Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonları ciddi bir sağlık sorunudur. Bu protokol, ürogenital bakterilere kısa süreli maruz kalmanın mesaneye nasıl zarar verdiğini ve E.Coli tekrarlayan İYE'yi nasıl tetiklediğini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu modelin bir avantajı, mesane pul pul dökülme ve tekrarlayan İYE'nin, tekrarlayan İYE yaşayan kadınlarda sıklıkla bol miktarda bulunan ürogenital bakteri Gardnerella vaginalis tarafından tetiklenmesidir.

G.vaginalis türünü eksi 80 santigrat derece dondurucu stoğundan anaerobik bir odaya çevirerek başlayın. Bakterileri antibiyotik kullanmadan bir NYCIII plakasına sürün. Plakayı anaerobik olarak 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

Anaerobik odada, beş mililitre anaerobik NYCIII ortamını NYCIII plakasından hücrelerle dolu bir mikrolitrelik bir döngü ile aşılayın ve kültürü anaerobik koşullar altında 18 saat boyunca 37 Santigrat derecede statik olarak inkübe edin. Büyüme ortamına antibiyotik dahil etmeyin. Bir spektrofotometre kullanarak kültürün OD600'ünü belirleyin.

Ardından, bir dakika boyunca 9.600 kez G'de santrifüjleyin ve ortamı aspire edin. PBS'deki bakteri peletini istenen konsantrasyona yeniden süspanse edin ve aşıyı seri olarak seyreltin ve plakalayın. Ekli bir filtreye sahip bir sitohuni kasetindeki 90 mikrolitre PBS'ye 10 mikrolitre idrar ekleyin.

Kasetleri bir slaytla sitosantrifüje yerleştirin ve yüksek ivme ile altı dakika boyunca 600 ila 800 kez G'de döndürün. Slaytları çıkardıktan ve gece boyunca kurumaya bıraktıktan sonra, slaytları bir hematoloji boyama kiti ile boyayın ve PMN'lerin ve epitel hücrelerinin varlığı için ışık mikroskobu ile analiz edin. Fiksatif ile tüberkülin kayar uçlu şırınga bir kez, şırınga işaretlerinin karşısına bakacak şekilde ucuna bir kateter yapıştırın.

İğne ucunu açığa çıkarmamaya dikkat ederek fazla boruyu iğnenin ucundan bir ila iki milimetre koparın. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı hafifçe vurun ve pistonu havayı boşaltmak için itin. Daha sonra kateteri bir mikrosantrifüj tüpü üzerinden fiksatif ile doldurun Fareyi uyuşturduktan ve kurban ettikten sonra, bacaklar sabitlendikten sonra, mesaneyi ortaya çıkarmak için farenin pelvik bölgesini forseps ve bir çift cerrahi makasla açın.

Bitişik yağı dikkatlice bir kenara itin, ancak mesaneyi yerinde bırakın. Şırıngayı, iğne aşağı bakacak şekilde baskın elinizle tutun. Kateter ucunu steril kayganlaştırıcıya batırın ve şırınga namlusunu fare gövdesi üzerinde 30 ila 45 derecelik bir açıyla tutarak kateter ucunu üretral açıklığa yerleştirin.

Saat yönünde hafif bir hareketle aşağı doğru basınç uygulayın ve kateteri yavaşça üretraya yerleştirin Kateter ucu girerken, şırınga namlusu çalışma yüzeyine paralel olana kadar kateteri üretraya daha fazla kaydırmaya devam ederken şırıngayı farenin kuyruğuna doğru çevirin. Kateter iğne milinin tamamı fareye girmeli ve kateter ucunu mesane lümeni içinde konumlandırmalıdır. Yavaşça 50 ila 80 mikrolitre sabitleyici verin ve mesanenin bir balon gibi şişmesine neden olun.

Kateteri yerinde tutun ve şırıngayı hafifçe kaldırın, ucunu yukarı doğru eğin. Diğer elinizle bir hemostat açın ve üretranın kesişme noktasında kateter iğnesinin altına bir uç kaydırın. Kanama durdurucuyu sadece iğne ile temas edene kadar kısmen kapatın.

