Name: Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin fare beyninin mikrodiseksiyon protokolünü; hipotalamus, hipokampus ve amigdala gibi işlevsel ve anatomik olarak farklı bölgeleri izole etmek için. Bu yöntem moleküler bütünlüğü koruyarak transkriptomik analizler için yüksek kaliteli doku örnekleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deneysel yardımları için Bayan Seshmalini Srinivasan, Bay Stephen Butler ve Bayan Pamela Spellman'a ve el yazmasını düzenledikleri için Bayan Dana Youssef'e teşekkür ederiz. USAMRDC'nin finansman desteği minnetle kabul edilmektedir. Cenevre Vakfı bu çalışmaya katkıda bulundu ve ABD Ordusu Araştırma Ofisi aracılığıyla Askeri ve Operasyonel Tıp Araştırma Alanı Müdürlüğü III'ten gelen fonlarla desteklendi.
Feragatname:
Materyaller Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiştir. Sunumuna ve/veya yayınlanmasına itiraz yoktur. Burada yer alan görüşler veya iddialar yazarın özel görüşleridir ve resmi olarak veya Ordu Bakanlığı veya Savunma Bakanlığı'nın gerçek görüşlerini yansıttığı şeklinde yorumlanmamalıdır. Araştırma, Hayvan Refahı Yasası ve hayvanları içeren hayvanlar ve deneylerle ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü kapsamında yürütülmüştür ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, NRC Yayını, 2011 baskısında belirtilen ilkelere uygundur.

