Name: Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Keşfedin, konfokal mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme yöntemiyle mezenkimal kök hücrelerin Corti organına göçünü nasıl izleyeceğinizi. Bu teknik, kök hücre hedefleme verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu'ndan (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

ICR farelerini içeren tüm araştırma protokolleri Wonju Tıp Fakültesi'ndeki Yonsei Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları'na göre gerçekleştirildi. Bu protokolde, hamile ICR fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık bir döngüde tutuldu.
1. Koklea diseksiyonu
<ol><li>Ultraviyole ışığını ~30 dakika açarak laminer akış dokusu kültür davlumbazını sterilize edin ve kullanmadan önce tüm yüzeyleri% 70 etanol ile püskürtün. Yüzeylerin kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca% 70 etanol içine yerleştirin ve kullanmadan önce kurutun.</li>
	<li>Doğum sonrası 3-4 günlük farelerin kafasını kesmek için bir çalışma bıçağı kullanın (Şekil 2A).</li>
	<li>Kafatasını laminer akış başlığına bir stereomikroskopun altına yerleştirin ve dokuyu% 70 etanol içine batırın.</li>
	<li>Etanol çıkarmak için dokuyu doku diseksiyon çözeltisine (1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mM HEPES) hızlı bir şekilde batırın.</li>
	<li>Kafatasının orta çizgisini cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 2B,C).</li>
	<li>Cildi ön olarak aşağı çekerek ve kulağın dış işitsel kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın (Şekil 2D).</li>
	<li>Ön kısımdan kafatasının arka kısmına göz çizgisi boyunca kesin (Şekil 2E).</li>
	<li>Kafatasını açın ve künt forps ile beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın (Şekil 2F,G).</li>
	<li>Mikro kümes uçlarını kullanarak kokleayı temporal kemikten ayırın (Şekil 2H).</li>
	<li>Kokleayı doku diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Koklear otik kapsülün tümünü dikkatlice parçalara ayırın, sadece iç koklear yumuşak doku bırakın(Şekil 2I,J).</li>
	<li>Kokleanın modiolularını başka bir çift asa ile kümes ve koklear kanal ile tutun ve iki dokuyu yavaşça ayırın (Şekil 2K).</li>
	<li>Stria vascularis ve tectorial membranları nazikçe soyup çıkararak çıkarın (Şekil 2L,M).</li>
	<li>Sterilize edilmiş bir plastik kapak kapağını yeni doku diseksiyon çözeltisine yerleştirin ve ardından Basilar zarının aşağı doğru yüzleştiğinden emin olarak Corti organını 9 mm çapında bir kapak kapağına yerleştirin (Şekil 2N-P).</li>
	<li>Reissner'ın zarını ve kalan modiolus dokusunups ile kapak kılıfına bastırarak dokuyu hareketsiz hale verin (Şekil 2N-P).</li>
	<li>Gömülü doku ile kapak sapını 35 mm çapındaki bir konfokal kabın ortasına aktarın.</li>
	<li>Cam klonlama silindirini, koklear eksplant ile çanağın ortasına yerleştirin ve silindirin içine 100 μL eksizyon kültürü ortamı (DMEM / F12,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 N2 takviyesi, ampisilin (10 μg / mL))10 ekleyin (Şekil 2Q).</li>
	<li>Plaka 5 ×10 3 hücre fare kemiği iliği türevi yeşil floresan protein (GFP)-etiketli MSC'ler 2 mL kültür ortamında (E DMEM + E DMEM/F12, FBS, %1 N2 takviyesi, 10 μg/mL ampisilin) cam silindirin dışında (Şekil 2R).<ol>
<li>MSC'ler % 80-90 birleştiğinde, tripin-etilenediamin tetraasetik asit ile ayırarak bunları geçiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokal kabı dikkatlice nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın ve % 5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamı aspire edin ve ardından cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.</li>
