Name: Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Öğrenin, fare atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerin izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemini. Bu protokol, Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümünü mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG; Vasküler Tıpta Klinisyen Bilim İnsanı Programı (PRIME), P. Tomsits ve D. Schüttler'e MA 2186/14-1; VO1568/3-1, IRTG1816 ve SFB1002 projesi A13'ten N. Voigt'e), Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında Alman Araştırma Vakfı (EXC 2067/1- 390729940'den N. Voigt'e), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss ve N. Voigt'e; 81Z0600206'dan S. Kääb'a), Korona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), Kardiyovasküler Hastalıklar ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Vakfı (S. Clauss'a) ve Else-Kröner-Fresenius Vakfı (EKFS 2016_A20 N. Voigt'e). Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

Tüm hayvan prosedürleri Aşağı Saksonya Hayvan İnceleme Kurulu (LAVES, AZ-18/2900) tarafından onaylanmıştır ve hayvan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Ön düzenlemeler
<ol><li>1 L 10x perfüzyon tamponu (Tablo 1), 500 mL 1x perfüzyon tamponu (Tablo 2), 50 mL sindirim tamponu (Tablo 3), 10 mL durdurma tamponu (Tablo 4), 1 L Tiroid çözeltisi (Tablo 5), her kalsiyum adım çözeltisinin 10 mL'si (glikozlu tiroid çözeltisi ve belirtildiği gibi ilgili kalsiyum miktarı), Verilen tariflere göre 1 L 4-AP çözeltisi (Tablo 5), 100 mL pipet çözeltisi (Tablo 6) ve 5 mL pluronik asit. NOT: Banyo çözeltileri (Tirod ve 4-AP çözeltisi) önceden (glikozsuz) hazırlanabilir ve +4 ° C'de saklanabilir, deney gününde glikoz eklenir. Pipet çözeltisi -20 ° C'de saklanabilir, deney gününde kalsiyum göstergesi eklenir ve çözelti daha sonra bir sonraki kullanıma kadar buz üzerinde saklanır. 10x perfüzyon tamponu oda sıcaklığında saklanabilir, 1x perfüzyon tamponu, sindirim tamponu ve durdurma tamponu deney gününde taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Su banyosunu ve silindir pompasını açın.</li>
	<li>Langendorff aparatını perfüzyon tamponu ile önceden doldurun; Havasız olduğundan emin olun.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında sabitleyerek aort kanülü hazırlayın, perfüzyon tamponu ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga ile bağlayın ve kanülü durulayarak havayı temizleyin. NOT: Perfüzyon sistemi içindeki herhangi bir havadan kaçınmak çok önemlidir, çünkü bu koroner perfüzyonu ve dolayısıyla sindirim etkinliğini doğrudan etkileyecektir. Herhangi bir hava sıkışmasını güvenli bir şekilde önlemek için gerekirse kuruluma bir kabarcık tuzağı eklenebilir.</li>
	<li>Petri kaplarını organ toplama ve mikroskopi için yeterli perfüzyon tamponu ile hazırlayın (tampon tüm organı güvenli bir şekilde örtmeli, kullanılan Petri kabının boyutuna bağlı olarak birkaç mililitre yeterli olmalıdır).</li>
	<li>Doku ayrışması ve mikroskopi için sindirim tamponu ile 3 Petri kabı hazırlayın, tampon ilgili Petri kabı içindeki mikroskop altında diseksiyon için organı kapsamalıdır, miktar kullanılan Petri kabının boyutuna bağlıdır. Dissosiyasyon için ventriküler doku için 3 mL ve atriyal doku için 1.5 mL kullanın.</li>
</ol>2. Organ hasadı
<ol><li>Fareye 0,1 mL heparin (1.000 U/mL) enjekte edin, yani 27 G kanüllü 1 mL şırınga kullanın ve 5-10 dakika bekleyin.</li>
	<li>Fareyi yaklaşık 500 μL izofluran içine batırılmış küçük bir doku ile birlikte bir indüksiyon odasına yerleştirin. Hayvan doku ile temas halinde olmamalıdır. Bunu önlemek için, dokuyu örtmek için plastik bir biyopsi gömme kaseti kullanılabilir. Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, ayak parmağı sıkışma refleksini kontrol edin ve artık mevcut olmadığı anda, fareyi servikal çıkıkla hızlı bir şekilde ötenazi yapın.</li>