Hayvan elleçleme ve deneysel prosedürler, hayvan bakımı için Avrupa, ulusal ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ordusu Çevre Sağlığı Araştırma Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve şimdi Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü (WRAIR) tarafından onaylandı ve Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir tesiste gerçekleştirildi. NOT: Prosedür, servikal çıkık16 ile ötenazi yapılan C57BL / 6j suşunun altı ila sekiz haftalık erkek fareleri üzerinde gerçekleştirilecektir. Laboratuvarımızda perfüzyon yapılmamaktadır, ancak bu protokol vaskülatürden kanı temizlemek için perfüzyonların yapılabileceği şekilde modifiye edilebilir. Diseksiyon için gerekli tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Diseksiyon, beynin çıkarılması, hipofiz bezinin çıkarılması ve beyin diseksiyonu dahil olmak üzere üç bileşene ayrılır. Beyin dokusu toplamanın amacı, RNA ekstraksiyonlarını takiben transkriptomik testler için bunları işlemektir. Beyin bölgesi diseke edilir edilmez, beyin bölgelerinin her birini derhal önceden etiketlenmiş bir dondurucu şişesine aktarırız ve daha sonra şişeyi sıvı azot veya -80 ° C'de depolarız. NOT: Bu prosedürü gerçekleştirmek için nöroanatomi hakkında kapsamlı bilgi gereklidir. Yatay ve uzunlamasına bölümlerin yanı sıra normal enine kesitler de incelenmeli ve öğrenilmelidir. Beyin dokusu çok hızlı bir şekilde bozunduğundan, bu prosedürü uygularken bir atlasa danışmak için zaman yoktur.
1. Fare Beyninin Çıkarılması
<ol><li>Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin (Şekil 2i) ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez pedi kullanın ve kafatasının dorsumunda kuru bir alan oluşturun (Şekil 2ii).</li>
	<li>İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Burada, makası kafatasının tabanındaki açıklığa yerleştirin, omuriliğin dikey olarak (saat 12 pozisyonunda) bıçakla geçtiği, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine (yani oksipital squama) paralel ve bastırdığı ve bıçağı kırk beş ° sol tarafa ve daha sonra sağ tarafa döndürdüğü foramen magnumdur.</li>
	<li>Oksipital kemiğe devam eden kalan kemiğin ortasını kesecek bazal plaka kemiğini ve kemikleri çıkarılana kadar sola ve sağa meraklı intraparietal kemikleri kesmek için bileği döndürmeye devam edin. Benzer şekilde, beyinciği açığa çıkarmak için oksipital kemiği ve intraparietal kemiği çıkarın. NOT: Bu noktada, kafatasının orta ve iç kulağın kısımlarını çevreleyen ventral posterior kısmında, timpanik bullae adı verilen içi boş kemikli yapı, hipofizlerin arka ve ön lobları diseke edilmediği sürece çıkarılabilir (Şekil 2iii).</li>
	<li>Kavisli keskin bir makas bıçağı kullanarak zamansal sırttaki kas ataşmanlarını çıkarın. Kavisli keskin makasın bir uzvunu enine ve sagital sinüslerin birleşme noktasına nüfuz eden lambdoid sütür altına yerleştirin (Şekil 2iv).</li>
	<li>Makası midsagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için dikkatlice yukarı doğru kaldırırken çok nazikçe kesin. Bu, prosedürde kritik bir adımdır (Şekil 2v).</li>
	<li>Bu adımda, parietal kemikler kaldırılır ve döndürülür, böylece kalan meningeal ataşmanları tanımlamak ve kesmek için kemiğin iç yüzeyi kazınır. Temporal kemiği dışa doğru meraklı bir şekilde, beyinden uzakta kavrayın. Ön kemiği her iki taraftan kavisli makas veya bir rongeur kullanarak yörüngeye çıkarın ve yörünge sırtına dik açıyla koronal olarak kesin, ancak orta çizgiden daha fazla değil (Şekil 2vii).</li>
	<li>Sagital düzlemde paralel ve yaklaşık 4 mm aralıklarla iki kesim yapın (Şekil 2viii). NOT: Her iki tarafı da tek bir vuruşla kesmeyin.</li>
	<li>Beyin yüzeyinin yırtılmasından kaçınarak frontal kemiğin parçalarını çıkarın (Şekil 2ix). Bu noktada, koku alma ampulleri arasında erişilebilir olması gereken dura mater'i kesmek için ince bir makas kullanın.</li>
	<li>Yerçekiminin beynin çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını yavaşça ters çevirin, kalan meningeal ekleri ve kraniyal sinirleri tanımlamaya ve kesmeye devam edin. Beyin, beyne bağlı en büyük trigeminal sinir kesilerek serbest bırakılır ve kalvaryum tabanından uzanan açıkça görülebilir (Şekil 2x). NOT: Daha fazla diseksiyon için beyni soğuk bir salin çözeltisine (buz gibi soğuk RNaz içermeyen sodyum sitrat (% 0.9) veya fizyolojik (% 0.9) salin) aktarın.</li>
</ol>2. Ön ve Arka Hipofizlerin Diseksiyonu
NOT: Hipofiz bezleri, sol ve sağ trigeminal sinirler arasında yanal olarak uzanan bir sırt ile çok sert bir çadır benzeri zarla kaplıdır. Bu yapılar son derece yumuşak ve hassastır ve bu nedenle, hipofiz bezlerinin arka ve ön loblarının doğrudan kafatasından ayrı aşamalarda, in situ olarak diseke edilmesi önerilir. Diseksiyondan hemen sonra, ilgili hipofiz bezini önceden etiketlenmiş bir şişeye aktarın ve şişeyi tercihen -80 ° C'de sıvı azotta saklayın. Hipofiz bezi tam olarak oksipital ve bazfenoid kemiklerin birleşme noktasına dayanır; eğer esnerlerse, hipofiz mimarisi bozulur.
<ol><li>Hipofiz anatomisinin sağlam ve kolayca tanımlanabildiğinden emin olmak için işitsel bülleri sağlam tutun (Şekil 2ix).</li>
	<li>Hipofizin arka lobunu ve ardından hipofizin ön lobunu kafatasının geri kalanından diseke edin.</li>
	<li>Membranöz çadırın sırtında her iki tarafta son derece küçük bir parasagital kesim yapın ve ön hipofiz dokusunu bozmamaya özen göstererek hipofizin arka lobunu ultra ince forseps ile kaldırın (Şekil 2x).</li>