	<li>Konfokal yemeğe 2 mL taze kültür ortamı ekleyin ve doku kültürü çanağini analize hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Şekil 2. Bir fare kokleasının diseksiyonu ve Corti ve MSC organlarının kokültürü. (A) Farenin kafasının kesilmesi, (B) ve (C) başın orta çizgi sagittal diseksiyonu, (D) ve (E) beynin koronal diseksiyonu, (F) ve (G) beyin ve temporal kemiğin çıkarılması, (H) koklea, (I) kemik koklear duvarının çıkarılması, (J) koklear kanalın modiolustan ayrılması, (L) stria vascularis (SV) ve spiral ligamentin (SL) Corti'nin organından ayrılması, (M) tectorial membranının çıkarılması, (N-P) kokleanın plastik bir kapak kaymasına sabitlenmesi, (Q) konfokal çanaktaki kapak ve cam silindirin yeri, (R) MSC'lerin aşılanması. Beyaz ölçek çubuğu (A-E) = 1 cm; turuncu (F, G, P) ve sarı ölçek çubuğu (H,I) = 1 mm; yeşil ölçek çubuğu (J-O) = 0,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Zaman atlamalı görüntüleme
<ol><li>Burada sunulan deneyler için, sahne üstü inkübatör sistemine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.</li>
	<li>Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.</li>
	<li>Konfokal mikroskop sahnesine yerleştirilen sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 °C ve %5 CO2 atmosfere ayarlayın.</li>
	<li>Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, bulaşık sabitleme kapağıyla örtün ve odayı üst ısıtıcı kapağıyla kapatın.</li>
	<li>Corti ve MSC'lerin organını görüş alanında yerelleştirmek için yakınlaştırmayı ve odağı ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20x Plan-Apochromat hedefi (sayısal diyafram 0,8) ve 0,5x kırpma alanıseçin.</li>
	<li>Edinmealtında, akıllı kuruluma tıklayın ve EGFP'yi seçin.</li>
	<li>Satın Almaaltındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü% 0.2, iğne deliğini 44 μm, ana kazancı 750 Vve dijital kazancı 1.0olarak ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme kurulumualtında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını 4'e ve dijital kazancı 7,5olarak ayarlayın.</li>
	<li>210 fayans üretmek için Fayans ve kazık tıklayın.</li>
	<li>Odak stratejisini açın ve odak modunuseçin.</li>
	<li>Zaman serisialtında, süreyi 24 saat ve aralığı 10 dk olarak ayarlayın.</li>
	<li>Edinmealtında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını 8, yönü çift yönlü, ortalamayı 4xve piksel başına bitleri 16olarak ayarlayın.</li>
	<li>Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın.</li>
</ol>3. Görüntü dosyası değişikliği
<ol><li>İşlemealtında, dikişetıklayın ve minimum kaplamayı% 5'e ve maksimum kaymayı% 10'aayarlayın.</li>
	<li>Film dışa aktarma, sıkıştırılmamışolarak ayarlayın ve hızı 7,5olarak ayarlayın.</li>
</ol>4. İmmünasyon
<ol><li>Ortamı dikkatlice emiş edin ve numuneyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>Örneği PBS'de %4 formalin ile 15 dakika sabitlayın ve numuneyi PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Numuneyi PBS'de %0,1 Triton X-100'de 10 dakika permeabilize edin ve 5 dakika pbs ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>250 μL phalloidin-iFluor 647 reaktifi (PBS'de 1:1000 seyreltme) ekleyin ve numuneyi çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneyi PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Kapak kapağını cam slayda aktarın ve 2 damla montaj çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Slayda hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin.</li>
	<li>Kapak kapağını berrak oje ile kapatın ve hücreler gözlemlenene kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Slaydı, phalloidin için 650/665 nm ve EGFP için Ex/Em=488/507 nm'de uygun bir filtreye sahip bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hasarlı hücrelerin yenilenmesini teşvik etmek için MSC'lerin hasarlı bölgelere nakli kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve terapötik etki açıktır. MSC'lerin transplantasyonu ve daha sonra farklılaşması, 3-nitropropionik asit13tarafından indüklenen işitme kaybı olan sıçanlarda işitmeyi geri getirdiği bildirilmiştir. Lee ve arkadaşları insanlara trans-venöz olarak MSC'ler uygulamış olsalar da, işitmede önemli bir iyileşme sağlayamadılar14. Yakın zamana kadar MSC transplantasy...