	<li>Fareyi sırtındaki bir platforma yerleştirin (örneğin, kağıt havluyla kaplı strafor üzerine) ve yerinde tutmak için pençeleri kanüllerle sabitleyin.</li>
	<li>Göğsü ve karnın bir kısmını kaplayan kürk ve deriyi, jugulumdan simfize doğru net bir kesikle çıkarın ve makas kullanarak herhangi bir organ yapısına zarar vermeden karnı ksifoidin hemen altında açın. Sternumu cerrahi forseps ile kaldırın ve diyaframı kaburgaların kenarı boyunca makasla kesin, ardından kaburgaları medial aksiller çizgide kesin ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın.</li>
	<li>Perikardın künt forseps kullanarak dikkatlice çıkarılması ve kalbin aşağıdan künt forseps ile kaldırarak ve büyük damarları makas kullanarak tek bir kesimle keserek kalbi hızlı bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Kalbi oda sıcaklığında perfüzyon tamponuna koyun ve aortu mikroskop altında künt bir uç iğne ile mümkün olduğunca çabuk kanüle edin. NOT: Organa bağlı akciğer dokusunu ve yağ dokusunu üzerinde fazla zaman kaybetmeden çıkarın. Kanülasyon yaparken, iğnenin ucunun aort kapağı boyunca uzanmadığından emin olun, çünkü bu, tamponların koroner arterlere girmesini önleyerek sonuçları bozacaktır.</li>
	<li>Kalbi iğneye sıkıca dikiş ipeği parçası ile bağlayın ve şırıngadan ayırın. NOT: Kalbin elde edilmesinden (büyük damarların kesildiği an) aortun iğneye dikilmesine kadar tüm prosedür mümkün olduğunca az zaman almalıdır. Perfüzyonun başlamasına kadar kalbin çıkarılmasından 90-180 s'den daha uzun sürmemesi önerilir.</li>
</ol>3. Enzimatik sindirim
<ol><li>Aort kanülasyonundan sonra, kanüllenmiş kalbi derhal Langendorff cihazına bağlayın ve sisteme herhangi bir hava girmesini önleyin. NOT: Langendorff cihazının alt kısmında asılı bir damla perfüzyon tamponunun yanı sıra sisteme herhangi bir hava girmesini önlemek için iğnenin üstüne oturan bir damla perfüzyon tamponu olması yardımcı olabilir.</li>
	<li>Kalbi tam olarak 37 ° C sıcaklıkta ve tam olarak 4 mL / dak perfüzyon hızında 1 dakika perfüzyon tamponu ile perfüze edin. NOT: Perfüzyon iğnesinin ucunda 37 °C sıcaklığa sahip olmak için, su banyosu sıcaklığının yaklaşık 40 °C'de biraz üzerine ayarlanması gerekir. Bu, perfüzyon ucundaki sıcaklık ölçülerek düzenli olarak test edilmelidir.</li>
	<li>Perfüzyonu sindirim tamponuna geçirin ve tam olarak 37 ° C sıcaklıkta ve tam olarak 4 mL / dak perfüzyon hızında tam 9 dakika perfüzyon yapın.</li>
	<li>Sindirilmiş kalbi, tamamen kapalı tutmak için yeterli sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın. Daha sonra atriyum ve ventrikülleri mikroskop altında dikkatlice inceleyin.</li>
	<li>Atriyumu 1,5 mL sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına ve ventrikülleri 3 mL sindirim tamponuna sahip başka bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Atriyal diseksiyon<ol><li>Dikkatlice, ancak zaman kaybı olmadan, atriyumu künt forseps kullanarak küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>Daha önce uç açıklığını genişletmek için kesilmiş olan 1.000 μL pipet ucunu kullanarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu çözün.</li>
		<li>Çözeltiyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve reaksiyonu sonlandırmak için tüpün yan tarafına dikkatlice pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu (1,5 mL) ekleyin.</li>
		<li>Tamamen sindirilmemiş kalan daha büyük doku parçalarını çıkarmak için 3 mL'lik hücre/doku solüsyonunun tümünü 200 μm'lik bir naylon ağdan dikkatlice geçirin. NOT: Başarılı bir sindirim neredeyse hiç katı parça bırakmaz.</li>