	<li>Hipofiz ön lobunun lateral kenarları ile en yakın trigeminal sinir arasında sagital bir kesim yapın ve bundan sonra hipofizin ön lobunu kaldırın (Şekil 2x).</li>
</ol>3. Fare Beyin Diseksiyonu
NOT: Beyin ve hipofiz çıkarılmasından hemen sonra, önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerinde daha fazla diseksiyon yapılır (Şekil 3). Diseksiyon sonrası, beyin bölgelerini önceden etiketlenmiş şişelere aktarın ve şişeleri tercihen sıvı nitrojene aktarın, aksi takdirde -80 ° C. Yukarıdan aşağıya yöntemle (kronolojik sırayla) üretilen yapılar potansiyel olarak şunları içerir: beyincik (CB), beyin sapı / arka beyin (pons ve medulla oblongata) (HB), aksesuar koku alma ampulleri olarak koku alma ampulleri (OB), medial prefrontal korteks (MPFC), lateral prefrontal korteks (FCX), anterior ve posterior korpus triatum (ST), çekirdek akümülatörlerinden (NAC) ve koku tüberkülünden (OT) oluşan ventral striatum (VS), septum (SE), preoptik alan, piriform korteks (PFM), hipotalamus (HY), amigdala (AY), hipokampus (HC), posterior singulat korteks (CNG), entorinal korteks (ERC), talamuslu orta beyin (MB) ve serebral korteksin geri kalanı (ROC) (Tablo 1). Belirli bölgeler, tek bir yarımküre ile çalışan izolasyon sırasına göre tartışılacaktır.
<ol><li>Beyni kalvaryumdan çıkarmaya büyük özen gösterin, çünkü herhangi bir yırtılma olması durumunda yer işaretleri tahrip olabilir. Bu adımda, yüz koruma, özellikle de 7x kuyumcu vizörü kullanarak tüm diseksiyonları gerçekleştirin ve aydınlatma, dissektörün omuzlarının her birinin üzerine yerleştirilmiş cerrahi lambalarla sağlanacaktır. Diseksiyonun çoğu künt modlu küçük kavisli forseps (yani Graefe forseps) kullanılarak gerçekleştirilecektir.</li>
	<li>Beyni paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin (Şekil 4i ve Şekil 4ii). Bloğu buz ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisi ile çevreleyerek soğuk tutun. Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.</li>
	<li>Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, üst, orta ve alt serebellar pedinkülleri açığa çıkararak CB'yi nazikçe yansıtın ve CB'yi çıkarın (Şekil 4iii ve Şekil 4iv).</li>
	<li>Dorsumdan başlayarak ve OB ile serebral hemisferler arasında (Şekil 4v) orta sagital bir kesim yapın ve anterior komissürden daha uzağa uzanmadığınızdan emin olun. Bu noktada, vermis lateral kısımlardan kolayca ayrılabilir ve HB , ponsun ön kenarındaki koronal bir kesim ile elde edilir.</li>
	<li>Medullayı, ponsun arka kenarındaki koronal bir kesimle ayırın. NOT: Bu noktada, epitalamus, talamus, hipotalamus ve ventral talamus ile üçüncü ventrikülü içeren ön beynin arka kısmı olan diensefalon, ventral tarafı yukarı doğru çevirecek ve optik kiazmdan rostral olarak orta sagital bir kesim yapılacaktır. Serebral hemisferlerin diseksiyonu ve ardından OB'nin yarımkürelerden birinden çıkarılması bu aşamada olacaktır (Şekil 4v ve Şekil 4vi).</li>
	<li>Diensefalonu daha fazla diseke etmeden önce serebral hemisferleri ayırın (Şekil 4v). Dorsal yaklaşım, kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için dikkatli künt diseksiyon ile kullanılacaktır. Her hemisferik bağlantıyı kesmeden önce görselleştirin, çünkü bu orta hattan sapma olasılığını en aza indirecektir. NOT: Bu adımda serebral yarımküreden biri (Hemibrain) korunabilir ve ikinci yarımküre daha ileri diseksiyon için kullanılabilir.</li>
	<li>Korpus kallozumun altındaki küçük, kavisli forsepslerin kapalı bıçaklarını kaydırın ve neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Korpus kallozum, iki yarımküreyi birleştiren, forsepslerle kıstırılarak altta yatan orta hat yapılarını bozmadan açıkça diseke edilecek geniş bir sinir lifi bandıdır. NOT: Yarımkürelerin mesial yüzleri, korpus kallozumun cinsi, fornices ve anterior komissür gibi miyelinli yapılar gibi görülebilen birden fazla işarete sahip olacaktır. Ayrıca, orta hatta birkaç milimetre yanal olmasına rağmen, mammillothalamik sistem ve fasciculus retroflexus da görülebilir.</li>
	<li>Orta çizgiyi geçen çoklu yapıları ikiye bölün. Buna korpus kallozum, anterior komissür, ventral forniks komissure, posterior komissür, dorsal fornix komissure, supra mammillary decussation, superior colliculus commissure, ventral fornix komissure, ve periventriküler talamiks lifleri dahil olacaktır.</li>
	<li>Dorsal yaklaşım yöntemiyle kısmen tehlikeye girebilecek orta hattın içinde veya yakınında bu adımda özel dikkat gösterin. Tüm takip yapıları dikkatli yapılmadığı takdirde risk altındadır.</li>
	<li>OB (kama şeklinde ve daha açık renkte) ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından MPFC (singulat korteks alanı 1, prelimbik, infralimbik, medial orbital ve sekonder motor korteksler [M2]) ve FCX'in toplanması, korpus kallozumun cinsine 1 mm ön tarafta yapılan bir koronal kesimle (Şekil 4vii). Elde edilen bölümü, medialden lateral yüzeye olan mesafenin 1 / 3'ünü parasagital bir kesimle bölün, medial olarak MPFC ve yanal olarak FCX'in geri kalanını verin. Singulat korteks, MPFC'nin fare analoğudur. NOT: Bu doku dilimi ayrıca az miktarda M2 (ikincil motor korteks) 17 içerecektir ve kaçınılmazdır.</li>
