Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon
7 Kasım 2020
PCD tanısı için başarılı ve yüksek kaliteli siliyer fonksiyonel analizi garanti etmek için, solunum epitel örneklemesi ve işlenmesi için hassas ve dikkatli bir yöntem şarttır. COVID-19 pandemisi sırasında PCD tanı hizmeti vermeye devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü uygun enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde güncellenmiştir.
Yayınlanmış resmi işletim prosedürlerinin ve standardizasyonun olmaması, dijital yüksek hızlı video mikroskopisinin primer siliyer diskinezi için doğrulayıcı bir tanı testi olarak kabul edilmesini engellemektedir. Ayrıca, bu COVID-19 krizi sırasında bir teşhis hizmeti sunmaya devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü yeterli enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde uyarlanmıştır. Dijital yüksek hızlı videomikroskopi kullanılarak yapılan siliyer fonksiyonel değerlendirme, primer siliyer diskinezi tanısı için oldukça hassas ve spesifiktir.
Diğer primer siliyer diskinezi tanı testleriyle karşılaştırıldığında, dijital yüksek hızlı videomikroskopinin gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır, ucuzdur ve sonuçlar gün içinde mevcut olabilir. Dijital yüksek hızlı videomikroskopi, primer siliyer diskinezi tanısı için daha yüksek bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir. Şu anda, sadece elektron mikroskobu ve genetik testler primer siliyer diskinezi için doğrulayıcı testler olarak kabul edilmektedir, ancak bu testler hastaların% 15 ila 30'unda primer siliyer diskinezi tanısını kaçıracaktır.
Burun fırçalama prosedürünü gösteren, laboratuvarımdan bir KBB asistanı olan Lionel Benchimol olacak. Burun örneğini almadan önce hastanın burnunu sümkürmesini sağlayın. Burun pasajlarını temizledikten sonra, hastanın başı geriye doğru gelecek şekilde rahatça yatmasını veya oturmasını sağlayın.
Fırçayı nemlendirmek için takviye edilmiş Medium 199'da sallayın ve alt burun konkasını görselleştirmek için burun girişine bir endoskop yerleştirin. Sitoloji fırçasını burnun içine yerleştirin ve geri çekmeden önce fırçayı alt burun konkasının arka kısmı üzerinde birkaç kez arkaya ve arkaya doğru hareket ettirin. Fırçayı bir M199 tüpüne yerleştirin.
Teli, tüpün içine tamamen sığacak şekilde kesin ve hemen tüpü kapatın. Ardından, numuneyi hava geçirmez bir çift torbaya koyun. Numune alındıktan sonraki dokuz saat içinde, numune tüplerini bir mikrobiyolojik güvenlik kabininde açın ve toplanan epitel şeritlerini çıkarmak için fırçayı çalkalamak için Weil-Blakesley nazal forsepslerini kullanın.
Bir cam kızağa çift taraflı bir ara parça yapıştırın ve ara parçadan korumayı çıkarın. Kirpiklerin tüp boyunca yayılmasına izin vermek için tüpü hafifçe sallayın ve yaklaşık 60 mikrolitre siliyer epiteli tüpün ortasından ara parçaya aktarmak için bir pipet kullanın. Hazneyi kapatmak için ara parçanın üzerine 22 x 4 milimetrelik dikdörtgen bir kapak sürgüsü yerleştirin ve sürgüyü mikrobiyolojik güvenlik kabininden çıkarmadan önce %70 etanol ile dezenfekte edin.
Eldivenleri değiştirdikten sonra, bu sürgüyü ısıtılmış bir kutunun plakasına yerleştirin ve kapağı kapatın. Yağa daldırma hedefine yağ ekleyin ve kutuyu dik veya ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu sahnesine yerleştirin. Kutuyu ve lens ısıtıcısını açın ve kutu ve lens ısıtıcı denetleyicilerindeki sıcaklık ayarlarını yapın.
Beş dakika sonra, objektifi lensin ucuyla kapak kızağına değene kadar konumlandırın. Numunenin solunumla kirpikli kenarlarını görselleştirmek için kamera yazılımını açın, ardından numune içindeki hücreleri manuel olarak bulmak ve hücreleri monitöre yansıtmak için mikroskop objektifini kullanın. Görüntünün monitörde görünür olup olmadığını kontrol edin ve görüntünün kalitesini artırmak için kondansatörü ve lens odağını gerektiği gibi ayarlayın.