	</ol></li>
	<li>Ventriküler diseksiyon<ol><li>Diseksiyon makası ve pipet kullanarak ventrikül dokusunu hızlı bir şekilde küçük parçalara ayırın ve çözünmesi için yukarı ve aşağı çekin. Yukarı ve aşağı pipetleme için başka bir 1.000 μL pipet ucu kullanın, açıklığı genişletmek için kısaltılabilir.</li>
		<li>Hücreyi/doku solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve reaksiyonu sonlandırmak için tüpün yan tarafına dikkatlice pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu (3 mL) ekleyin.</li>
		<li>Tamamen sindirilmemiş daha büyük doku parçalarını çıkarmak için 6 mL'lik hücre/doku solüsyonunun tamamını 200 μm'lik bir naylon ağdan dikkatlice geçirin. NOT: Başarılı bir sindirim neredeyse hiç katı parça bırakmaz.</li>
	</ol></li>
	<li>Her iki tüpü de (atriyal ve ventriküler hücre süspansiyonu) yerleşmesi için 6 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgahta bırakın.</li>
	<li>Her iki 15 mL tüpü de 5 x g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
</ol>4. Kalsiyumun yeniden tanıtılması
NOT: Aşağıdaki adımlar hem atriyal hem de ventriküler hücreler için aynıdır (aksi belirtilmedikçe) ve oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
<ol><li>Süpernatantı plastik bir Pasteur pipet kullanarak atın ve peleti 10 mL kalsiyumsuz Tirod çözeltisi içinde dikkatlice askıya alın.</li>
	<li>Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.</li>
	<li>1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peleti 100 μM kalsiyum konsantrasyonuna sahip 10 mL Tyrode çözeltisinde dikkatlice askıya alın.</li>
	<li>Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.</li>
	<li>1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peleti 400 μM kalsiyum konsantrasyonuna sahip 10 mL Tyrode çözeltisinde dikkatlice askıya alın.</li>
	<li>Sedimantasyon için hücreleri 8 dakika bekletin.</li>
	<li>1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj (sadece atriyal hücreler, sedimantasyon ventriküler hücreler için yeterlidir).</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peleti 1 mM kalsiyum konsantrasyonu ile 1 mL (atriyal) / 5 mL (ventriküler) Tiroid çözeltisi içinde dikkatlice askıya alın.</li>
</ol>5. Miyositlerin floresan kalsiyum göstergesi Fluo-3 ile yüklenmesi
NOT: Floresan kalsiyum göstergesinin ışığa duyarlılığı nedeniyle, aşağıdaki adımlar ışıktan korunarak gerçekleştirilmelidir (örneğin, tüpleri alüminyum folyo ile kaplayarak).
<ol><li>50 μg Fluo-3AM'ye susuz DMSO'da 44 μL% 20 pluronik F-127 ekleyerek Fluo-3 stok çözeltisini hazırlayın (ışıktan korunan -20 ° C'de saklanabilir).</li>
	<li>1 mL hücre süspansiyonuna 10 μL Fluo-3 stok çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1 dakika boyunca 5 x g'de santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı plastik bir Pasteur pipeti kullanarak atın ve iyi bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için peletleri makul miktarda banyo çözeltisi içinde yeniden askıya alın (hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1-5 mL banyo çözeltisi).</li>
	<li>Deneylere başlamadan önce estersizleştirme için 30 dakika bekletin.</li>
</ol>6. Daha önce tarif edildiği gibi eşzamanlı yama-kelepçe ve epifloresan Ca2+-geçici ölçümler16
NOT: Yama kelepçesi ölçümleri bu makalenin konusu değildir, ilgilenen okuyucu bu yöntemin derinlemesine açıklamalarını sağlayan başlıca yayınlara yönlendirilebilir 17,18,19,20,21,22. Bununla birlikte, daha iyi bir genel anlayış için, akımın neden olduğu kalsiyum geçicileri ile birlikte L-tipi kalsiyum akımlarını ölçmek için bir protokol hakkında bir özet verilmiştir.