	<li>Ortaya çıkan koronal bölümün rostral yüzündeki enine kesitte anterior komissürün pars anterior ekstremitesinin görünürlüğüne yol açan anterior komissür seviyesinde koronal bir kesim yapın, oysa enine kısım bölümün kaudal yüzünde ortaya çıkacaktır Bu NAC18 için doğrulayıcı bir dönüm noktasıdır. VS , NAC ve OT'den oluşur. NOT: Anterior komissürde transvers segmente ek olarak bir anterior ekstremite vardır ve buna anterior komissür, pars anterior denir.</li>
	<li>Septal çekirdeği dorsal ve VS ventralli serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay olarak kısmen kesin. Korteksin az miktarını , NAC ve OT'nin çıkarılacağı lateral yüzeyden çıkarın.</li>
	<li>ST'nin rostral kısmını, kortikal numuneye striatal doku dahil etmemeye dikkat ederek, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli neşter yoluyla üstteki korteksten ayırın. Bu noktada septal çekirdek/SE görünür olacak ve bu dilimden kolayca alınabilecektir (Şekil 4viii). NOT: PFM'nin anterior ve posterior sınırları, sırasıyla anterior komissür ve mammillary cisimlerle uyumlu hayali koronal düzlemler ile tanımlanır. Medial sınır, eksternal kapsül18 tarafından tanımlanır.</li>
	<li>Diensefalonun kalan hemi bölümünün lateral yüzeyinde, kaudal olarak uzanan rinal sulkus boyunca kısmi yatay bir kesim yapın, ancak sadece mammillary cisimlerle hayali koronal düzlem seviyesine kadar. HY'nin memeli cisimlerinin düzleminde lateral kortikal yüzeyden medial olarak 1 mm uzanan kısmi bir koronal kesim yapın. Burada, klostrum düzlemindeki para-sagital insizyon PFM'yi serbest bırakacaktır (Şekil 4ix ve Şekil 4x). NOT: Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzeyinde, mammillary cisimler, fasciculus retroflexus ve stria medullaris dahil olmak üzere çok sayıda anatomik özellik görülecektir. Talamus ve HY arasındaki boşluğu gösteren yarım daire biçimli bir desen (dorsal içbükey taraf) görünecektir. HY, optik kiazm başına midsagital kesit görünümünde, anteroodoral olarak anteroodoral olarak ve anterikülus retrofleksusla birlikte mammillary cisimlerde posterioral olarak kolayca tanımlanacaktır. İkinci işaretler atlas17'de ve albino fare ön beyin bağlamı19'da iyi bir şekilde gösterilmiştir.</li>
	<li>Memeli cisimlerin posteriorunda kısmi bir koronal kesim yapın, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanır. Bu noktada, hipotalamik sulkusun uzunluğu boyunca bir parasagital kesim şimdi HY'yi serbest bırakır.</li>
	<li>Ek limbik içi bağlantıları ve kalan limbik sistem bileşenlerini ortaya çıkarmak için lateral ventrikülün eversiyonunu gerektirir. Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzünü görüntüleyerek, kavisli forsepsler, teknisyenin forniksi kesmek için kullanılan çevredeki diğer hassas bölümlerin etrafında manipüle etmesine izin verdiği ve lateral ventriküle yerleştirildiği ve nazikçe genişlediği, ventrikülü açmak ve HC'yi döndürmek için künt diseksiyon kullanılarak en iyi seçenek olacaktır. Dikeyden yatay düzleme 90°. Koroidal arter / koroid pleksusunu kesmek için #11 bıçağının kullanılması gerekebilir, çünkü sivri uçlu uç hassas kesimlere yardımcı olabilir.</li>
	<li>CNG'yi yatay düzlemde olacak şekilde 90° döndürün (ancak HC'den ters yönde). Forseps kullanarak, HC'yi yavaşça 180 ° dışa ve yanal olarak döndürün, bu da ERC'nin iç yüzeyini görünür ve yukarı bakacak hale getirecektir.</li>
	<li>ERC'den kaynaklanan miyelinli liflerin fan benzeri bir radyasyonu , perforan yol ve HC'ye bağlanması da dahil olmak üzere açısal demetleri oluşturmak için yakınsama görecektir. Talamus ve MB 180°'yi dorsal olarak döndürerek AY'yi ventralal olarak ortaya çıkarın.</li>
	<li>Gerekirse, talamusun ventriküler yüzeyinin lateral kenarı boyunca AY'ye uzanan lif bantları içereceğinden stria terminalisin bağlantısını ortaya çıkarmak için optik yolu kaldırın ve AY'nin ana hatlarını netleştirecektir. NOT: HC ve forniks, lateral ventriküle yuvalanmış ve kolayca kaldırılabilen, bütünüyle açıkça görülebilecektir. Lateral ventrikül pia mater ile kaplanacak ve ERC'nin çok şeffaf subpial yönü boyunca perforant yolun fan benzeri kökenleri görünür olacaktır20. </li>
	<li>Medial ERC'nin dış yüzeyi , büyük piramidal hücrelerin görünür belirgin bir tabakasına sahip olacaktır. Ek olarak, Golgi boyama liflerinin yoğun bir yakınsaması, medial ERC'de göze çarpan bir özellik olacaktır. Bu diseksiyon prosedüründe, lateral ventrikül kesildikten sonra, bu lifler, ventriküllerin iç yüzeylerini kaplayan ve çok belirgin bir fan benzeri yapı oluşturan pia mater yoluyla medial yüzeyde kolayca görülebilecektir.</li>
	<li>Liflerin subpial olarak toplandığına, ventral ERC'ye inip ayrıldığına, posteriora uzandığına ve daha sonra HC'yi delmek için dikey olarak yükseldiğine dikkat edin. ERC'deki bu fan benzeri yapı , diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için kullanılacaktır. AY, ERC, CNG ve HC yapılarının sırasına göre tanımlayın ve kaldırın. NOT: AY diseksiyonu için iyi bir dönüm noktası tanımlamak, bir sonraki adım için bir anahtar olacaktır ve stria terminalinin AY ile buluştuğu arka kenardaki kavşak iyi bir nokta olacaktır.</li>
	<li>Bu noktada, kalan yapılar talamus ve MB'yi içerir. Orta hat rostrokaudal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden tamamen bir koronal kesim kaudal ile habenula'ya ve rostral'dan superior kolliküllere ayırın. ROC bu adımda kaydedilir.</li>
	<li>Bu noktada, tüm beyin bölgelerinin tam olarak toplanması ve derhal (her biri elde edildiğinden) numunelerin daha sonraki işlemlere kadar dondurulmuş olarak saklanması.</li>
</ol>