Kirpikli epitel şeritleri yerleştirildiğinde, yalnızca en az 50 mikron uzunluğunda olan sağlam, bozulmamış kirpikli epitel kenarlarını seçin. Siliyer fonksiyonel analiz için yalnızca normal kenarları veya küçük çıkıntıları olan kenarları kullandığınızdan ve büyük çıkıntıları olan kirpikli kenarları ve izole edilmiş kirpikli hücreleri veya kendileriyle başka herhangi bir hücre tipi arasında teması olmayan tek hücreleri dışladığınızdan emin olun. İyi bir kenar seçildiğinde, çırpınan kirpik kenarını yaklaşık iki saniye boyunca kaydetmek için saniyede 500 karelik bir kamera kare hızı kullanın.
Yandan görünümde en az altı iyi kenar kaydettikten sonra, sürgüyü ısıtılmış kutudan çıkarın ve sürgüyü, kapak kızağını ve ara parçayı hava geçirmez bir torbaya yerleştirin. Ardından eldivenleri ve maskeyi çantaya yerleştirin ve çantayı uygun tehlikeli tıbbi atık kabına yerleştirin. Siliyer atım frekansını analiz etmek için, kaydı uygun bir video analiz yazılım programında açın ve kirpikli kenarları yaklaşık beş bitişik yaklaşık 10 mikronluk alana bölün.
Kenar başına maksimum 10 siliyer vuruş frekansı ölçümü elde etmek için kirpikleri veya kirpik gruplarını azaltılmış kare hızında ve alan başına maksimum iki siliyer vuruş frekansı ölçümünde tanımlayın ve görselleştirin. Bir kirpik grubunun beş vuruş döngüsünü tamamlaması için gereken kare sayısını kaydedin ve siliyer vuruş frekansını hesaplamak için formülü kullanın. Bir numune içindeki her bir farklı siliyer atım modelinin yüzdesini belirlemek için, her bir kirpik veya kirpik grubu için, tam bir atım döngüsü sırasında kirpikler tarafından alınan kesin yolu, dijital yüksek hızlı video mikroskopi analizinde gözlemlenen normal siliyer atım modeli ile karşılaştırın.
Analiz edilen her kirpik veya kirpik grubuna normal, sert, hareketsiz, asenkron veya diskinetik ve dairesel gibi farklı bir siliyer atım paterni atfedin. Ardından, her bir örnekteki her bir farklı siliyer atım modelinin yüzdesini hesaplayın. Örneğe atfedilen siliyer atım modeli, gözlemlenen baskın siliyer atım paternidir.
Burada, 14 yetişkin gönüllünün burun fırçalama örneklerinden elde edilen ayrıntılı siliyer fonksiyonel analiz sonuçları gözlemlenmektedir. Bu 14 burun fırçalama örneğinden 242 kirpikli kenar kaydedildi ve 212'si analiz için tanımlanan dahil etme kriterlerini karşıladı. Analiz edilen kirpik veya kirpik gruplarından toplam 807 siliyer atım frekansı ölçümü ve siliyer atım paterni değerlendirmeleri elde edildi.
Ortalama hareketsizlik indeksi, sağlıklı gönüllülerde gözlenen daha önce bildirilen değerlere benzerdi. Diskinezi skoru ve siliyer atım frekansı, yalnızca normal kenarlar veya minör projeksiyonlu kenarlar seçildiğinde elde edilen daha önce bildirilen değerlere benzerdi. Düşük kaliteli kenarlar kullanıldığında, daha düşük siliyer atım frekansları ve daha yüksek diskinezi skorları rapor edilir.
Çok sağlam bir fırçalamadan elde edilen kan hücreleri ve mukus, serbest kirpiklerin atılmasını engelleyebilir veya kirpikleri gözlemciden gizleyebilir. Tersine, fırça alt burun konkasına sıkıca bastırmazsa, numune yeterince yüksek kaliteli siliyer epitel şeritleri içermeyebilir. Ayrıca burun fırçalama işlemi burun boşluğunun ön kısmına yapılırsa sadece geçişli siliyer olmayan epitel hücreleri elde edilecektir.
