Name: Endoplazmik Retikulum Stresli Nöronlarda Lentivirüs Kaynaklı Spesifik ShRNAlar Tarafından Moleküler Modülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Keşfedin, endoplazmik retikulum stresli kortikal nöronlarda lentivirüs kaynaklı shRNA ile kalsineurin ve CHOP gen susturmasını. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklardaki koruyucu ve apoptotik yolları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Gonzalo Quasollo'ya görüntüleme konusundaki paha biçilmez yardımları için ve hücre kültürü teknik desteği için Dr. Andrea Pellegrini'ye teşekkür ederiz.
Bu araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (#RO1AG058778-01A1, UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra arasındaki Alt Ödül Anlaşması No 165148/165147) ve Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Arjantin Ulusal Ajansı'ndan (ANPCyT, PICT 2017 #0618) hibelerle desteklenmiştir.

Hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun onaylanmış protokollerini izleyerek gerçekleştirilir. Çalışmanın yürütülmesi için onay, INIMEC-CONICET-UNC Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi (CICUAL) tarafından verilmektedir (Karar numaraları 014/2017 B ve 006/2017 A).
1. Primer sıçan kortikal nöron kültürleri
<ol><li>E18 Wistar hamile sıçanları, 60 s maruz kalma için% 80 CO 2/20%O2 karışımı ile bir CO2 odasında anestezi yapın ve daha sonra servikal omurları yerinden ederek feda edin.</li>
	<li>Laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın. Ensefalonu, forseps stili # 3 ve düz keskin küçük yaylı makas (Malzeme Tablosu) ile embriyolardan hücre kültürü kaplarında Hanks çözeltisine çıkarın.</li>
	<li>Dokuyu 20x büyüteç altında disseke edin, iki ince uçlu forseps stili #5 kullanarak frontal korteksi meninkslerden ayırın. Frontal korteksi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve dokuyu kimyasal sindirim için 37 ° C'de 15 dakika boyunca 3-4 mL Tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edin.</li>
	<li>Sindirimden sonra, 3-4mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) artı% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile seyreltin. Daha sonra Ca 2+/Mg2+ içermeyen Hanks Dengeli Tuz çözeltisi ve santrifüjleme yoluyla% 0.1 glikoz (5 dakika boyunca 3000 g) ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>DMEM artı FCS (Malzeme Tablosu) içinde 1000 μL'lik bir uç kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu 10 kez mekanik olarak ayrıştırın. Daha sonra homojenatı 1 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj edin, süpernatantı toplayın ve kalan hacmi 1000 μL'ye tamamlayın.</li>
	<li>Hücre kültürü tabakları üzerindeki hücre süspansiyonunu,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 esansiyel bir aminoasit katkı maddesi içeren 2 mL DMEMile 520 hücre / mm2 yoğunlukta plakalayın (bkz. Daha sonra nemlendirilmiş bir ortamda 37 °C'de 2 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.<ol><li>Organik madde giderimi ve hücre kültürü kaplarının poli-L-lizin kaplaması<ol><li>Cam malzemeyi bir reaksiyon odasına yerleştirerek organik maddeyi çıkarın ve malzemeyi hemen hemen örtmek için% 96 etil alkol ekleyin. Ardından, kahverengimsi-yeşilimsi kabarcıklar görünmeye başlayana kadar% 68 (w / v) nitrik asit damla damla ekleyin. Bu gerçekleştiğinde, kabı kısmen örtün ve patlama durana kadar reaksiyonun devam etmesine izin verin. NOT: Zararlı gazlara maruz kalmamak için organik maddeyi bir gaz emme kabininin altından çıkarın.</li>
			<li>Poli-L-lizin kaplamadan önce, camları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın. Daha sonra kültür bardaklarını ve tabaklarını kullanmadan önce 4 saat boyunca 0.1 μg / μL poli-L-lizin ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bardakları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Nöral hücre farklılaşmasına izin vermek için, serumsuz bir nörobazal ortamın ortamını, serumsuz takviye ile değiştirin (Malzeme Tablosu). Kültürlerini tedaviye kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.</li>
</ol>2. Lentivirüs üretimi
NOT: CN-Aα izoformu veya CHOP'un 3'UTR'lerini hedefleyen dizileri ve hedeflemeyen dizileri (karıştırmalar) içeren oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir.