<ol><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+the+Mouse+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of the Mouse Nervous System.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li>
<li>Ackerman, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+S+%22Major+Structures+and+Functions+of+the+Brain%22">Major Structures and Functions of the Brain</a>. 2, National Academies Press. US. (1992).</li>
<li>P, T. L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aP%2C+TLS+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. (2019).</li>
<li>Paramvir, T. L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParamvir%2C+TLS+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. (2019).</li>
<li>Javed, K., Reddy, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaved%2C+K+%22Neuroanatomy%2C+Cerebral+Cortex%22">Neuroanatomy, Cerebral Cortex</a>. , Treasure Island. (2020).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Pessoa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+brain+networks+and+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Life+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding brain networks and brain organization.</a> Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+Brain+Complexity+Using+Single-cell+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).</li>
<li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Winrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain Research. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Laser+Capture+Microscopy+Approach+for+the+Microdissection+of+Discrete+Mouse+Brain+Regions+for+Total+RNA+Isolation+and+Downstream+Next-Generation+Sequencing+and+Gene+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3125(2011).</li>
<li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).</li>
<li>Muhie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+transcriptome+profiles+in+mouse+model+simulating+features+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder.</a> Molecular Brain. 8, 14(2015).</li>
<li>Hammamieh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+repeated+exposures+to+conspecific+trained+aggressors+simulates+features+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder.</a> Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.+Compact+3rd+edn%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn</a>. , Elsevier Academic Press. (2008).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Slotnick, B. M., Leonard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+atlas+of+the+albino+mouse+forebrain.+Rockville%2C+MD%2C+Alcohol%2C+Drug+Abuse+and+Mental+Health+Administration%2C+1975%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975.</a> Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).</li>
<li>Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+SR+%22Histologie+Du+Syst%C3%A8me+Nerveux+de+L%27homme+Et+Des+Vert%C3%A9br%C3%A9s.+Anglais%22">Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais</a>. , Oxford University Press. (1995).</li>
<li>Spijker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Rodent+Brain+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li>
<li>Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+Frozen+Rodent+Brain+Regions+for+Downstream+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).</li>
<li>Sultan, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Different+Areas+from+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus.</a> Bio Protocols. 3 (21), (2013).</li>
<li>Chakraborty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+and+stress+history+interplay+in+emergence+of+PTSD-like+features%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features.</a> Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+rat+brain+for+RNA+or+protein+extraction+from+specific+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).</li>
<li>Rajmohan, V., Mohandas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limbic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The limbic system.</a> Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Memeli beyni, çeşitli moleküler imzalara ve uzmanlaşmış ve ayrık işlevleri yerine getiren çoklu bölgelere sahip bir dizi morfolojik olarak farklı ve işlevsel olarak benzersiz hücrelerden oluşan karmaşık bir organdır. Burada bildirilen diseksiyon prosedürü, laboratuvarın gereksinimlerine bağlı olarak birden fazla hedefe sahip olabilir. Laboratuvarımızda stres gibi TSSB'ye maruz kalan farelerden toplanan çoklu beyin bölgelerinde transkripsiyonu değerlendirdik16 . Suş genetik arka planı<sup class="xr...

