Name: HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin, bitki örneklerinde nükleozid ve nükleotidleri HPLC-MS/MS ile hızlı ve doğru bir şekilde ölçmek için güvenilir bir yöntem. Bu protokol, metabolik süreçleri anlamak için araştırmacılara güçlü bir analitik araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (KJQN202060), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900907), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20190528), Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (CRP/CHN20-04_EC) tarafından M.C., ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (LGZD202004) X.L.

1 Bitki büyümesi ve malzeme toplama
<ol><li>Arabidopsis tohumlarının 10 dakika boyunca% 70 etanolde sterilize edildiğinden ve yarı mukavemetli Murashige ve Skoog besinleri ile hazırlanan agar plakalarına ekilmesinden emin olun.</li>
	<li>Arabidopsis tohumlarını 4 °C'de 48 saat boyunca karanlık altında kuluçkaya yatırın ve ardından 22 °C'de 55 μmol m-2 s -1 ve 20 °C'de 8 saat karanlık olan16 saat ışığı altında kontrollü bir büyüme odasına aktarın.</li>
	<li>100 mg 2 haftalık fide (taze ağırlık) hasat edin ve metabolit ekstraksiyonu için sıvı nitrojende dondurun. DİkKAT: Araştırmacılar, malzeme toplama sırasında insan dokusu kirlenmesini önlemek için uygun şekilde eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymelidir.</li>
</ol>2 Nükleozid/Nükleotid ekstraksiyonu
<ol><li>100 mg dondurulmuş bitki dokusunu 7-8 çelik boncuk ile soğuk öncesi bir karıştırıcı değirmeninde 60 Hz frekansta 5 dakika öğütin.</li>
	<li>Metanol, asetonitril ve su içeren ekstraksiyon çözeltisini 2:2:1 oranında hazırlayın.</li>
	<li>Homojenize malzemeleri (çoğu metabolit dahil ancak proteinler dahil) 1 mL ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden kullanın.</li>
	<li>Elde ettiği çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süspansiyonun 0,5 mL'lik kısmını yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve sıvı nitrojende dondurun.</li>
	<li>Donmuş numuneyi donmuş bir boyada buharlaştırın ve % 5 asetonitril ve% 95 su ile 0,1 mL'de yeniden depolayın.</li>
	<li>Elde eden çözeltiyi (0,1 mL) 40.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. LC-MS/MS ölçümü için süpernatant'ı bir şişeye yükleyin.</li>
</ol>3 LC-MS/MS ölçümü
<ol><li>2 L çift deiyonize suda (Mobil faz A) 1,1 g amonyum asetat eriterek 10 mM amonyum asetat tamponu hazırlayın. pH'ı %10 amonyum ve asetat asit ile 9,5'e ayarlayın.</li>
	<li>Nükleozid ölçümü için 2 L ultra saf %100 metanol (Mobil faz B1) hazırlayın. Ayrıca nükleotid ölçümü için 2 L ultra saf %100 asetonitril (Mobil faz B2) hazırlayın.</li>
	<li>Adım 2.7'den her numunenin önceden işlenmiş metabolit ekstraksiyonunun 0.02 mL'lik kısmını, üçlü dörtlü kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş ikili pompalar (LC) ile bir HPLC sistemine enjekte edin. DİkKAT: HPLC sisteminde C18 sütunu (50 x 4,6 mm, parçacık boyutu 5 μm; çekirdek ayrımı için mobil faz A ve B1 (Şekil 1A) ile 25 °C'de tamponlamada çalışmak ve çekirdeğe ayrılması için mobil faz A ve B2(Şekil 1B)ile gözenekli bir grafitik karbon (PGC) sütunu (50 x 4.6 mm, partikül boyutu 5 μm; 25 °C'de çalışmak) kullanın. Her örnek teknik çoğaltma için üç kez enjekte edildi.</li>
	<li>Yöntemi C18 sütunu için Tablo 1'de gösterildiği gibi ve PGC sütunu için Tablo 2'de gösterildiği gibi programlayın. 0,65 mL min-1akış hızı ayarlayın. NOT: Kütle geçişleri (Tablo 3) kütle spektrometresi ile izlendi. Sekiz nükleozid ve kanonik olanları ve değiştirilmiş olanları içeren beş nükleotitlerin kütle spektrum analiz koşulları Tablo 3'telistelenmiştir.</li>
	<li>Her hedef bileşiğin tepe alanlarını kaydedin (Şekil 1).</li>
</ol>4 Standart kalibrasyon eğrilerinin üretimi
<ol><li>Bölüm 2'deki açıklamanın ardından üretilen havuz altı örnek ekstraksiyonu ve girdap. Sonra, her arka planı almak için tekrar altı ekstraksiyona (aynı hacim) aliquot.</li>
	<li>Bu altı ekstraksiyona sırasıyla her standartın altı farklı konsantrasyonu ekleyin ve 3.3 adımını takiben bunları tek tek enjekte edin.</li>
	<li>3.4 ve 3.5. adımlarda açıklandığı gibi kütle geçişleri yoluyla her standardın en yüksek alanlarını farklı konsantrasyonlarda kaydedin.</li>
	<li>Altı noktalı bir eğri oluşturmak için tepe alanını her standardın nominal konsantrasyonuna göre çizin. NOT: 3.5 adımında kaydedilen nükleozidlerin/nükleotitlerin tepe alanları standart kalibrasyon eğrileri aralığına düşmelidir.</li>
	<li>Her standart bileşik için düz bir çizgi denklemini hesaplayın: Y = aX + b</li>
</ol>5 Metabolitlerin nicelemesi
<ol><li>3.5 adımında kaydedilen tepe alanını ve 4.5 adımındaki denklemi kullanarak metabolitlerin içeriğini hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.