<ol><li>Miyositleri bir hücre odasına aktarın ve 37 ° C'de banyo çözeltisi ile süper kaynaştırın.</li>
	<li>Tablo 5'te gösterildiği gibi banyo çözeltisine 4-aminopiridin ve baryum klorür ekleyerek potasyum akımlarını bloke edin.</li>
	<li>Borosilikat mikroelektrotlarının pipet çözeltisi ile doldurulmuş 2-5 MΩ'luk bir uç direncine sahip olduğundan emin olun (Tablo 6).</li>
	<li>Hem elektrik sinyallerinin hem de epifloresanlığın aynı anda kaydedilmesini sağlamak için ölçümleri ayarlayın. Gerilim kelepçesi modu, hücreyi -80 mV'de tutan bir protokol ve hızlı Na + -akımını devre dışı bırakmak için 600 ms rampa darbesini -40 mV'a kadar tutan bir protokolle L tipi Ca 2+ akımını ölçmek için kullanılır, ardından 0,5 Hz'de +10 mV'ye 100 ms test darbesi uygulanır (Şekil 2).</li>
	<li>488 nm'de uyarma kullanın, &lt;520 nm'de yayılan ışığı algılayın ve [Ca2+]I'ye dönüştürün <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> Burada kd = Fluo-3'ün (864 nM) ayrışma sabiti, F = Fluo-3 floresansı; Fmax = Her deneyin sonunda elde edilenCa 2+-doymuş floresan19.</li>
</ol>

<ol><li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation%3A+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li>
<li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation%3A+a+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li>
<li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bell+tolls+%3A+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106(2019).</li>
<li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li>
<li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li>
<li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+safety+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li>
<li>Schüttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li>
<li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588(2019).</li>
<li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes%2C+ventricular+myocytes%2C+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224(2020).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Report%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Köhncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).</li>
<li>Brandenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubule+junctions+activate+atrial+Ca%282%2B%29+release+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1227(2018).</li>
<li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235(2013).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I%28K%2CACh%29+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Trafford, A. W., Díaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li>
<li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , (2020).</li>
<li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li>
<li>Plačkić, J., Kockskämper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li>
<li>Díaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hülsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li>
<li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+or+without+Langendorff%3A+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiment%22%5BJournal%5D)">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890(2020).</li>
</ol>

Bu makale, eşzamanlı kalsiyum geçici kayıtları ile yama-kelepçe çalışmaları için aynı fareden yüksek kaliteli atriyal ve ventriküler miyositler elde etmenin kolay ve işlevsel bir yolunu sunmaktadır. Elde edilen verilerin kalitesi büyük ölçüde hücre izolasyonunun kalitesine bağlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, murin kardiyomiyositlerini izole etmek için birçok yöntem daha önce 9,10,11,12 olarak tanımlanmıştır.<sup cla...

Kardiyak aritmiler yaygındır ve dünya çapında milyonlarca insanı etkilediği için mevcut en büyük sağlık sorunlarından biridir. Aritmiler yüksek morbidite ve mortaliteile ilişkilidir 1,2 ve ani kardiyak ölümlerin çoğunun altında yatan nedeni oluşturur3. Güncel tedavi seçenekleri hasta sağkalımını iyileştirmiştir, ancak yine de altta yatan mekanizmaları hedeflemek yerine esas olarak semptomatik tedavilerdir. Bu nedenle, bu tedavilerin etkinliği sınırlıdır ve sıklıkla ciddi yan etkilere neden olabilir 4,5,6. Mevcut tedavi seçeneklerinin iyileştirilmesi, altta yatan patofizyolojinin anlaşılmasını gerektirmekte ve çalışmak için uygun modellere ihtiyaç duyulmaktadır. Küçük hayvan modelleri - ve özellikle fare modelleri - aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynamaktadır, çünkü aritmogenezin temel mekanizmalarını, örneğin hücresel elektrofizyoloji, iyon kanalı fonksiyonu veya kalsiyum işleme üzerindeki genetik etkiyi incelemeye izin verirler7,8.