Beyin, omurilik ve retina ile birlikte, tüm vücutta uzmanlaşmış, hassas bir şekilde konumlandırılmış ve etkileşime giren hücre tipleri tarafından kontrol edilen karmaşık davranışları yürüten merkezi sinir sistemini içerir1. Beyin, milyarlarca birbirine bağlı nöron ve glia'nın sayısız işlevi yerine getiren hassas devrelere sahip karmaşık bir organdır. İki ayrı lob ve çeşitli hücresel bileşenlere sahip iki taraflı bir yapıdır2. Omurilik beyni dış dünyaya bağlar ve kemik, meninksler ve beyin omurilik sıvısı tarafından korunur ve mesajları beyne yönlendirir 2,3,4. Beynin yüzeyi, serebral korteks, düzensizdir ve gyri adı verilen farklı kıvrımlara ve beyni fonksiyonel merkezlere ayıran sulci adı verilen oluklara sahiptir5. Korteks, küçük bir beyne sahip memelilerde pürüzsüzdür 6,7. Farklı beyin bölgeleriyle ilgili bozuklukları ve fonksiyonel devrelerini anlamak için insan beyninin mimarisini karakterize etmek ve incelemek önemlidir. Sinirbilim araştırmaları son yıllarda genişlemiştir ve beynin yapısını ve işlevini incelemek için çeşitli deneysel yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler ve sistem düzeyinde biyoloji alanlarındaki gelişmeler, beyin yapıları ile moleküllerin işleyişi arasındaki karmaşık ilişkiyi araştırmak için yeni bir çağ başlatmıştır. Ek olarak, moleküler biyoloji, genetik ve epigenetik hızla genişlemekte ve sistemlerin nasıl işlediğine dahil olan temel mekanizmalar hakkındaki bilgimizi geliştirmemizi sağlamaktadır. Bu analizler, daha etkili tedavilerin araştırılmasını ve geliştirilmesini hedeflemeye yardımcı olmak için çok daha lokalize bir temelde gerçekleştirilebilir.
Memeli beyni yapısal olarak açıkça tanımlanabilir ayrı bölgelere tanımlanır; Bununla birlikte, bu ayrık yapıların fonksiyonel ve moleküler karmaşıklıkları henüz net olarak anlaşılamamıştır. Beyin dokusunun çok boyutlu ve çok katmanlı doğası, bu manzaranın işlevsel düzeyde incelenmesini zorlaştırmaktadır. Ek olarak, birden fazla fonksiyonun aynı yapı tarafından yerine getirilmesi ve bunun tersi de beynin anlaşılmasını daha da zorlaştırmaktadır8. Beyin bölgelerinin yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yürütülen deneysel yaklaşımın, nöroanatomik mimariyi fonksiyonla ilişkilendirmek için örneklemede tutarlılık sağlamak için hassas araştırma metodolojileri kullanması hayati önem taşımaktadır. Beynin karmaşıklığı son zamanlarda, 75 farklıhücre tipinden oluşan insan beyninin temporal girusu gibi 9,10 tek hücreli dizileme kullanılarak açıklanmıştır. Bu verileri fare beyninin benzer bir bölgesinden gelenlerle karşılaştırarak, çalışma sadece mimarilerinde ve hücre tiplerinde benzerlikler ortaya koymakla kalmıyor, aynı zamanda farklılıkları da sunuyor. Bu nedenle, karmaşık mekanizmaları çözmek için, beynin çeşitli bölgelerini tam hassasiyetle incelemek önemlidir. Bir insan ve fare beyni arasındaki korunmuş yapılar ve işlevler, bir farenin insan beyninin işlevini ve davranışsal sonuçlarını aydınlatmak için bir ön vekil olarak kullanılmasını sağlar.
Sistem biyolojisi yaklaşımlarının ilerlemesiyle birlikte, kemirgenlerde ayrık beyin bölgelerinden bilgi elde etmek, sinirbilim araştırmalarında kilit bir prosedür haline gelmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu12 gibi bazı protokoller pahalı olsa da, mekanik protokoller ucuzdur ve yaygın olarak bulunan araçlar kullanılarak gerçekleştirilir13,14. Transkriptomik tahliller için birden fazla beyin bölgesi kullandık15 ve fare beyninin ilgilendiği bölgeleri kısa sürede adım adım incelemek için uygulamalı ve hızlı bir prosedür geliştirdik. Disseke edildikten sonra, bu dokulardaki nükleik asitleri ve proteinleri korumak için bu numuneler hemen soğuk koşullarda saklanabilir. Yaklaşımımız daha hızlı gerçekleştirilebilir, bu da yüksek verimliliğe yol açar ve doku bozulması için daha az şans sağlar. Bu sonuçta, beyin dokularını kullanarak yüksek kaliteli, tekrarlanabilir deneyler üretme şansını arttırır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Beyin Kaldırma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deaver makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağazası</td><td>RS-6762</td><td>5.5" düz keskin/keskin</td></tr><tr><td>Deaver makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağazası</td><td>RS-6763</td><td>5.5" kavisli keskin/keskin</td></tr><tr><td>Hassas ameliyat makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağazası</td><td>RS-6703</td><td>4.75" kavisli keskin/keskin</td></tr><tr><td>Hassas ameliyat makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-6702</td><td>4.75" düz keskin/keskin</td></tr><tr><td>Hafif ameliyat makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-6753</td><td>5" kavisli Keskin/Keskin</td></tr><tr><td>Mikro spatula, yarıçap ve konik düz uçlar</td><td></td><td></td><td>paslanmaz çelik ayna kaplaması</td></tr><tr><td>Ameliyat makası 6.5"</td> <td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-6846</td><td>kavisli keskin/keskin</td></tr><tr><td>Doku forseps</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-8160</td><td>4.5 "1X2 diş 2mm uç genişliği</td></tr><tr><td>Rongeur (isteğe bağlı)</td> <td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-8321 seçmek için birçok stil</td><td>Lempert Rongeur 6.5 "2X8mm</td></tr><tr><td><güçlü>Hipofiz Diseksiyonu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Neşter sapı</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-9843</td><td>Neşter Sapı #3 Katı 4"</td></tr><tr><td>ve bıçaklar</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-9801-11</td><td>Steril Neşter Bıçakları: # 11 Kutu 100 40mm</td></tr><tr><td>Süper ince forseps Inox</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-4955</td><td>uç boyutu 0.025 X 0.005 mm</td></tr> <tr><td>< güçlü > Beyin Diseksiyonu < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A büyütme vizörü</td><td>Penn Tool Col</td><td>40-178-6</td><td>2.2x Dış ve 3.3x İç Lens Büyütme, Dikdörtgen Büyüteç</td></tr><tr><td>Diseksiyon soğuk plaka</td><td>Cellpath.com</td><td>JRI-0100-00A</td><td>Buzdağı soğuk plaka ve taban</td></tr><tr><td>Graefe forseps, tam eğri ekstra hassas</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-5138</td><td>0.5 mm Tip 4 " (10 cm) uzunluğunda</td></tr><tr><td>Hafif ameliyat makası</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-6753</td><td>5" kavisli keskin/keskin</td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-9843 (yukarıda tekrarlandı)</td><td>Neşter Sapı #3 Katı 4"</td></tr> <tr><td>ve bıçaklar (özellikle #11)</td><td>Roboz Cerrahi Mağaza</td><td>RS-9801-11 (yukarıda tekrarlandı)</td><td>Steril Neşter Bıçakları:#11 Kutu 100 40mm</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Amazon</td><td>MS-SQRD9-4</td><td>Çift Uçlu Spatula Kare VE Yuvarlak Uçlu</td></tr><tr><td>Doku forseps</td><td>Roboz Cerrahi Mağazası</td><td>RS-8160 (yukarıda tekrarlandı)</td><td>4.5" 1X2 dişler</td></tr></tbody></table>