Organizmalar, kanonik ve sapkın olanlar da dahil olmak üzere çeşitli nükleozidler / nükleotitler içerir. Bununla birlikte, bunların kökeni ve metabolik uç noktaları, özellikle modifiye nükleozidler, hala belirsizdir. Ayrıca, nükleozidler/ nükleotid metabolizmasının fonksiyonu ve homeostazının mevcut anlayışı araştırılmak ve genişletilmeye devam etmektedir. Bunları araştırmak için, bu metabolitlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesi için kesin ve altın standartlı bir yöntemin kullanılmalıdır. Burada nükleozidler/nükleotid...

Nükleozidler/Nükleotitler, nükleik asitlerin ve nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi birçok koenzim için öncü olan ve fosfolipidler, glikolipidler ve polisakkaritler gibi makromoleküllerin sentezinde önemli olan tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Yapısal olarak, nükleozid, adenin, guanin, urasil, sitozin veya timin olabilen bir nükleobase ve riboz veya deoksiriboz1,2olabilen bir şeker moiety içerir. Nükleotitler, nükleozidlerin şeker moietysinin 5 karbon pozisyonuna bağlı en fazla üç fosfat grubuna sahiptir3. Bitkilerdeki nükleotitlerin metabolizması tohum çimlenmesi ve yaprak büyümesi için gereklidir4,5,6. Bitki gelişimindeki fizyolojik rollerini daha iyi anlamak için, vivo olarak farklı nükleozidlerin / nükleotitlerin mutlak nicelemesi için yöntemler oluşturulmalıdır.
Nükleozidleri/nükleotidleri ölçmek için en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, ultraviyole görünür (UV-VIS) dedektör 4 ,7,8,9,10,11ile birlikte yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) kullanmaktadır. 2013 yılında, HPLC, Dahncke ve Witte kullanarak Arabidopsis thaliana7'dekinükleozidlerin çeşitli türlerini ölçtü. Vahşi tip bitkiye kıyasla guanosin deaminaz geninde hedef alan bir T-DNA ekleme mutantında gelişmiş bir guanosin içeriği tespit ettiler. Başka bir pirimidin nükleozid, sitidin, bu yöntemi kullanan bitkilerde nicel olarak tespit edildi, bu da iyi niyetli bir sitidin deaminaz geninin tanımlanmasıyla sonuçlandı4. Bununla birlikte, UV dedektörüne dayanarak, bu yöntem, guanosin veya ksantozin gibi benzer spektrumlara ve tutma sürelerine sahip nükleozidleri kolayca ayırt edemez. HPLC yönteminin algılama sınırı nispeten yüksektir, bu nedenle, sitidin, uridin ve guanosin gibi yüksek miktarda nükleozid in vivo ölçümü için sıklıkla kullanılır.
Ayrıca çekirdek ölçümünde kütle spektrometresi (GC-MS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi de kullanılabilir. Bundan faydalanmak, Hauck ve diğerleri. al. A. thaliana12tohumlarında nükleozid katabolik yolun aşağı akış metabolit olan uridin ve ürik asit başarıyla tespit edildi. Bununla birlikte, GC normalde uçucu bileşikleri ayırmak için kullanılır, ancak termal olarak labile maddeler için uygun değildir. Bu nedenle, kütle spektrometresi (LC-MS/ MS) ile birleştirilmiş bir sıvı kromatografisi muhtemelen nükleozidlerin / nükleotitlerin13,14'ünin vivo tanımlanması, ayrılması ve nicelleştirilmesi için daha uygun ve doğru bir analitik tekniktir. Daha önceki birkaç çalışmada, nükleozidler ve nükleotidler ayrımı için bir HILIC sütununun kullanılabileceği bildirilmiştir15,16 ve izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar bileşik niceleme içinkullanılmıştır 17. Bununla birlikte, her iki bileşen de nispeten pahalıdır, özellikle ticari izotop etiketli standartlar. Burada nükleozidler/nükleotidler ölçümü için ekonomik olarak uygulanabilir bir LC-MS/MS yaklaşımı rapor ediyoruz. Bu yöntem, atp, N 6 -metil-AMP, AMP, GMP, üridin, sittin ve psödouridine 1 ,5,6,18, bitkilerde ve Drosophiladahil olmak üzere çeşitli nükleozidlerin / nükleotidlerin niceliği için zaten başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz yöntem diğer organizmalarda da kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>amonyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>sitidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hypercarb kolon</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inozín</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-metiladenozin</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-metilguanozin</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog Ortamı</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18A kolon</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseüdoüridin</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>üridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc-ms/ms ile nükleozid/nükleotid İçerik Ölçümü için bitki numunesi hazırlama

