Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

MSC'lerin migrasyonunu araştırmak için mevcut in vitro yöntem Transwell veya yara iyileşme protokollerini içerir. Burada açıklanan yöntem, MSC'lerin eksplanta göçünü gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılabilir. Eksplant kültürü açısından, bu yöntemin diğerlerine göre avantajı, zaman ve maliyette bir azalma sağlamasının yanı sıra deneysel adımların basitleştirilmesini sağlamasıdır.

Bu teknik, hedefe yönelik kök hücre hedeflemesini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için kullanılabilir ve bu da optimize edilmiş hedef arama verimliliğine sahip modellerin geliştirilmesine yol açar. Tektoryal membranın çıkarılması deneyimsiz araştırmacılar için zordur. Geliştirme aşamasına bağlı olarak, tektoryal membranın çıkarılması için doğru zamanın anlaşılması bu protokolün başarısı için önemlidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan araştırmacı profesörler olan Dr.Jeong-Eun Park ve Dr.Su Hoon Lee olacak. Ultraviyole ışığı yaklaşık 30 dakika açarak laminer akış doku kültürü başlığını sterilize ederek başlayın. Kullanmadan önce tüm yüzeylere %70 etanol püskürtün ve kurumasını bekleyin.

Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca %70 etanol içine yerleştirin, ardından kullanmadan önce kurutun. Üç ila dört günlük bir farenin kafasını kestikten sonra, önünü %70 etanole batırın ve laminer akış başlığında seri mikroskop altına yerleştirin. Etanolü çıkarmak için dokuyu hızlı bir şekilde doku diseksiyon solüsyonuna batırın.

Cerrahi bıçakla kafatasının orta çizgisini kesin, ardından cildi öne doğru çekerek ve kulağın dış kulak kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın. Göz çizgisi boyunca kafatasının ön kısmından arka kısmına doğru kesin, ardından kafatasını açın ve künt forseps ile ön beyni, beyinciği ve beyin sapını çıkarın. Mikroforseps kullanarak, kokleayı temporal kemikten ayırın ve doku diseksiyon solüsyonu içeren bir Petri kabına aktarın.

Koklear otik kapsülün tamamını dikkatlice inceleyin ve geriye sadece iç koklear yumuşak doku kalacak şekilde çıkın. Kokleanın modiolusunu forseps ile ve koklear kanalı başka bir forseps çifti ile tutun, ardından iki dokuyu yavaşça ayırın. Stria vaskülaris ve tektoriyal membranı nazikçe soyarak çıkarın.

Yeni doku diseksiyon solüsyonuna sterilize edilmiş plastik bir lamel yerleştirin, ardından baziler membranın aşağı baktığından emin olarak Corti organını lamel üzerine yerleştirin. Reissner zarını ve kalan modiolus dokusunu forseps ile lamel üzerine bastırarak dokuyu hareketsiz hale getirin. Lameli gömülü doku ile birlikte 35 milimetrelik konfokal bir çanağın ortasına aktarın.

Cam klonlama silindirini, koklear eksplant tabağın ortasına gelecek şekilde tabağın üzerine yerleştirin ve silindire 100 mikrolitre eksplant kültür ortamı ekleyin. 5.000 kemik iliğinden türetilmiş GFP etiketli mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri cam silindirin dışındaki iki mililitre kültür ortamına yerleştirin ve kabı inkübatöre koyun. Hücreleri metin el yazmasında anlatıldığı gibi kültürledikten sonra, silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamları aspire edin ve cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.

Yemeğe iki mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Analiz için hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Sahne üstü inkübatörlü bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.

Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın. Sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit atmosferine ayarlayın. Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, çanak sabitleme kapağı ile örtün ve hazneyi üst ısıtıcı kapağı ile kapatın.

Görüş alanındaki Corti ve MSC'lerin organını lokalize etmek için yakınlaştırmayı ve odaklamayı ayarlayın. Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20X plan-apokromat objektif veya sayısal açıklık 0.8 ve 0.5X kırpma alanı seçin.

Edinme altında, akıllı kurulum'a tıklayın ve EGFP'yi seçin. Edinme altındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü %0,2'ye, iğne deliğini 44 mikrometreye, ana kazancı 750 volta ve dijital kazancı 1,0'a ayarlayın. Görüntüleme kurulumu altında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını dörde ve dijital kazancı 7.5'e ayarlayın.

Karolara tıklayın ve 210 karo üretmek için bahis yapın. Odak stratejisini açın ve odak modunu seçin. Zaman serisi'nin altında süreyi 24 saat ve aralığı 10 dakika olarak ayarlayın.

Edinme altında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını sekiz, yönü çift yönlü, ortalamayı 4X ve piksel başına bit sayısını 16 olarak ayarlayın. Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın. Mezenkimal kök hücrelerin veya MSC'lerin iki boyutlu yolu, MSC'ler ile Corti organı arasında bir bariyer olarak bir cam silindir kullanılarak bir yara iyileşme yönteminde izlendi.

Corti organı kültürlendiğinde, fibroblastlar en dış tabakadaki dış saç hücrelerinden çok hızlı bir şekilde dışarı doğru büyüdü. GFP etiketli MSC'lerin çoğu, hızlı büyüyen fibroblastlar tarafından dışarı itildi. Bununla birlikte, bazıları fibroblast tabakasına nüfuz etti ve başarılı bir şekilde Corti organına göç etti.

72 saatlik inkübasyondan elde edilen sonuçlar, MSC'lerin Corti organına göç ettiğini ve esas olarak modiolus ve koklear sinir liflerinin modiolden ayrıldığı alanda lokalize olduğunu gösterdi. MSC'lerin morfolojisi, sinir liflerininkine benzer radyal bir şekle değiştirildi. Hücreler, saç hücresi alanından ziyade limbus çizgisi boyunca doğrusal bir şekle dönüştürüldü.

MSC'ler, çeşitli hücre katmanlarına ve fiziksel bariyerlere nüfuz ederek sinir lifi toplama alanında göç edebildi ve büyüyebildi. Kanamisin ile 16 saatlik bir tedavi ile saç hücrelerine zarar verildiğinde ve hücreler kanamisinin çıkarılmasından sonra 72 saat daha kültürlendiğinde, MSC'ler sadece modiolde değil, aynı zamanda dış saç hücrelerinde de lokalize edildi. Dokunun hareketsiz hale getirilmesi bu protokolde önemli bir adımdır ve Corti'nin organı bağlanır.

Kolay kolay düşmez. Bu, başarılı bir eksplant kültürü için önemsiz ama yararlı bir ipucudur. Bu yöntem, MSC'lerden salgılanan eksozomların etkinliğini incelemek için uyarlanabilir.