Bu amaçla, yeterli miktarda ve canlılıkta izole atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Atriyal ve ventriküler miyositleri elde etmek için farklı izolasyon yaklaşımlarının geniş bir spektrumu daha önce 9,10,11,12,13 olarak tanımlanmıştır ve bazı gruplar atriyal 14 veya ventriküler15'ten L-tipi akım ve kalsiyum akımına bağlı kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerinden elde edilen verileri sunmuştur murin kardiyomiyositler. Bununla birlikte, en iyi bildiğimiz kadarıyla, bir hayvandan elde edilen atriyal ve ventriküler ölçümler hakkında hiçbir veri yoktur. Araştırmacılar, elektrofizyolojiden proteomiklere, hücre kontraktilitesi veya protein etkileşimleri, mitokondriyal fonksiyon veya genetik gibi fonksiyonel çalışmalara kadar çok çeşitli konulara odaklanmaktadır - hepsi izole kardiyomiyositlere ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle yayınlanan protokollerin birçoğu yama kelepçesi çalışmaları için özel olarak geliştirilmemiştir, bu da yama kelepçesi çalışmaları için sınırlı verime ve yetersiz hücre kalitesine yol açmaktadır. Bu nedenle, bir hayvandan izole edilen atriyal ve ventriküler hücrelerin eşzamanlı yama kelepçesi ve kalsiyum geçici ölçümleri, belirlenmiş protokollerle gerçekleştirilemez.
Yama kelepçesi deneyleri için murin - özellikle atriyal - miyositlerin izolasyonu zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için basit ve hızlı bir yöntem sunmaktadır, bu da daha sonra bir hayvandan hem net membran akımının hem de akımın neden olduğu kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı ölçümlerine izin vermektedir. Bu makalede, vahşi tip farelerden ve genetik mutasyonlar taşıyan farelerden türetilen atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu için bir protokol detaylandırılmıştır. Bu protokol hem erkek hem de dişi fareler için kullanılabilir. Aşağıda tarif edilen miyosit izolasyonu, görüntüler ve temsili sonuçlar, 6 (± 1) aylıkken vahşi tip C57Bl / 6 farelerden elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, farklı genotiplere sahip 2 ila 24 ay arasında değişen çeşitli yaşlardaki fareler için başarıyla kullanılmıştır. Şekil 1 , enzim perfüzyonu sırasında kanüle olmuş bir kalbin izolasyon kurulumunu ve yakın çekimini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>2,3-Bütandion monoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td></td></tr><tr><td>27G kanül</td><td>Servoprax</td><td>L10220</td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopiridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td></td></tr><tr><td>Susuz DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Aort kanülü</td><td>Radnoti</td><td>130163-20</td><td></td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td></td></tr><tr><td>künt cerrahi forseps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Buzağı Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12133C</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu ısıtmalı su banyosu</td><td>Julabo</td><td>ME</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip II</td><td>Worthington</td><td>LS994177</td><td></td></tr><tr><td>disscetion makas</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600124</td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-tuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F1242</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5 & prime; -trifosfat tris tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bobini</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>25.000 IE / 5ml</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td></td></tr><tr><td>indüksiyon odası</td><td>CWE dahil</td><td>13-40020</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Cp-pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Ceketli kalp odası</td><td>Radnoti</td><td>130160</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MgCl x 6H 2 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<>4 x 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Naylon ağ (200 & mikro; m)</td> <td>VWR-Almanya</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>pastör pipeti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z331759</td><td></td></tr><tr><td>petri tabakları</td><td>Thermo Fisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Pluronik Asit F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>Makaralı Pompa</td><td>Ismatec</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi forseps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650908-4</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi makas</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700540</td><td></td></tr><tr><td>dikiş ipek</td><td></td> Şırınga NC9416241 <td></td><td>Güzel Bilim Araçları</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>Z683531-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td></td></tr></tbody></table>