fare beyninin İşlevsel ve anatomik olarak farklı bölgelere mikrodiseksiyonu

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

Beyin, memeli sinir sisteminin komuta merkezi ve muazzam yapısal karmaşıklığa sahip bir organdır. Kafatasının içinde korunan beyin, serebral korteks olarak bilinen yarımküreler üzerindeki gri cevherin dış kaplamasından oluşur. Bu katmanın altında, varoluş için önemli olan çoklu fenomenler için gerekli olan birçok başka özel yapı bulunur. Belirli brüt beyin bölgelerinin örneklerini elde etmek, hızlı ve hassas diseksiyon adımları gerektirir. Mikroskobik düzeyde, birçok alt bölgenin var olduğu ve muhtemelen bu diseksiyonun amacı için dayattığımız keyfi bölgesel sınırları aştığı anlaşılmaktadır.
Fare modelleri, insan beyninin fonksiyonlarını ve hastalıklarını incelemek için rutin olarak kullanılır. Gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, hastalıklı duruma bağlı olarak belirli bir fenotipi hedef alan belirli beyin bölgeleriyle sınırlı olabilir. Bu nedenle, transkripsiyonun düzenlenmesini iyi tanımlanmış yapısal organizasyonu açısından incelemek büyük önem taşımaktadır. Beynin tam olarak anlaşılması, farklı beyin bölgelerini incelemeyi, bağlantıları tanımlamayı ve bu beyin bölgelerinin her birinin faaliyetlerindeki temel farklılıkları tanımlamayı gerektirir. Bu farklı bölgelerin her birinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sinirbilim alanında yeni ve geliştirilmiş tedavilerin yolunu açabilir. Burada, fare beynini on altı farklı bölgeye ayırmak için adım adım bir metodolojiyi tartışıyoruz. Bu prosedürde, erkek fare C57Bl / 6J (6-8 haftalık) beyin çıkarılmasına ve nöroanatomik işaretleri kullanarak birden fazla bölgeye diseksiyonuna odaklandık. Bu çalışma, sinirbilim alanında güçlü bir temel oluşturmaya yardımcı olacak ve beyin fonksiyonunun daha derin anlaşılmasında daha odaklı yaklaşımlara yol açacaktır.

Karmaşık beyin yapısı ve işlevi hakkındaki anlayışımız hızla gelişiyor ve gelişiyor. Beyin birden fazla farklı bölge içerir ve moleküler bir harita oluşturmak, beynin nasıl çalıştığını daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem yazısında, fare beyninin birden fazla farklı bölgeye diseksiyonunu tartıştık (Tablo 1). Bu protokolde, yapılar kritik noktalara göre tanımlanır ve derhal diseksiyon için sağlamlığını koruyarak dokunun tuzlu su çözeltisi ile nemli tutulmasıyla elde edilir. Yöntem, diğer rapor...

