Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

Merhaba, Strazburg Moleküler ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü'nde RNA'nın laboratuvar mimarisine ve reaktivitesine hoş geldiniz. İyi defisitleyen kristaller yetiştirmek, herhangi bir kristalografik çalışmada kritik bir adımdır. Bu videoda, bir biyomolekülün kristallerini yetiştirmek ve yerinde X-ışını kırınımı ile 3D yapısını belirlemek için yeni bir mikroakışkan aracın kullanımını göstereceğiz.

ChipX adı verilen mikroakışkan cihaz çeşitli avantajlar sunuyor. Karşı difüzyon yöntemiyle kristalizasyon varlıklarını küçültmek ve kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Kurulumu kolaydır ve standart laboratuvar malzemesi ile gerçekleştirilir.

Ayrıca seri X-ışını kristalografisi ile çipte yetişen kristallerin doğrudan karakterizasyonu için optimize edilmiştir. ChipX, kristal işleme ve kriyo soğutma adımlarını ortadan kaldırır ve yerinde ve oda sıcaklığında analiz edilen kristallerin iç kalitesini korur. ChipX, 7,5'e 2,5 santimetre mikroskop slayt formatına sahiptir.

80'e 18 mikrometre kesitli ve dört santimetre uzunluğunda kristalleşme odası olarak kullanılan sekiz mikroakışkan kanal içerir. Sol taraftaki giriş, rezervuarlara kadar sekiz kanalı dolduracak biyomolekül çözeltisinin manuel enjeksiyonuna izin verir. Kristalizasyon çözeltileri sağ taraftaki bu rezervuarlarda biriktirilir.

Kristalleşme, karşı difüzyon adı verilen bir fenomen tarafından tetiklenir. Kristalize edici madde biyomolekül çözeltisine yayılıp bir konsantrasyon ve süper doygunluk gradyanı oluşturduğunda. Kanallar boyunca etiketler ve bost kristallerin daha kolay bulunmasına yardımcı olun.

Bir çip kurmak, mililitre başına beş ila 10 miligramlık tipik bir konsantrasyonda beş ila altı mikrolitre biyomolekül çözeltisi gerektirir. Bir mikrolitre parafin yağı, rezervuar başına beş mikrolitre kristalizasyon çözeltisi ve yapışkan bant. ChipX'in yüklenmesi bir mikropipette ve standart uçlarla manuel olarak gerçekleştirilir.

Enjeksiyon işleminin daha iyi görselleştirilmesi için bu örnekte mavi bir örnek çözeltisi kullanılır. Sızıntıyı önlemek için, uç numune girişine çipe dik olarak yerleştirilir. Kanalları birbirinden ayırmak için numuneden sonra bir mikroliter parafin yağı yüklenir.

Numune girişi daha sonra bantla kapatılmıştır. Sekiz rezervuar, beş mikrolitre kristalize edici ajan çözeltisi ile ayrı ayrı yüklenir. Bunu yapmak için, pipet ucu yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kanalın sonuna yakın yerleştirilir.

Bu, numune ile kristalize edici madde arasında bir hava kabarcığı oluşumunu önler. Rezervuarlar, tarama veya optimizasyon için çeşitli tamponlar, polimerler veya tuzlar içeren kokteyllerle doldurulabilir. Rezervuarlar bantla kapatılmış.

Burada gösterildiği gibi, bir çip kurmak kolaydır ve sadece birkaç dakika sürer. ChipX'te kristalleşme karşı difüzyon ile gerçekleşir. Rezervuarlarda biriken kristalize edici ajanlar biyomolekül içeren kanallara yayılır.

Bu, kristalleşmeyi tetikleyecek konsantrasyon ve süper doygunluk gradyanları oluşturur. Bunlar, kanalların içinde elde edilen bir enzimin kristal örnekleridir. 80'e 80 mikrometre kesite sahip kanalları doldurmak için büyüyebilirler.

Kristaller ChipX'te UV ışığı altında triptofan kalıntılarının doğal floresanını kullanarak floresan mikroskopisi ile veya floresan etiketli bir protein kullanılarak burada gösterildiği gibi kolayca tespit edilebilir. Bu bölümde, filaggrins İsviçre'deki İsviçre ışık kaynağında gerçekleştirilen bir Chris telgraf analizi gösterilmiştir. Çipler, herhangi bir ek ekipman veya özel bakım olmadan senkrotrona taşınabilir.