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nükleozidler/nükleotitler, nükleik asitlerin yapı taşları, kosubstratların ve koenzimlerin parçaları, hücre sinyal molekülleri ve birçok hücre faaliyetinde yer alan enerji taşıyıcılarıdır. Burada, bitkilerdeki nükleozid/ nükleotid içeriğinin mutlak kalifikasyon için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Kısaca, 100 mg homojenize bitki materyali 1 mL ekstraksiyon tamponu (metanol, asetonitril ve su 2:2:1 oranında) ile çıkarıldı. Daha sonra, örnek bir dondurarak kurutucuda beş kez yoğunlaştı ve daha sonra bir HPLC-MS/MS'e enjekte edildi. Her nükleozid ve nükleotitin kütle geçişleri kütle spektrometresi ile izlendi. Nükleozidlerin ve nükleotitlerin içeriği dış standartlarına (ESTD' ler) göre ölçüldür. Bu nedenle, araştırmacılar bu yöntemi kullanarak farklı bitkilerdeki nükleozidleri / nükleotitleri kolayca ölçebilirler.

Burada, 2 haftalık Arabidopsis vahşi tip (Col-0) fidanlarında bilinen bir modifiye nükleozid olan N1-metildenozinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini örnek olarak gösteriyoruz. Kütle spektrometresi profili, N1-metildenozin standardından üretilen ürün iyonlarının 150 m/z ve 133 m/z (Şekil 2A) olduğunu ve aynı profilin Col-0 ekstraksiyonunda da gözlendiğini gösterir (Şekil 2B). 150 m/z'lik ürün iy...

Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.

HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nükleozidler ve nükleotitler tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Hücre gelişimi için metabolizmaları gereklidir. Bu yaklaşım, bu metabolitlerin nicelemesi için güçlü bir araç sağlar.Bu yöntem, bitkilerdeki nükleozitlerin ve nükleotitlerin hızlı ve doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tam numune ön tedavileri ve LC-MS/MS analizleri 10 ila 20 örnek seti için yaklaşık iki gün sürer. Bu yöntem tüm bitkilere ve hatta diğer organizmalara uygulanabilir.Prosedürü gösteren Changhua Zhu, Chen Laboratuvarı'ndan doçent. Bitkileri yetiştirmek için, Arabidopsis tohumlarının 10 dakika boyunca% 70 etanolde sterilize olduğundan ve 1/2 mukavemetli Murashige ve Skoog besinleri ile agar plakalarına ekilmesini sağlayın. Plakaları 48 saat boyunca dört santigrat derecede karanlıkta kuluçkaya yatırın, ardından 22 santigrat derecede 16 saat ışığın altında ve 20 santigrat derecede sekiz saat karanlıkta kontrollü bir büyüme odasına aktarın.İki haftalık fidelerin 100 miligramını hasat edin ve metabolit ekstraksiyonu için sıvı nitrojende dondurun. Önceden soğutulmuş bir mikser fabrikasında yedi ila sekiz çelik boncuk ile 100 miligram dondurulmuş bitki dokusunu 60 Hertz frekansında beş dakika boyunca öğütün. Metanol, asetonitril ve su içeren ekstraksiyon çözeltisini ikiye ikiye bir oranında hazırlayın.Homojenize malzemeleri bir mililitre ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden kullanın. Elde eden çözeltiyi 12.000 XG'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin, ardından süspansiyonun 0,5 mililitresini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve sıvı nitrojende dondurun. Donmuş numuneyi bir dondurarak kurutucuda buharlaştırın ve %5 asetonitril ve %95 su ile 0,5 mililitre yeniden depolayın.Elde ettiği çözeltiyi 4.000 XG'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. LC-MS/MS ölçümü için süpernatant bir şişeye yükleyin. İki litre çift deiyonize suda 1,5 gram amonyum asetat eriterek 10 milimoler amonyum asetat tampon hazırlayın.PH'ı %10 amonyum ve asetat asit ile 9,5'e ayarlayın. Nükleozid ölçümü için iki litre ultra saf %100 metanol hazırlayın, ardından nükleotid ölçümü için iki litre ultra saf asetonitril hazırlayın. Daha önce hazırlanmış her numunenin önceden işlemden geçirilen metabolit ekstraksiyonunun 0,02 mililitresini, üçlü dörtlü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş ikili pompalarla bir HPLC sistemine enjekte edin.Standart kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için, altı numune ekstraksiyonunu bir araya getirin ve karışımı girdaplayın, sonra her arka planı elde etmek için tekrar altı ekstraksiyona aliquot. Bu altı ekstraksiyona sırasıyla her standartın altı farklı konsantrasyonu ekleyin ve bunları HPLC sistemine tek tek enjekte edin. Kütle geçişleri yoluyla her standardın tepe alanlarını farklı konsantrasyonlarda kaydedin.Bu protokol, iki haftalık Arabidopsis vahşi tip fidelerinde bilinen bir modifiye nükleozid olan N1-metildenozin'i tanımlamak ve ölçmek için kullanıldı. Kütle spektrometresi profili, N1-metildenozin standardından üretilen ürün iyonlarının 150 ve 133 MZ oranlarında olduğunu gösterdi. Kolombiya sıfır çıkarmada da aynı profil gözlendi.150 MZ'lik ürün iyonunun yüksek bolluğu nedeniyle, N1-metildenozin tanımlaması için 282,1 ila 150 kütle geçişi seçildi. Hedef tepenin tutma süresi 7.05 dakikaydı. N1-metildenozin standardının tutma süresi ile aynıdır.Altı numune ekstraksiyonuna bir konsantrasyon serisi N1-metildenozin standardı eklendi. Standart numuneler LC-MS/MS'e enjekte edildi ve N1-metiladenozinin artan pik alanları standartların nominal konsantrasyonlarına göre çizildi. Altı eşit arka plan ekstraksiyonu, nicelik için doğru ve tekrarlanabilir bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için önemlidir.Yöntemimiz bitkilerdeki metabolik yolları keşfetmek için uygulanabilir. Metabolit profilleri vahşi tip ve fonksiyon kaybı mutantları arasında karşılaştırarak metabolik akı çizilebilir.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Radikal tabanlı biomimetic kimya biyolojik gelişimi için gerekli bina-up kütüphaneler uygulanmıştır.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Bitki biyokütle yakıt, yem, gıda ve malzemelerin çeşitli dahil olmak üzere birden fazla ürün için bir yenilenebilir kaynak sunuyor. Bu yazıda tütün ağacı (Nicotiana glauca) ve bir Biorefinery boru hattı için kavak olarak uygun kaynaklarının özelliklerini incelemek.

Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

Burada açıklanan protokol, farklı koşullar altında kültürlenen kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinde pürin metabolizmasını ölçmek için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder.

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına &lt;35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

Bu protokolde, birçok numunenin verimli ve hızlı bir şekilde numune hazırlamasını birleştiren optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Ek olarak, metabolik GWAS çalışmalarının yüksek verimli değerlendirilmesi için analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

RNA'nın transkripsiyon sonrası modifikasyonları, son zamanlarda merkezi sinir sistemi plastisitesi ile bağlantılı olan az çalışılmış bir translasyon düzenleme katmanını temsil eder. Burada, tek nöronlarda çok sayıda RNA modifikasyonunun eşzamanlı karakterizasyonu için numune hazırlama ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi yaklaşımı tanımlanmıştır.

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Öğrenin, bitki örneklerinde nükleozid ve nükleotidleri HPLC-MS/MS ile hızlı ve doğru bir şekilde ölçmek için güvenilir bir yöntem. Bu protokol, metabolik süreçleri anlamak için araştırmacılara güçlü bir analitik araç sunar.

HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama

Daha fazla video keşfet