İşitme kaybı doğuştan ortaya çıkabilir veya yaşlanma, ilaçlar ve gürültü de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden giderek kaynaklanabilir. İşitme kaybı genellikle tedavi etmek zordur, çünkü işitmeden sorumlu saç hücreleri hasar gördükten sonra bozulmuş işlevi geri yüklemek çok zordur1<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank"></a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Tampon</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>%4 Formalin T</td><td>& Ben</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>konfokal çanak</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop ve nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>lamel</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher bilimsel</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>DAPI sigma ile Fluorsheild</td><td>&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher bilimsel</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher bilimsel</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 Reaktif</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Sahne Üst İnkübatör</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Suşu C57BL / 6 fare messenkimal kök hücreleri GFP</td><td>siyajen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma ve nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

corti organına doğru hücre göçünü keşfetmek için tüp bebek zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Mezenkimal kök hücrelerin (MSC' ler) hücre yenilenmesi ve tedavisi üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntem koklear epitel ile birlikte kültürden sonra MSC göç ve morfolojik değişiklikleri izler. Corti'nin organı, reissner'ın diseksiyon sırasında üretilen zarının bir kısmına basılarak plastik bir kapak kapağı üzerinde hareketsiz hale getirildi. Cam silindirle sınırlı olan MSC'ler, silindir çıkarıldığında koklear epitellere doğru göç etti. Baskın lokalizasyonları, Corti organının modiolusunda, sinir liflerine benzer bir yönde hizalanmış olarak gözlendi. Bununla birlikte, bazı MSC'ler limbus bölgesinde lokalize edildi ve yatay olarak uzatılmış bir şekil gösterdi. Ayrıca saç hücresi bölgesine göç arttırıldı ve kanamycin tedavisinden sonra MSC'lerin morfolojisi çeşitli formlara dönüştü. Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları, KOKLEAR epitel ile MSC'lerin kokültürünün hücre nakli yoluyla terapötiklerin gelişimi ve çeşitli durumları ve faktörleri inceleyebilen hücre yenilenmesi çalışmaları için yararlı olacağını göstermektedir.

MSC'lerin üç boyutlu modda in vitro geçişi, iki boyutlu (2D) mod11'degeçişi gözlemlemek için bir Transwell sistemi veya geleneksel yara iyileştirme yöntemi ile değerlendirilmiştir. Corti'nin organı Boettcher hücreleri, Claudius hücreleri, Deiters hücreleri, sütun hücreleri, Hensen hücreleri, dış saç hücreleri, iç saç hücreleri, sinir lifleri, basilar membran ve retiküler lamina12gibi çeşitli hücrelerden oluşan karmaşık bir yapıdır. MSC'ler b...