İsviçre ışık kaynağının salonuna girelim. Elektronlar merkezi halkada dolaşır ve farklı kiriş hatlarında sömürülen x ışınları da dahil olmak üzere geniş bir elektromanyetik dalga spektrumu oluşturur. Bu video, makro-moleküler kristalografiye adanmış bir kiriş çizgisi olan X06'da kaydedildi.

Protokol bir senkrotron tesisinden diğerine değişebilir, ancak genel ilke aynı kalır. ChipX, 3D baskılı bir tutucuya monte edilir. Bu tutucu daha sonra standart bir goniometrenin mıknatısuna tutturulur.

Seri analiz, çipte yetişen bir dizi kristalden veri toplama tutarlı. Kristal konumların listeleri, çip kanalları boyunca etiketler ve bost kullanılarak kurulur. Araştırmacılar çipi, sarı pencerenin sembolize ettiği x-ışını ışınındaki kristalleri merkeze almak için hareket ettiriyor.

X-ray ışını kullanılarak hızlı bir merkezleme prosedürü başlatılır. Işın durağı yerine çıkar ve dedektör numuneye doğru hareket eder. Izgara taraması, kristalin ışınla hizalı olduğundan emin olmak için gerçekleştirilir.

Çipi 30 derece döndürdükten sonra aynı prosedür tekrarlanır. İkinci adım önemlidir, çünkü talaş malzemesi, gözlemlenen kristal konumuna göre kırınım maksimum kaymasına yol açan bir paraloksik etki yaratır. Kristal ışında ortalanır merkezlenmez veri toplama başlar.

Bu sıra, veri toplamayı gerçek zamanlı olarak gösterir. Çip 30 derece döner. Bu arada, ilgili kırınım görüntüleri dedektör tarafından toplanır.

Bu kristalin karakterizasyonu tamamlandı. Çip kanaldaki bir sonraki kristale çevrildi ve tüm prosedür tekrarlandı. Bu analizin kristalin doğrudan elleçlenmeden ve oda sıcaklığında yerinde çalıştırdığını unutmayın.

Bir dizi kristal üzerinde toplanan veriler daha sonra mavi renkle gösterilen bir elektron yoğunluk haritasını hesaplamak ve atomik modeli oluşturmak için kullanılan tam bir kırınım veri kümesi elde etmek için birleştirilir. Bu videoda açıklanan prosedür, tRNA modifikasyon enziminin yapısal karakterizasyonu çerçevesinde uygulanmıştır. Soğuk adapte bakteriden CCA ekleyen enzim, Planococcus halocryophilus.

ChipX, kristalize edici bir ajan olarak amonyum sülfit varlığında karşı difüzyon ile enzimi kristalize etmek için kullanıldı. 20 santigrat derecede birkaç günlük kuluçkadan sonra kanallar boyunca piramit kristalleri ortaya çıktı. Proteinin floresan etiketlemesi, protein kristallerinin tanımlanmasını ve tuz kristallerinden ayrımcılığa neden oldu.

Bir dizi kristal yerinde ve oda sıcaklığında analiz edildi. Kırınım verileri birleştirildi ve 2.5 angstrom çözünürlükte APOE enziminin kristal yapısına yol açtı. Ek olarak, çip kanallarındaki ortamın yayılması, kristalleri oluşturan enzime bir substrat sunmak için sömürüldü.

Mevcut durumda, senkrotron analizinden iki gün önce rezervuar çözeltilerine bir CTP analogu eklenmiştir. Bu, bileşiğin yayılmasına ve enzimin katalitik bölgesine ulaşmasına izin verir. Kompleksin kristal yapısında görüldüğü gibi 2.3 angstrom çözünürlükte belirlenir.

Bu videoda gösterilen protokol genellikle geçerlidir ve çeşitli biyomoleküller üzerinde test edilmiştir. Sonuç olarak ChipX, kristalografik bir çalışmanın tüm adımlarını entegre eden ve benzersiz bir mikroakışkan cihazda biyomedikal çözeltiden kristal yapıya geçmenizi sağlayan bir Laboratuvar çip aracıdır. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz.

ve biomolecule tarafından favorilerinizin kristal yapısını kristalize etmek ve belirlemek için ChipX kullanmanın yararları hakkında sizi ikna ettiğimizi umuyoruz.