ca2+ geçici ve l-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Fare modelleri, aritmi araştırmalarında çok önemli bir rol oynar ve değiştirilmiş iyon kanalı fonksiyonu ve kalsiyum kullanımı dahil olmak üzere aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak veya kalsiyum işleme anormalliklerini araştırmak için yüksek kalitede atriyal veya ventriküler kardiyomiyositler gereklidir. Bununla birlikte, mevcut izolasyon protokolleri ile elde edilen yüksek kaliteli kardiyomiyositlerin sınırlı verimi, aynı farede her iki ölçüme de izin vermez. Bu makalede, bir hayvandan kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kalpleri elde edilir ve kanı çıkarmak için aort hızla kanüle edilir. Kalpler daha sonra başlangıçta dokuyu intercalated diskler seviyesinde ayrıştırmak için kalsiyumsuz bir çözelti (37 ° C) ve daha sonra hücre dışı matrisi (37 ° C) bozmak için az miktarda kalsiyum içeren bir enzim çözeltisi ile perfüze edilir. Sindirilen kalp daha sonra atriyum ve ventriküllere diseke edilir. Doku örnekleri küçük parçalar halinde doğranır ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme ile çözülür. Enzimatik sindirim durdurulur ve hücreler fizyolojik kalsiyum konsantrasyonlarına kademeli olarak yeniden verilir. Bir floresan Ca2 + göstergesi ile yüklendikten sonra, kalsiyum akımlarının ve geçicilerinin eşzamanlı ölçümü için izole kardiyomiyositler hazırlanır. Ek olarak, izolasyon tuzakları tartışılmış ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilmiş atriyal ve ventriküler murin miyositlerinde eşzamanlı kalsiyum geçici ölçümleri ile yama-kelepçe protokolleri ve L-tipi kalsiyum akımlarının temsili izleri sağlanmıştır.

İzolasyon verimi, kalsiyumun yeniden verilmesinden sonra, 10 μL hücre süspansiyonunun bir mikroskop slaydına pipetlenmesiyle belirlenir. Atriyal hücre izolasyonu için 100'den fazla canlı, çubuk şeklinde, büzülmeyen hücre / 10 μL ve ventriküler hücre izolasyonu için 1.000'den fazla canlı, çubuk şeklinde, büzülmeyen hücre / 10 μL yeterli verim olarak kabul edilir ve genellikle bu protokol kullanılarak elde edilir. Bu protokol ile elde edilen atriyal hücreler, başta sinüs düğümü olmak üzere kardiyak iletim sistemi hücreleri...

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Yama klempi ve kalsiyum görüntüleme deneyleri emek yoğun, zaman alıcı ve zorlayıcıdır. Bu protokol, yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler kardiyomiyositleri izole etmek için yama klemp deneyleri ve aynı anda gerçekleştirilen kalsiyum görüntülemesi için uygun bir yöntem sağlar. Bu protokolün en büyük avantajı, aynı hayvandan atriyal ve ventriküler kardiyomiyositler elde edebilmemizdir.Murin atriyal kardiyomiyositlerinin izolasyonu özellikle zordur ve önceki deneyler için sınırlayıcı bir faktör olmuştur. Langendorff cihazını perfüzyon tamponu ile önceden doldurarak ve havasız olduğundan emin olarak başlayın. Diseksiyon mikroskobu altında bir aort kanülünü sabitleyin ve perfüzyon tamponu ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga ile bağlayın.Kalbi ötenazi yapılmış fareden çıkardıktan sonra, kalbi oda sıcaklığında perfüzyon tamponuna koyun ve aortu mikroskop altında mümkün olan en kısa sürede künt uçlu bir iğne ile kanüle edin. Kalbi bir parça dikiş ipeği ile iğneye sıkıca bağlayın ve şırıngayı çıkarın. Aort kanülasyonundan sonra, kanüllü kalbi hemen Langendorff cihazına bağlayın ve sisteme hava girmesini önleyin.Kalbi perfüzyon tamponu ile tam olarak 37 santigrat derecede ve dakikada dört mililitre perfüzyon hızında bir dakika boyunca perfüze edin. Perfüzyondan sindirim tamponuna geçin ve 37 santigrat derece sıcaklıkta ve dakikada dört mililitre