% 40'a ulaştıF1 mutant erkekler, çiftleşmediği takdirde F3 erkekleri üreten heterozigot F2 dişileri üretmek için vahşi tip dişilerle çiftleştirildi. Mutant F3 erkekleri, F4 homozigot mutant dişileri üretmek için heterozigot dişilerle çiftleştirildi. Başarılı mutagenezin bir sonucu olarak, hedef genin kaybı ile ilişkili olağandışı davranışlar gözlenmiştir.
Orco'nun kaybı, feromon algılama kaybı, avı tespit edememe, bozulmuş doğurganlık ve koloniden dolaşma ile ilişkilidir. Bu protokolü uygularken, enjeksiyon sırasında embriyo hasarının en aza indirilmesi gerekir. Bu, iğne ucunun çok geniş açılmamasını sağlayarak ve enjekte ederken iğneyi yavaşça hareket ettirerek yapılabilir.
Benzer teknikler, nöronal aktivite ve davranışı araştırmak için daha sofistike araçlar sağlayacak olan transgenik karıncaları üretmek ve sürdürmek için kullanılabilir. CRISPR aracılı nörogenez, bal arıları, klonal akıncı karınca ve ateş karıncaları gibi diğer ösosyal böcek türlerinde kullanılmıştır. Genetik modifikasyonlar, ösosyal böceklerde gelişim, fizyoloji ve sosyal davranış üzerine fonksiyonel çalışmaları kolaylaştıracaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, iletişim ve davranıştaki gen fonksiyonunu sosyal bir bağlamda incelemek için genetiği değiştirilmiş karıncalar üretilmesine olanak tanır. CRISPR aracılı mutagenez kullanımı, ösosyal böceklerde fedakar davranış hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genetik
- Davranışsal Biyoloji
Arka Plan
- Böceklerin ösosyallik yapısı, iletişim ve işbölümüne dayanır.
- Laboratuvar ortamlarındaki üreme kısıtlamaları nedeniyle karıncalarda genetik manipülasyon zordur.
- Karınca hücrelerindeki fenotipik plastisite, mutant çizgiler kurulmasına yardımcı olur.
- Fedakar davranışı anlamak, böceklerdeki sosyal yapılar hakkında ışık tutabilir.
Çalışmanın Amacı
- Ösosyal böceklerin genetik sistemlerini manipüle etmek.
- Ana düzenleyici genlerin fonksiyonunu keşfetmek.
- Sosyal ortamlarda iletişim ve davranış hakkında bilgiler edinmek.
Kullanılan Yöntemler
- Karınca embriyolarına mikroenjeksiyon.
- CRISPR aracılı mutagenez.
- Kontrollü ortamlarda vahşi tip kolonilerin korunması.
- Farklı kutu boyutlarında bireysel işçilerin ve küçük kolonilerin yetiştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Genetiği değiştirilmiş karınca çizgilerinin başarılı üretimi.
- İletişim ve fedakar davranışın genetik temeline dair bilgiler.
- Karıncalarda gelecekteki genetik çalışmalar için protokollerin kurulması.
- Yöntemin bir lisansüstü öğrencisi tarafından gösterilmesi.
Sonuçlar
- Genetik manipülasyon, ösosyal davranışı anlamamızı artırabilir.
- CRISPR teknolojisi, karmaşık sosyal özellikleri incelemede etkilidir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu bulgulara dayanarak diğer ösosyal türleri araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Genetic manipulation in eusocial insects enables mechanistic de-risking of target validation for social behavior pathways. This protocol supports predictive confidence in linking gene function to phenotypic plasticity in ant caste systems. It provides a disease-relevant system for studying neurogenetic mechanisms underlying communication and division of labor.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in communication and behavior pathways within a social context.
- Operational Value: Establishes CRISPR-mediated mutagenesis as a functional validation tool for ant neurogenetic targets.
- Scientific Value: Supports phenotypic de-risking by linking gene loss to observable behavioral and physiological changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates mutant lines for quantitative analysis of caste-specific physiology and social traits.
- Operational Value: Standardizes embryo microinjection workflow for reproducible germline transmission across generations.
- Scientific Value: Enables screening-ready models for probing neuronal activity and behavioral phenotypes in eusocial systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying pheromone sensing, fecundity, and colony integration behaviors.
- Operational Value: Facilitates continuity from F0 mutagenesis to F4 homozygous mutant lines for generational phenotype tracking.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in altruistic behavior and reproductive division of labor.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target validation through germline transmission and phenotypic screening in social insect models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in altruistic behavior and reproductive division of labor.
- Screening: Delivers quantitative phenotypic outputs via F1–F4 generational analysis for target validation.
- Analytics: Enables PCR validation, cloning, and sequencing to quantify mutagenesis efficiency and allele transmission.
- Translational Research: Connects gene loss to neurobehavioral phenotypes relevant to social communication and prey detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating transgenic and mutant ant lines across hymenopteran species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through observable loss-of-function phenotypes in social contexts.
- Operational Value: Standardized embryo handling, injection parameters, and rearing conditions ensure reproducibility.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early functional annotation of neurobehavioral genes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in communication, fecundity, and colony cohesion.
Implementation Considerations
- Expertise in embryo handling, microinjection, and eusocial insect rearing is required.
- Instrumentation includes microinjectors, micromanipulators, and needle pullers under sterile conditions.
- Cross-team standardization is needed for embryo staging, injection timing, and post-injection recovery protocols.
- Adaptation across insect species requires optimization of injection pressure, needle geometry, and rearing environment.
- Practical limitations include embryo damage from over-penetration and low survival rates without proper humidification.