Protokolün en önemli iki yönü, burun fırçalamanın kalitesi ve tam bir pozitif sonucu veya tekniğin başarısızlığını önlemek için yüksek kaliteli epitel parçalarının seçimidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, primer sililer disfonksiyonu (PSD) teşhisinde yüksek kaliteli sililer fonksiyonel analizi için hassas solunum epiteliyum örnekleme ve işleminin önemini tartışmaktadır. COVID-19 pandemisi sırasında sürekli teşhis hizmetlerini sağlamak için sililer videomikroskopi protokolünde yapılan uyarlamaları vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Solunum Sistemi Tıbbı
- Tanı Teknikleri
Arka Plan
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopi, PSD teşhisi için hassas ve spesifik bir yöntemdir.
- PSD için mevcut teyit edici testler arasında elektron mikroskobu ve genetik testler bulunur.
- Bu teyit edici testler, hastaların %15 ila %30'unda PSD teşhisini kaçırabilir.
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopi için işletim prosedürlerinde standartlaştırma eksiktir.
Çalışmanın Amacı
- Primer sililer disfonksiyonu için teşhis doğruluğunu artırmak.
- COVID-19 pandemisi sırasında güvenliği sağlamak için protokolleri uyarlamaktır.
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopiyi teşhis aracı olarak kullanımını teşvik etmektir.
Kullanılan Yöntemler
- Sililer fonksiyonel değerlendirmesi için yüksek hızlı videomikroskopi.
- Protokolde enfeksiyon kontrol önlemlerinin uygulanması.
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopinin diğer teşhis testleriyle karşılaştırılması.
- PSD teşhisinde hassasiyet ve özgüllük değerlendirmesi.
Ana Sonuçlar
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopi, PSD teşhisi için daha yüksek hassasiyet ve özgüllük göstermektedir.
- Sonuçlar bir gün içinde elde edilebilir, bu da onu pratik bir teşhis seçeneği yapar.
- Pandemi sırasında yapılan uyarlamalar, sürekli teşhis hizmetlerinin sürdürülmesinin mümkün olduğunu göstermektedir.
- Bu yöntemin teyit edici bir test olarak daha geniş kabul görmesi için standardizasyon gereklidir.
Sonuçlar
- Dijital yüksek hızlı videomikroskopi, primer sililer disfonksiyonunu teşhis etmek için değerli bir araçtır.
- Pandemi sırasında güvenli teşhis uygulamaları için enfeksiyon kontrol önlemleri kritik öneme sahiptir.
- Teşhis güvenilirliğini artırmak için prosedürlerin daha fazla standardizasyona ihtiyacı vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized digital high-speed ciliary videomicroscopy enables precise functional analysis of respiratory cilia, directly impacting target validation and diagnostic confidence in rare motile ciliopathies. The protocol's adaptation for infection control ensures continuity of critical diagnostic workflows during pandemic disruptions, supporting robust translational research and portfolio risk management. Reliable ciliary beat frequency and pattern quantification underpin mechanistic de-risking and inform go/no-go decisions in respiratory disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of ciliary function for mechanistic target validation in respiratory disorders.
- Supports biological de-risking by distinguishing normal from dyskinetic ciliary phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in disease modeling and early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible measurement of ciliary beat frequency and pattern for assay development.
- Ensures sample quality criteria are met, improving assay reliability and downstream screening readiness.
- Delivers rapid, same-day quantitative outputs to accelerate compound evaluation cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional ciliary analysis with disease-relevant endpoints for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent phenotypic readouts.
- Reduces risk of false negatives in rare disease cohorts, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative ciliary function data for respiratory disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification through direct measurement of ciliary motion.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative endpoints for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of ciliary beat frequency and pattern across experimental conditions.
- Translational Research: Connects functional ciliary metrics to disease-relevant phenotypes for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, standardized workflow for respiratory epithelial sampling and analysis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in respiratory disease research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible ciliary function analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory epithelial sampling and high-speed videomicroscopy operation.
- Demands access to specialized imaging equipment and video analysis software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample quality and analysis criteria.
- Must adapt infection control protocols for safe sample handling, especially during pandemics.
- Dependent on high-quality epithelial strips; suboptimal samples reduce diagnostic reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:41
Respiratory Ciliated Epithelium Sample Collection
2:35
Respiratory Ciliated Epithelium Processing and Preparation
3:55
Respiratory Ciliated Edge Selection and Recording
5:18
Ciliated Edge Analysis
6:59
Results: Representative Nasal Brush Processing Analysis
8:34
Conclusion