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Farklı beyin bölgelerini incelemek, beynin moleküler ve yapısal karmaşıklığını anlamaya yönelik bir basamak taşıdır. Bu protokol, farklı beyin bölgelerini izole etmek için fare beyninin sistematik bir diseksiyonunu tanımlar. Beyin anatomisi perspektifinde, kolayca çoğaltılabilen yukarıdan aşağıya bir yaklaşımdır.Bu protokolün avantajları iki yönlüdür. İlk olarak, bu yaklaşım küçük ama kritik beyin bölgelerinin moleküler temellerini anlamak için bir fırsat sağlar. İkincisi, tüm bu diseksiyon süreci, sırt ve moleküler tahlillerin kritik bir ön koşulu olan moleküler bütünlüğün korunmasını sağlamak için yeterince kısadır.Bu prosedür pratik ve hassas kullanımı içerir. Yapısal dönüm noktalarını korumak için zamanlama burada çok önemlidir ve uygun eğitim ve uygulama ile elde edilebilir. Fare beyninin çıkarılması prosedürünü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma kimyageri ve biyoinformatikçi olan Seid Muhie olacak.Fare beyni diseksiyonu prosedürünü daha fazla gösteren, laboratuvarımızdan bir sinirbilimci olan James Meyerhoff olacaktır. Başlamak için, iyi bir kavrama için cildi temizleyin ve çıkarın. Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez kullanın.İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Daha sonra makasları, omuriliğin dikey olarak işaret eden bıçakla geçtiği kafatasının tabanının açıklığına yerleştirin, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine paralel ve bastırarak, bıçağı 45 derece sola ve daha sonra sağ tarafa döndürün. Beyinciği açığa çıkarmak için intraparietal kemikteki oksipital kemiği çıkarın.Makası orta sagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için yukarı doğru kaldırarak kesin. Parietal kemikler kaldırılırken, kalan meningeal ataşmanları tanımlayın ve kesin. Sagital düzlemde iki paralel kesim yapın ve beyin yüzeyinin yırtılmasını önleyerek ön kemiğin parçalarını çıkarın.Meningeal ataşmanları ve kraniyal sinirleri keserken, yerçekiminin beynin tuzlu su çözeltisi ile önceden doldurulmuş küçük bir kaba çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını ters çevirin. Hipofiz anatomisinin tanımlanabilir olması için işitsel boğayı sağlam tutun. Hipofizi yerinde tutan zarlı çadırın sırtında her iki tarafta da son derece küçük bir parasaggital kesim yapın ve hipofizin arka lobunu ultra ince forsepslerle kaldırın.En yakın trigeminal sinirde hipofiz ön lobunun lateral kenarları arasında sagital bir kesim yapın, ardından hipofizin ön lobunu kaldırın. Beyaz ışık kaynağını doku üzerine yönlendirin. Beyni önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisinde buzla çevreleyerek bloğu soğuk tutun.Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin. Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, beyinciği çıkarın.Dorsal yaklaşımı kullanarak, küçük bir kavisli forsepsin kapalı bıçaklarını korpus kallozumun altına kaydırın ve kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Nihai olarak, optik kiazm, hipotalamus, koku alma ampulleri, medulla oblongata, hipofiz stoğu ve pontin köprüsü gibi yapılar görülebilir. Yarımküreleri ayırmayı deneyin.Beyin ventral bölgesini yukarı çevirin ve serebral yarımkürelerdeki koku alma ampulleri arasındaki dorsumdan başlayarak orta sagital bir kesim yapın. Medullayı çıkarın ve ardından iki yarım küreyi yavaşça ayırın. Daha sonra, arka beyni elde etmek için havuzların iç kenarında koronal bir kesim yapın ve medullayı göletlerin arka kenarından ayırın.İki serebral yarımkürenin dikkatli bir şekilde ayrılması için beyin dokusunu çevirin. Bu adımda koku alma ampulünü çıkarın. Korpus kallozumun cinsinin bir milimetre önünde bir koronal kesim yapın ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından medial ve lateral prefrontal korteksi ayırın.Septal çekirdeği dorsal olarak ve ventral striatum ventrallisini serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay veya koronal olarak kısmen kesilir. Çekirdek yenik ve koku tüberkülünü çıkarmak için az miktarda korteksi lateral yüzeyden çıkarın. Korpus striatumun rostral kısmını, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli bir neşter ile üstteki korteksten ayırın.Septal çekirdekleri veya septumu tanımlayın ve bunları bu bölümden izole edin. Bu adımda hipotalamusu ayırmak için kavisli bir kesim yapın. Bu, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanan memeli cisimlerine posterior kısmi bir koronal kesim kullanılarak yapılacaktır.Daha sonra hipotalamus kesitini, hipotalamik sulkus uzunluğu boyunca parasagital bir kesimle serbest bırakın. Kalan limbik sistem bileşenlerinde ek intralimbik bağlantılar ortaya çıkarmak için lateral ventrikülü kullanın. İç korteksin iç kısmında, ventrikül açıldıktan sonra fan benzeri bir yapı gözlenir.Diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için entorinal korteksteki fan benzeri yapıyı kullanın, ardından amigdala, entorinal korteks, posterior singulat korteks ve hipokampusu tanımlayın ve çıkarın. Orta hat rostral kortikal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden koronal bir kesikle tamamen ayırın.Bu protokol, beynin kafatasından derhal çıkarılması ve ardından diseksiyon için kullanılabilir. Disseke edilen dokular, çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak daha sonra korunabilir ve işlenebilir. Birden fazla disseke dokudan ekstrakte edilen RNA, gen ekspresyonu için test edilebilir.Temsili sonuçlar, RNA ekstraksiyonundan önce birkaç ay boyunca eksi 80 santigrat derecede depolanan hasat edilmiş beyinler kullanılarak elde edildi. Ağırlık verileri ile birlikte farklı beyin bölgeleri, saldırgan TSSB'nin sosyal stres modeline maruz kalan çalışma kapsamında toplanmıştır. RNA konsantrasyonları ve spektrofotometrik okumalar burada gösterilmiştir.Bu protokolü izlerken, beyni buzlu çelik bir blok üzerinde tutarak ve dokuyu periyodik olarak buzlu salin ile doldurarak dokuların her zaman soğutulmasını sağlayın. Dokular toplandıktan ve hemen dondurulduktan sonra, daha sonra transkriptomik, metabolomik ve proteomik gibi tahliller için kullanılabilirler.

microdissection-mouse-brain-into-functionally-anatomically-different

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Bu video, Bis-sülfosüksinimidil suberat veya BS3 kullanılarak nöronal yüzey proteinlerinin çapraz bağlanmasını göstermektedir. İzole edilmiş ve soğutulmuş fare beyni koronal olarak bölümlere ayrılmıştır. İstenilen bölge bölümlerden çıkarılır, kıyılır ve BS3 ile muamele edilir. BS3, GABA reseptörleri gibi yüzey proteinlerini çapraz bağlar ve iç proteinleri değiştirmeden bırakır. Reaksiyon, daha fazla analiz için numuneler işlenmeden önce glisin ile söndürülür.

Kimyasal Çapraz Bağlama Testi Kullanılarak Fare Beynindeki Nöronal Yüzey Proteinlerinin Çapraz Bağlanması

Bu videoda, aşağı akış analizleri için donmuş fare beyin dokusu kesitlerinin hazırlanmasına yönelik ayrıntılı bir adım adım protokol gösterilmektedir.

Aşağı akış analizi için bir fare beyninin işlenmesi

Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Kriyo-kesit diseksiyonu, derin nicel proteom analizi için murine beynindeki en büyük nörojenik nişin taze ve donmuş hazırlanmasını sağlar. Yöntem kesin, verimlidir ve minimum doku pertürbasyonuna neden olur. Bu nedenle, bu nişin moleküler mikroçevriminin yanı sıra diğer organların, bölgelerin ve türlerin incelenmesi için idealdir.

Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

Öğrenin fare beyninin mikrodiseksiyon protokolünü; hipotalamus, hipokampus ve amigdala gibi işlevsel ve anatomik olarak farklı bölgeleri izole etmek için. Bu yöntem moleküler bütünlüğü koruyarak transkriptomik analizler için yüksek kaliteli doku örnekleri sağlar.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

Daha fazla video keşfet