Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi
20 Mart 2021
Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.
Merhaba, Strazburg Moleküler ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü'nde RNA'nın laboratuvar mimarisine ve reaktivitesine hoş geldiniz. İyi defisitleyen kristaller yetiştirmek, herhangi bir kristalografik çalışmada kritik bir adımdır. Bu videoda, bir biyomolekülün kristallerini yetiştirmek ve yerinde X-ışını kırınımı ile 3D yapısını belirlemek için yeni bir mikroakışkan aracın kullanımını göstereceğiz.
ChipX adı verilen mikroakışkan cihaz çeşitli avantajlar sunuyor. Karşı difüzyon yöntemiyle kristalizasyon varlıklarını küçültmek ve kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Kurulumu kolaydır ve standart laboratuvar malzemesi ile gerçekleştirilir.
Ayrıca seri X-ışını kristalografisi ile çipte yetişen kristallerin doğrudan karakterizasyonu için optimize edilmiştir. ChipX, kristal işleme ve kriyo soğutma adımlarını ortadan kaldırır ve yerinde ve oda sıcaklığında analiz edilen kristallerin iç kalitesini korur. ChipX, 7,5'e 2,5 santimetre mikroskop slayt formatına sahiptir.
80'e 18 mikrometre kesitli ve dört santimetre uzunluğunda kristalleşme odası olarak kullanılan sekiz mikroakışkan kanal içerir. Sol taraftaki giriş, rezervuarlara kadar sekiz kanalı dolduracak biyomolekül çözeltisinin manuel enjeksiyonuna izin verir. Kristalizasyon çözeltileri sağ taraftaki bu rezervuarlarda biriktirilir.
Kristalleşme, karşı difüzyon adı verilen bir fenomen tarafından tetiklenir. Kristalize edici madde biyomolekül çözeltisine yayılıp bir konsantrasyon ve süper doygunluk gradyanı oluşturduğunda. Kanallar boyunca etiketler ve bost kristallerin daha kolay bulunmasına yardımcı olun.
Bir çip kurmak, mililitre başına beş ila 10 miligramlık tipik bir konsantrasyonda beş ila altı mikrolitre biyomolekül çözeltisi gerektirir. Bir mikrolitre parafin yağı, rezervuar başına beş mikrolitre kristalizasyon çözeltisi ve yapışkan bant. ChipX'in yüklenmesi bir mikropipette ve standart uçlarla manuel olarak gerçekleştirilir.
Enjeksiyon işleminin daha iyi görselleştirilmesi için bu örnekte mavi bir örnek çözeltisi kullanılır. Sızıntıyı önlemek için, uç numune girişine çipe dik olarak yerleştirilir. Kanalları birbirinden ayırmak için numuneden sonra bir mikroliter parafin yağı yüklenir.
Numune girişi daha sonra bantla kapatılmıştır. Sekiz rezervuar, beş mikrolitre kristalize edici ajan çözeltisi ile ayrı ayrı yüklenir. Bunu yapmak için, pipet ucu yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kanalın sonuna yakın yerleştirilir.
Bu, numune ile kristalize edici madde arasında bir hava kabarcığı oluşumunu önler. Rezervuarlar, tarama veya optimizasyon için çeşitli tamponlar, polimerler veya tuzlar içeren kokteyllerle doldurulabilir. Rezervuarlar bantla kapatılmış.
Burada gösterildiği gibi, bir çip kurmak kolaydır ve sadece birkaç dakika sürer. ChipX'te kristalleşme karşı difüzyon ile gerçekleşir. Rezervuarlarda biriken kristalize edici ajanlar biyomolekül içeren kanallara yayılır.
Bu, kristalleşmeyi tetikleyecek konsantrasyon ve süper doygunluk gradyanları oluşturur. Bunlar, kanalların içinde elde edilen bir enzimin kristal örnekleridir. 80'e 80 mikrometre kesite sahip kanalları doldurmak için büyüyebilirler.
