Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu
February 15th, 2021
Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.
Farklı beyin bölgelerini incelemek, beynin moleküler ve yapısal karmaşıklığını anlamaya yönelik bir basamak taşıdır. Bu protokol, farklı beyin bölgelerini izole etmek için fare beyninin sistematik bir diseksiyonunu tanımlar. Beyin anatomisi perspektifinde, kolayca çoğaltılabilen yukarıdan aşağıya bir yaklaşımdır.
Bu protokolün avantajları iki yönlüdür. İlk olarak, bu yaklaşım küçük ama kritik beyin bölgelerinin moleküler temellerini anlamak için bir fırsat sağlar. İkincisi, tüm bu diseksiyon süreci, sırt ve moleküler tahlillerin kritik bir ön koşulu olan moleküler bütünlüğün korunmasını sağlamak için yeterince kısadır.
Bu prosedür pratik ve hassas kullanımı içerir. Yapısal dönüm noktalarını korumak için zamanlama burada çok önemlidir ve uygun eğitim ve uygulama ile elde edilebilir. Fare beyninin çıkarılması prosedürünü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma kimyageri ve biyoinformatikçi olan Seid Muhie olacak.
Fare beyni diseksiyonu prosedürünü daha fazla gösteren, laboratuvarımızdan bir sinirbilimci olan James Meyerhoff olacaktır. Başlamak için, iyi bir kavrama için cildi temizleyin ve çıkarın. Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez kullanın.
İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Daha sonra makasları, omuriliğin dikey olarak işaret eden bıçakla geçtiği kafatasının tabanının açıklığına yerleştirin, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine paralel ve bastırarak, bıçağı 45 derece sola ve daha sonra sağ tarafa döndürün. Beyinciği açığa çıkarmak için intraparietal kemikteki oksipital kemiği çıkarın.
Makası orta sagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için yukarı doğru kaldırarak kesin. Parietal kemikler kaldırılırken, kalan meningeal ataşmanları tanımlayın ve kesin. Sagital düzlemde iki paralel kesim yapın ve beyin yüzeyinin yırtılmasını önleyerek ön kemiğin parçalarını çıkarın.
Meningeal ataşmanları ve kraniyal sinirleri keserken, yerçekiminin beynin tuzlu su çözeltisi ile önceden doldurulmuş küçük bir kaba çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını ters çevirin. Hipofiz anatomisinin tanımlanabilir olması için işitsel boğayı sağlam tutun. Hipofizi yerinde tutan zarlı çadırın sırtında her iki tarafta da son derece küçük bir parasaggital kesim yapın ve hipofizin arka lobunu ultra ince forsepslerle kaldırın.
En yakın trigeminal sinirde hipofiz ön lobunun lateral kenarları arasında sagital bir kesim yapın, ardından hipofizin ön lobunu kaldırın. Beyaz ışık kaynağını doku üzerine yönlendirin. Beyni önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisinde buzla çevreleyerek bloğu soğuk tutun.
Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin. Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, beyinciği çıkarın.
Dorsal yaklaşımı kullanarak, küçük bir kavisli forsepsin kapalı bıçaklarını korpus kallozumun altına kaydırın ve kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Nihai olarak, optik kiazm, hipotalamus, koku alma ampulleri, medulla oblongata, hipofiz stoğu ve pontin köprüsü gibi yapılar görülebilir. Yarımküreleri ayırmayı deneyin.
Beyin ventral bölgesini yukarı çevirin ve serebral yarımkürelerdeki koku alma ampulleri arasındaki dorsumdan başlayarak orta sagital bir kesim yapın. Medullayı çıkarın ve ardından iki yarım küreyi yavaşça ayırın. Daha sonra, arka beyni elde etmek için havuzların iç kenarında koronal bir kesim yapın ve medullayı göletlerin arka kenarından ayırın.
İki serebral yarımkürenin dikkatli bir şekilde ayrılması için beyin dokusunu çevirin. Bu adımda koku alma ampulünü çıkarın. Korpus kallozumun cinsinin bir milimetre önünde bir koronal kesim yapın ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından medial ve lateral prefrontal korteksi ayırın.
Septal çekirdeği dorsal olarak ve ventral striatum ventrallisini serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay veya koronal olarak kısmen kesilir. Çekirdek yenik ve koku tüberkülünü çıkarmak için az miktarda korteksi lateral yüzeyden çıkarın. Korpus striatumun rostral kısmını, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli bir neşter ile üstteki korteksten ayırın.
Septal çekirdekleri veya septumu tanımlayın ve bunları bu bölümden izole edin. Bu adımda hipotalamusu ayırmak için kavisli bir kesim yapın. Bu, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanan memeli cisimlerine posterior kısmi bir koronal kesim kullanılarak yapılacaktır.
Daha sonra hipotalamus kesitini, hipotalamik sulkus uzunluğu boyunca parasagital bir kesimle serbest bırakın. Kalan limbik sistem bileşenlerinde ek intralimbik bağlantılar ortaya çıkarmak için lateral ventrikülü kullanın. İç korteksin iç kısmında, ventrikül açıldıktan sonra fan benzeri bir yapı gözlenir.
Diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için entorinal korteksteki fan benzeri yapıyı kullanın, ardından amigdala, entorinal korteks, posterior singulat korteks ve hipokampusu tanımlayın ve çıkarın. Orta hat rostral kortikal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden koronal bir kesikle tamamen ayırın.
Bu protokol, beynin kafatasından derhal çıkarılması ve ardından diseksiyon için kullanılabilir. Disseke edilen dokular, çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak daha sonra korunabilir ve işlenebilir. Birden fazla disseke dokudan ekstrakte edilen RNA, gen ekspresyonu için test edilebilir.
Temsili sonuçlar, RNA ekstraksiyonundan önce birkaç ay boyunca eksi 80 santigrat derecede depolanan hasat edilmiş beyinler kullanılarak elde edildi. Ağırlık verileri ile birlikte farklı beyin bölgeleri, saldırgan TSSB'nin sosyal stres modeline maruz kalan çalışma kapsamında toplanmıştır. RNA konsantrasyonları ve spektrofotometrik okumalar burada gösterilmiştir.
Bu protokolü izlerken, beyni buzlu çelik bir blok üzerinde tutarak ve dokuyu periyodik olarak buzlu salin ile doldurarak dokuların her zaman soğutulmasını sağlayın. Dokular toplandıktan ve hemen dondurulduktan sonra, daha sonra transkriptomik, metabolomik ve proteomik gibi tahliller için kullanılabilirler.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, fare beyninin çıkarılması ve farklı beyin bölgelerini izole etmek için yapılan bir adım adım protokolü sunar. Yöntem, dokuların moleküler bütünlüğünü sağlayarak kritik beyin bölgelerinin yüksek kaliteli transkriptomik analizini kolaylaştırır. Protokol, sinirbilimdeki moleküler araştırmalar için basit ve kolayca tekrarlanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Beyin anatomisi
- Moleküler analiz
Arka Plan
- Beynin moleküler ve yapısal karmaşıklığını anlamak, sinirbilimdeki ilerlemeler için şarttır.
- Farklı beyin bölgelerinin diseksiyonu, hedefli moleküler çalışmalara olanak tanır.
- Diseksiyon sırasında doku bütünlüğünün korunması, sonraki analizler için önemlidir.
- Diseksiyonu doğru yapmak için eğitim ve pratik gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare beyin diseksiyonu için verimli bir protokol sağlamak.
- Küçük ama kritik beyin bölgelerinin moleküler analizini sağlamak.
- Disseke edilmiş beyin bölgelerden elde edilen transkriptomik verilerin kalitesini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, fare beyninin kafatasından sistematik olarak çıkarılmasını ve ardından belirli bölgelerin diseksiyonunu içerir.
- Kritik adımlar, yapıları korumak ve moleküler bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için dikkatli kesme ve işlemeyi içerir.
- Disseke edilen dokular RNA ekstraksiyonu için işlenir ve gen ekspresyonu için analiz edilebilir.
Ana Sonuçlar
- Protokol, fare beyin bölgelerinin hızlı ve kesin diseksiyonunu sağlarken moleküler bütünlüğü korur.
- Sonraki transkriptomik değerlendirmeler için RNA ekstraksiyonuna izin verir, moleküler analizi artırır.
- Daha fazla araştırma için kritik beyin yapılarının tanımlanmasını ve izole edilmesini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, moleküler sinirbilim araştırması için kritik olan fare beyin diseksiyonu için detaylı bir metodoloji sunar.
- Korunacak doku, beyin fonksiyonlarının anlaşılmasına yardımcı olmak için transkriptomik çalışmalarda kullanılabilir.
- Bulgular, nöronal mekanizmaların daha iyi anlaşılması ve hastalıkların anlaşılmasında potansiyel uygulamaların genişlemesine katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Precise anatomical dissection of mouse brain regions enables targeted molecular analysis critical for neuroscience target validation. This protocol supports phenotypic screening and mechanistic de-risking by isolating functionally relevant structures for downstream assays. Maintaining tissue integrity ensures reliable transcriptomic data for preclinical model development and biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through region-specific gene expression analysis.
- Operational Value: Provides anatomically defined samples for validating target engagement in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular changes to specific brain structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for standardized assay development in neuropharmacology.
- Operational Value: Ensures reproducibility and quantitative outputs essential for screening campaign consistency.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple target classes and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving region-specific molecular profiles.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via consistent tissue preparation across studies.
- Translational Biomarker Alignment: Supports identification of region-specific biomarkers correlating with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization by enabling region-resolved molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via anatomically precise tissue isolation.
- Screening: Delivers assay-ready samples with preserved molecular integrity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative RNA expression readouts that facilitate cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved structural and molecular context.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized dissection capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain region-specific studies.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability for multi-site neuroscience research programs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through better target validation and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on region-specific molecular data from validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical techniques for precise landmark identification.
- Dependent on instrumentation including fine curved scissors, forceps, and cooled dissection surfaces.
- Necessitates cross-team standardization of dissection protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different mouse strains or developmental stages.
- Limited by tissue degradation risks if dissection timing or temperature control is not maintained per protocol.