perfüzyon hızında tam olarak dokuz dakika perfüz. Bittiğinde, sindirilmiş kalbi, tamamen kapalı tutmak için yeterli sindirim tamponu olan bir petri kabına aktarın.Daha sonra atriyum ve ventrikülleri mikroskop altında dikkatlice inceleyin. Kulakçıkları 1,5 mililitre sindirim tamponu içeren bir petri kabına ve ventrikülleri üç mililitre sindirim tamponu olan başka bir petri kabına aktarın. Dikkatlice ama hızlı bir şekilde kulakçıkları künt forseps kullanarak küçük parçalara ayırın.Uç açıklığını genişletmek için daha önce kesilmiş olan 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu ile dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu çözün. Çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpün yan tarafına pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu ekleyin. Tam olarak sindirilmemiş kalan daha büyük doku parçalarını çıkarmak için çözeltinin üç mililitresini de 200 mikrometrelik bir naylon ağdan geçirin.Ventriküler diseksiyon yapmak için, ventriküler dokuyu diseksiyon makası veya forseps kullanarak küçük parçalara ayırın ve çözünmesi için 1000 mikrolitrelik başka bir pipet ucuyla yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre ve doku çözeltisini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve reaksiyonu sonlandırmak için tüpün yan tarafına dikkatlice pipetleyerek eşdeğer miktarda durdurma tamponu ekleyin. Tam olarak sindirilmemiş daha büyük parçaları çıkarmak için altı mililitre hücre ve doku solüsyonunun tümünü 200 mikrometrelik bir naylon ağdan geçirin.Hem atriyal hem de ventriküler hücre süspansiyonlarını oturması için oda sıcaklığında altı dakika tezgahta bırakın. Daha sonra tüpleri 5G'de iki dakika santrifüjleyin. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak süpernatanları atın ve hücre peletlerini 10 mililitre kalsiyum içermeyen Tyrode solüsyonunda dikkatlice yeniden süspanse edin.Sedimantasyon için atriyal ve ventriküler hücreleri sekiz dakika bekletin. Atriyal hücreleri 5G'de bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanları her iki hücre örneğinden atın ve peletleri 10 mililitre Tyrode çözeltisinde 100 mikromolar kalsiyum ile dikkatlice yeniden süspanse edin.Hücreleri sedimantasyon için sekiz dakika bekletin, ardından atriyal hücrelerin santrifüjlenmesini tekrarlayın. Süpernatanları atın ve hücre peletlerini 400 mikromolar kalsiyum içeren 10 mililitre Tyrode çözeltisinde dikkatlice yeniden süspanse edin. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın, Tyrode çözeltisindeki hücreleri bir milimolar kalsiyum ile yeniden süspanse edin.Tüm atriyal hücreler küçüktür ve hücre kapasitansları yaklaşık 35 ila 100 pikofarad arasında değişir. Atriyal çalışan miyokarddan tipik bir hücre burada gösterilmiştir. Ventriküler miyositler daha çubuk şeklinde ve daha büyüktür ve hücre kapasitansları 100 ila yaklaşık 400 pikofarad arasında değişir.Bir atriyal miyosit ve bir ventriküler miyositten eşzamanlı sitozolik kalsiyum geçişleri ile L tipi kalsiyum akımı ölçümlerinin örnekleri burada gösterilmiştir. Bu tekniği denemeden önce, organ toplama işlemini uyguladığınızdan emin olun. Adımın hızlı bir şekilde yapılması ve tüm doku kesimlerinin doğru yerlerde yapılması çok önemlidir.Organ hasadı tekrarlanabilir kalitede gerçekleştirildiğinde, kanülasyonu mükemmelleştirmek için biraz zaman ayırın. Bu protokol ile izole edilen hücreler yama klemp ölçümleri için uygundur. Ek olarak, çok çeşitli görüntüleme deneylerine izin veren floresan boyalarla yüklenebilirler.

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu...

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, yetişkin farelerden atriyal ve ventrikül miyositlerinin eşzamanlı izolasyonu için aort kanülasyonunun derinliğini de içeren Langendorff yönteminin modifikasyonlarını açıklar.

Yetişkin Farelerden Atriyal ve Ventrikül Miyositlerinin Eşzamanlı İzolasyonu için Langendorff Yönteminin Modifikasyonları

Öğrenin, fare atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerin izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemini. Bu protokol, Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümünü mümkün kılar.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu (Video) | JoVE Journal

^Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Daha fazla video keşfet