Fiksatif kaybını önlemek için kanama durdurucuyu tamamen sıkıştırıp kilitlerken aynı anda kateter iğnesini mesaneden dışarı kaydırın. Kanama durdurucuyu, mesane üstte dururken çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde kavrayın. Hemostat hala takılıyken mesaneyi çıkarmak için hemostatın altından nazikçe ve dikkatlice kesin ve kaldırın.

Mesaneyi ve bağlı hemostatı ısıtılmış fiksatif içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Mesanenin sıvıya tamamen batırıldığından ve tüpün duvarlarına bastırılmadığından emin olun. Elektron mikroskobu ile mesaneyi görüntülemek için, temiz, çift taraflı bir tıraş bıçağı veya neşter ile sagittal olarak ikiye bölün ve mesaneyi serbest bırakmak için kanama durdurucuya teğet ikinci bir kesi yapın.

Bu, iki yarım mesane kabı ile sonuçlanır. Mesanenin dışında kalan yağ yastıkçıkları varsa, bunları nazikçe çıkarın. Mesane yarısını sodyum kakodilat tamponunda üç kez durulayın.

Dokuyu oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.15 molar kakodilat tamponunda% 1 osmiyum tetroksit ile boyayın. Karanlık bir ortamı korumak için bu adımı folyoya sarılmış boyama kabı ile gerçekleştirin. Boyamadan sonra, mesane yarısını ultra saf suda üç kez durulayın.

Suyun yüzeyinde osmikasyonlu yağ görülürse, kurutma adımları sırasında kirlenmeyi önlemek için aspire edin veya fitilleyin. Dokuyu kuruttuktan sonra, toplam dört parça oluşturmak için mesane yarısını temiz, çift taraflı bir tıraş bıçağıyla karıştırın. Aşılamayı takiben, idrarda UPEC titreleri tespit edilebilir.

UPEC bakteriüri seviyesi birinci gün yüksektir ve daha sonraki zaman noktalarında azalmadan önce ilk hafta boyunca artabilir. Farelerin yaklaşık% 65 ila 80'inde aşılamadan 28 gün sonra idrarda saptanabilir bir UPEC olmayacaktır. Bu fareler, modelin sonraki adımlarında kullanılabilir.

Bakteriürik kalan fareler deneyden çıkarılmalıdır. 12 saat veya bir hafta arayla verilen iki ardışık G. vaginalis maruziyeti, tekrarlayan bakteriüriye neden olmak için hücre içi rezervuarlardan UPEC'in ortaya çıkmasına neden olur. İdrar sitolojisi analizi, UPEC ortaya çıkışı gösteren G. Vaginalis'e maruz kalan farelerden alınan idrardaki polimorfonükleer hücreleri tespit etmek için kullanılabilir.

Bir hafta arayla iki maruziyetin verildiği modelde, mesane dokusundaki UPEC titreleri, muhtemelen UPEC'in rezervuarlardan çıkması ve müteakip klerens nedeniyle G. vaginalis'e maruz kalan farelerde PBS'ye kıyasla daha düşüktür. SEM ile in situ sabit mesane dokusunun görselleştirilmesi, sadece PBS'ye maruz kalan kontrol farelerinde mesane yüzeyini kaplayan büyük, yüzeysel şemsiye ürotelyal hücreleri ortaya çıkarır. Ürotelyal pul pul dökülme, yüzeysel şemsiye hücrelerinin kaybı ile kanıtlanır ve G.vaginalis'e maruz kalan farelerde altta yatan daha küçük geçiş epitelini ortaya çıkarır.

UPEC aşılamasından hemen sonra, hücre içi rezervuarların kurulması sırasında, ürotelyum üzerinde bakteri hücreleri görülebilir ve pul pul dökülen hücrelerden filamentlenir. Burada açıklanan yöntemler, ek Gardnerella suşlarının veya diğer ürogenital türlerin E.coli rUTI üzerindeki etkisini araştırmak için gelecekteki çalışmaların önünü açmaktadır.