Kristaller ChipX'te UV ışığı altında triptofan kalıntılarının doğal floresanını kullanarak floresan mikroskopisi ile veya floresan etiketli bir protein kullanılarak burada gösterildiği gibi kolayca tespit edilebilir. Bu bölümde, filaggrins İsviçre'deki İsviçre ışık kaynağında gerçekleştirilen bir Chris telgraf analizi gösterilmiştir. Çipler, herhangi bir ek ekipman veya özel bakım olmadan senkrotrona taşınabilir.
İsviçre ışık kaynağının salonuna girelim. Elektronlar merkezi halkada dolaşır ve farklı kiriş hatlarında sömürülen x ışınları da dahil olmak üzere geniş bir elektromanyetik dalga spektrumu oluşturur. Bu video, makro-moleküler kristalografiye adanmış bir kiriş çizgisi olan X06'da kaydedildi.
Protokol bir senkrotron tesisinden diğerine değişebilir, ancak genel ilke aynı kalır. ChipX, 3D baskılı bir tutucuya monte edilir. Bu tutucu daha sonra standart bir goniometrenin mıknatısuna tutturulur.
Seri analiz, çipte yetişen bir dizi kristalden veri toplama tutarlı. Kristal konumların listeleri, çip kanalları boyunca etiketler ve bost kullanılarak kurulur. Araştırmacılar çipi, sarı pencerenin sembolize ettiği x-ışını ışınındaki kristalleri merkeze almak için hareket ettiriyor.
X-ray ışını kullanılarak hızlı bir merkezleme prosedürü başlatılır. Işın durağı yerine çıkar ve dedektör numuneye doğru hareket eder. Izgara taraması, kristalin ışınla hizalı olduğundan emin olmak için gerçekleştirilir.
Çipi 30 derece döndürdükten sonra aynı prosedür tekrarlanır. İkinci adım önemlidir, çünkü talaş malzemesi, gözlemlenen kristal konumuna göre kırınım maksimum kaymasına yol açan bir paraloksik etki yaratır. Kristal ışında ortalanır merkezlenmez veri toplama başlar.
Bu sıra, veri toplamayı gerçek zamanlı olarak gösterir. Çip 30 derece döner. Bu arada, ilgili kırınım görüntüleri dedektör tarafından toplanır.
Bu kristalin karakterizasyonu tamamlandı. Çip kanaldaki bir sonraki kristale çevrildi ve tüm prosedür tekrarlandı. Bu analizin kristalin doğrudan elleçlenmeden ve oda sıcaklığında yerinde çalıştırdığını unutmayın.
Bir dizi kristal üzerinde toplanan veriler daha sonra mavi renkle gösterilen bir elektron yoğunluk haritasını hesaplamak ve atomik modeli oluşturmak için kullanılan tam bir kırınım veri kümesi elde etmek için birleştirilir. Bu videoda açıklanan prosedür, tRNA modifikasyon enziminin yapısal karakterizasyonu çerçevesinde uygulanmıştır. Soğuk adapte bakteriden CCA ekleyen enzim, Planococcus halocryophilus.
ChipX, kristalize edici bir ajan olarak amonyum sülfit varlığında karşı difüzyon ile enzimi kristalize etmek için kullanıldı. 20 santigrat derecede birkaç günlük kuluçkadan sonra kanallar boyunca piramit kristalleri ortaya çıktı. Proteinin floresan etiketlemesi, protein kristallerinin tanımlanmasını ve tuz kristallerinden ayrımcılığa neden oldu.
Bir dizi kristal yerinde ve oda sıcaklığında analiz edildi. Kırınım verileri birleştirildi ve 2.5 angstrom çözünürlükte APOE enziminin kristal yapısına yol açtı. Ek olarak, çip kanallarındaki ortamın yayılması, kristalleri oluşturan enzime bir substrat sunmak için sömürüldü.
Mevcut durumda, senkrotron analizinden iki gün önce rezervuar çözeltilerine bir CTP analogu eklenmiştir. Bu, bileşiğin yayılmasına ve enzimin katalitik bölgesine ulaşmasına izin verir. Kompleksin kristal yapısında görüldüğü gibi 2.3 angstrom çözünürlükte belirlenir.