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

MSC'lerin migrasyonunu araştırmak için mevcut in vitro yöntem Transwell veya yara iyileşme protokollerini içerir. Burada açıklanan yöntem, MSC'lerin eksplanta göçünü gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir. Eksplant kültürü açısından, bu yöntemin diğerlerine göre avantajı, zaman ve maliyette bir azalma sağlamasının yanı sıra deneysel adımların basitleştirilmesini sağlamasıdır.Bu teknik, hedefe yönelik kök hücre hedeflemesini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için kullanılabilir ve bu da optimize edilmiş hedef arama verimliliğine sahip modellerin geliştirilmesine yol açar. Tektoryal membranın çıkarılması deneyimsiz araştırmacılar için zordur. Geliştirme aşamasına bağlı olarak, tektoryal membranın çıkarılması için doğru zamanın anlaşılması bu protokolün başarısı için önemlidir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan araştırmacı profesörler olan Dr.Jeong-Eun Park ve Dr.Su Hoon Lee olacak. Ultraviyole ışığı yaklaşık 30 dakika açarak laminer akış doku kültürü başlığını sterilize ederek başlayın. Kullanmadan önce tüm yüzeylere %70 etanol püskürtün ve kurumasını bekleyin.Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca %70 etanol içine yerleştirin, ardından kullanmadan önce kurutun. Üç ila dört günlük bir farenin kafasını kestikten sonra, önünü %70 etanole batırın ve laminer akış başlığında seri mikroskop altına yerleştirin. Etanolü çıkarmak için dokuyu hızlı bir şekilde doku diseksiyon solüsyonuna batırın.Cerrahi bıçakla kafatasının orta çizgisini kesin, ardından cildi öne doğru çekerek ve kulağın dış kulak kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın. Göz çizgisi boyunca kafatasının ön kısmından arka kısmına doğru kesin, ardından kafatasını açın ve künt forseps ile ön beyni, beyinciği ve beyin sapını çıkarın. Mikroforseps kullanarak, kokleayı temporal kemikten ayırın ve doku diseksiyon solüsyonu içeren bir Petri kabına aktarın.Koklear otik kapsülün tamamını dikkatlice inceleyin ve geriye sadece iç koklear yumuşak doku kalacak şekilde çıkın. Kokleanın modiolusunu forseps ile ve koklear kanalı başka bir forseps çifti ile tutun, ardından iki dokuyu yavaşça ayırın. Stria vaskülaris ve tektoriyal membranı nazikçe soyarak çıkarın.Yeni doku diseksiyon solüsyonuna sterilize edilmiş plastik bir lamel yerleştirin, ardından baziler membranın aşağı baktığından emin olarak Corti organını lamel üzerine yerleştirin. Reissner zarını ve kalan modiolus dokusunu forseps ile lamel üzerine bastırarak dokuyu hareketsiz hale getirin. Lameli gömülü doku ile birlikte 35 milimetrelik konfokal bir çanağın ortasına aktarın.Cam klonlama silindirini, koklear eksplant tabağın ortasına gelecek şekilde tabağın üzerine yerleştirin ve silindire 100 mikrolitre eksplant kültür ortamı ekleyin. 5.000 kemik iliğinden türetilmiş GFP etiketli mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri cam silindirin dışındaki iki mililitre kültür ortamına yerleştirin ve kabı inkübatöre koyun. Hücreleri metin el yazmasında anlatıldığı gibi kültürledikten sonra, silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamları aspire edin ve cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.Yemeğe iki mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Analiz için hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Sahne üstü inkübatörlü bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın. Sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit atmosferine ayarlayın. Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, çanak sabitleme kapağı ile örtün ve hazneyi üst ısıtıcı kapağı ile kapatın.Görüş alanındaki Corti ve MSC'lerin organını lokalize etmek için yakınlaştırmayı ve odaklamayı ayarlayın. Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20X plan-apokromat objektif veya sayısal açıklık 0.8 ve 0.5X kırpma alanı seçin.Edinme altında, akıllı kurulum'a tıklayın ve EGFP'yi seçin. Edinme altındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü %0,2'ye, iğne deliğini 44 mikrometreye, ana kazancı 750 volta ve dijital kazancı 1,0'a ayarlayın. Görüntüleme kurulumu altında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını dörde ve dijital kazancı 7.5'e ayarlayın.Karolara tıklayın ve 210 karo üretmek için bahis yapın. Odak stratejisini açın ve odak modunu seçin. Zaman serisi'nin altında süreyi 24 saat ve aralığı 10 dakika olarak ayarlayın.Edinme altında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını sekiz, yönü çift yönlü, ortalamayı 4X ve piksel başına bit sayısını 16 olarak ayarlayın. Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın. Mezenkimal kök hücrelerin veya MSC'lerin iki boyutlu yolu, MSC'ler ile Corti organı arasında bir bariyer olarak bir cam silindir kullanılarak bir yara iyileşme yönteminde izlendi.Corti organı kültürlendiğinde, fibroblastlar en dış tabakadaki dış saç hücrelerinden çok hızlı bir şekilde dışarı doğru büyüdü. GFP etiketli MSC'lerin çoğu, hızlı büyüyen fibroblastlar tarafından dışarı itildi. Bununla birlikte, bazıları fibroblast tabakasına nüfuz etti ve başarılı bir şekilde Corti organına göç etti.72 saatlik inkübasyondan elde edilen sonuçlar, MSC'lerin Corti organına göç ettiğini ve esas olarak modiolus ve koklear sinir liflerinin modiolden ayrıldığı alanda lokalize olduğunu gösterdi. MSC'lerin morfolojisi, sinir liflerininkine benzer radyal bir şekle değiştirildi. Hücreler, saç hücresi alanından ziyade limbus çizgisi boyunca doğrusal bir şekle dönüştürüldü.MSC'ler, çeşitli hücre katmanlarına ve fiziksel bariyerlere nüfuz ederek sinir lifi toplama alanında göç edebildi ve büyüyebildi. Kanamisin ile 16 saatlik bir tedavi ile saç hücrelerine zarar verildiğinde ve hücreler kanamisinin çıkarılmasından sonra 72 saat daha kültürlendiğinde, MSC'ler sadece modiolde değil, aynı zamanda dış saç hücrelerinde de lokalize edildi. Dokunun hareketsiz hale getirilmesi bu protokolde önemli bir adımdır ve Corti'nin organı bağlanır.Kolay kolay düşmez. Bu, başarılı bir eksplant kültürü için önemsiz ama yararlı bir ipucudur. Bu yöntem, MSC'lerden salgılanan eksozomların etkinliğini incelemek için uyarlanabilir.

in-vitro-time-lapse-live-cell-imaging-to-explore-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Keşfedin, konfokal mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme yöntemiyle mezenkimal kök hücrelerin Corti organına göçünü nasıl izleyeceğinizi. Bu teknik, kök hücre hedefleme verimliliğini artırır.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Daha fazla video keşfet