Bu videoda gösterilen protokol genellikle geçerlidir ve çeşitli biyomoleküller üzerinde test edilmiştir. Sonuç olarak ChipX, kristalografik bir çalışmanın tüm adımlarını entegre eden ve benzersiz bir mikroakışkan cihazda biyomedikal çözeltiden kristal yapıya geçmenizi sağlayan bir Laboratuvar çip aracıdır. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz.
ve biomolecule tarafından favorilerinizin kristal yapısını kristalize etmek ve belirlemek için ChipX kullanmanın yararları hakkında sizi ikna ettiğimizi umuyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, karşı yayılma kullanarak enzim kristalizasyonu için tasarlanmış bir mikroakışkan cihaz olan ChipX'i açıklar. Yüksek kaliteli kristallerin büyümesini sağlar ve yerinde X-ışını kırınım analizi için izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Kristalografya
- Yapısal Biyoloji
Arka Plan
- Kristallaştırma, biyomoleküllerin 3D yapısını belirlemek için esastır.
- Geleneksel yöntemler karmaşık işleme ve kriyo-soğutma adımlarını içerir.
- Mikroakışkan cihazlar kristalizasyon sürecini hızlandırabilir.
- ChipX, oda sıcaklığında kristallerin doğrudan karakterizasyonu için optimize edilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- Enzim kristalizasyonu için ChipX kullanımını göstermek.
- Yerinde X-ışını kırınımının avantajlarını sergilemek.
- Cihazın etkin kullanımı için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- ChipX'in biyomolekül ve kristalizasyon çözeltileriyle kurulumu.
- Mikroakışkan kanallardaki karşı yayılma yoluyla kristalizasyon.
- Yapısal analiz için yerinde X-ışını kırınımı.
- Birden çok kristalden elle tutmadan veri toplama.
Ana Sonuçlar
- ChipX kullanılarak enzim kristallerinin başarılı bir şekilde büyütülmesi.
- Yerinde analiz, yüksek kaliteli kırınım verileri sağlamıştır.
- Kristal işlememenin artırılması kristal bütünlüğünü geliştirmiştir.
- Planococcus halocryophilus'tan CCA ekleyen enzimdeki uygulamanın gösterilmesi.
Sonuçlar
- ChipX, biyomoleküler kristalizasyon için çok yönlü bir araçtır.
- Süreci basitleştirir ve veri kalitesini artırır.
- Bu yöntem, yapısal çalışmalar için çeşitli biyomoleküllere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-quality structural determination of enzyme:substrate complexes is a critical inflection point in early drug discovery and target validation. The ChipX microfluidic platform enables in situ crystallization and serial X-ray analysis, reducing sample handling and preserving crystal integrity for more reliable structural insights. This integrated workflow supports predictive confidence in structure-based drug design and accelerates portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of enzyme:substrate interactions for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing high-resolution structural data.
- Facilitates rapid hypothesis testing through streamlined crystallization and analysis.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, convection-free crystal growth for assay standardization.
- Allows parallel screening of crystallization conditions within a single chip.
- Provides quantitative diffraction outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Preserves native-like crystal environments for disease-relevant structural studies.
- Enables substrate diffusion into crystals, supporting translational biomarker alignment.
- Maintains continuity from discovery-stage structural biology to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ChipX integrates seamlessly from early discovery through lead identification by enabling in situ structural analysis without cryo-cooling or manual crystal handling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven target interrogation and pathway clarification via direct structure determination.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible crystals for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates high-quality diffraction datasets for robust comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates substrate soaking and complex formation for translationally relevant targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform adaptable to diverse biomolecules and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Minimizes manual handling, enhances reproducibility, and streamlines workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and crystallography for optimal setup and analysis.
- Needs access to synchrotron or advanced X-ray diffraction infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chip loading and data collection protocols.
- Adaptable to a range of protein and enzyme systems with minimal protocol modification.
- Limited by the size and type of biomolecules compatible with microfluidic channels.