<ol><li>Tavlama için, Tavlama Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak iki tek sarmallı oligonükleotidi eşit molar miktarlarda tamamlayıcı dizilerle karıştırın.</li>
	<li>95 °C'de 2 dakika ısıtın ve ardından numuneleri ısı bloğundan veya su banyosundan oda sıcaklığında bir tezgaha aktararak yavaşça soğutun. Elde edilen ürünü [kısa saç tokası RNA, (shRNA) yapışkan uçlu] 0.5 μM'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin, alikot edin ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>shRNA ekini lentiviral vektör pLKO.3G'ye klonlayın, GFP yeşil floresan işaretleyici olarak. Bunun için, aşağıdakileri steril bir tüpte karıştırarak EcoRI ve PacI kısıtlama enzimleri ile 1 μg vektörü sindirin: 2 μL 10x kısıtlama enzim tamponu (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini), 1 μL 1 μg / μL pLKO.3G, 0.5 μL 10 U / μL ECoRI, 0.5 μL PacI (10 U / μL) ve 16 μL steril iyonize su.<ol><li>Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Reaksiyonu 37 ° C'de 3-4 saat boyunca inkübe edin. NOT: Gece boyunca yapılan sindirimlemeler genellikle gereksizdir ve DNA bozulmasına neden olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligasyon için, sindirilmiş vektörü karıştırın ve 3: 1'lik bir molar oranında yerleştirin ve 16 ° C'de gece boyunca T4 ligaz ve ligaz tamponu (üretici tarafından sağlanan) ile inkübe edin. NOT: Bu noktada ligasyon reaksiyonu daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>DH5α yetkin hücreleri (Malzeme Tablosu) veya başka bir uygun E. coli suşunu ligasyon reaksiyonu ile aşağıdaki gibi dönüştürün.<ol><li>Yetkili E. coli'yi toplam ligasyon reaksiyonu hacmi ile karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutun, 2 dakika boyunca 42 ° C'lik bir banyoya koyun ve ardından 15 dakika boyunca tekrar buz üzerinde soğutun.</li>
		<li>Isı şokuna maruz kalan toplam hacmi 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve daha önce 37 ° C'de tutulan Luria-Bertani (LB) sıvı ortamı ile hacmi 1000 μL'ye tamamlayın. Bakterileri 37 ° C'de 90 dakika boyunca yaklaşık 330 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda çalkalayın.</li>
		<li>Onları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve 900 μL süpernatan atın. Peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın. Bakteri süspansiyonunu katı bir ampisilin (100 μg / mL) LB plakası üzerine eşit olarak yayın.</li>
		<li>Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından bakteri büyümesini kontrol edin. Bu noktada, bakteriler 4-5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
		<li>10 mL LB sıvı ortamı ve ampisilin (100 μg / mL) içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarmak için tek bir koloni seçin. Bakterileri yaklaşık 330 rpm'de 37 ° C'de AÇIK olarak çalkalayın.</li>
		<li>Bakterileri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de peletlemek için kültürü santrifüj edin, süpernatantı atın ve bakteri peletini koruyun. Bu -20 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazmidi, üreticinin talimatlarını izleyerek bakteri peletinden bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın (Malzeme Tablosu). Aşağıdaki ilişkiyi kullanarak 260 nm'deki absorbansı ölçerek ve seyreltme faktörü ile çarparak DNA konsantrasyonunu hesaplayın: 1.0 = 50 μg / mL saf çift sarmallı (ds) DNA'nın260'ı .</li>
</ol>3. Lentivirüs enfeksiyonu
NOT: Lentivirüs üretim prosedürünü Sınıf II laminer akış başlığında uygulayın.
<ol><li>Transfeksiyondan 24 saat önce, tohum 1-5 × 106 HEK 293 hücrelerini 8 mL büyüme ortamında 100 mm çapında kültür kaplarına koyun ve bunları 37 °C'de,% 5 CO2'de gece boyunca inkübe edin.</li>
	<li>14 μg pKLO.3G vektörünü spesifik kesici uç, 10,5 μg ambalaj plazmidi psPAX ve 3,5 μg zarf plazmidi pMD2.G (Malzeme Tablosu) ile karıştırın. 45 μL plazmid transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosu) 700 μL indirgenmiş serum ortamında (Malzeme Tablosu) seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra DNA karışımını seyreltilmiş plazmid transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Bu arada, taze DMEM için HEK 293 hücre kültürlerinin kültür çanağının ortamını değiştirin (transfeksiyon sırasında% 70 akıcı). Ardından, DNA çözeltisinin tüm hacmini damla damla ekleyin. Yemeği nazikçe sallayın. Transfeksiyondan sonra ortam eklemek/değiştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>ShRNA'ların bir floresan mikroskobu kullanılarak GFP floresan tarafından kontrol edilen optimum transdüksiyonlarına ulaşmalarını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de, 48 h-72h için% 5 CO 2'de inkübe edin. Daha sonra, ortamı lentivirüs ile toplayın ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>0.45 μm naylon membranlı filtrat viral süpernatant. 1 mL'de akış Aliquot. Ardından, 4 saat boyunca 17.000 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti koruyun. Görünmez peletin kurumasına izin verin ve kuruduktan sonra - 80 ° C'de saklayın.<ol><li>Akı sitometrisi ile viral titrasyon gerçekleştirin. 24 delikli plakalarda tohum 4 x 105 HEK 293 hücre ve 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra viral parçacıkları 200 μL DMEM kültür ortamında (Malzeme Tablosu) yeniden askıya alın ve her bir kuyucuğa 0.05, 0.02 ve 0.005 μL ekleyin.</li>
		<li>Viral enfeksiyonu 72 saat boyunca inkübe edin, ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca tripsinize edin (% 0.05 tripsin, 1 mL). FCS çözeltisine 1 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Peleti 100 μL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri PBS'de 100 μL% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. Hücreleri bir akı sitometresi ile analiz edin ve GFP floresan hücrelerinin yüzdesini belirleyin. Aşağıdaki formülü kullanarak viral titrasyonunu hesaplamak için bu verileri toplayın: Viral Titrasyon <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>4. Ganglioside GM2 birikimi ve anti-MAP2 antikoru kullanan immünositokimya ile vurgulanan primer nöron kültürleri
<ol><li>Birincil kortikal nöron kültürlerini (15 gün in vitro) CN-Aα veya CHOP'un 3' UTR'lerini hedef alan spesifik shRNA oligonükleotidlerle enfekte edin ve bunları 1 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. NOT: 7-8 günlük primer kortikal nöron kültürleri in vitro olarak da hücreler yüksek nörit büyümesi gösteriyorsa kullanılabilir.<ol><li>Etanol içinde ganglioside GM2'nin 500 μM stok çözeltisini hazırlayın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>2 μM'lik son konsantrasyonda orta kültür yemeklerine GM2 stok çözeltisi ekleyin. 16, 24 ve 48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe etmeye bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Batı leke analizi için hücresel homojenat hazırlamak üzere bazı kültürleri kullanın (antikor spesifikasyonu için Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>1.4 numaralı adımları izleyin. ve 1.5. ve daha sonra hücreleri PBS'de% 4 PFA ve 120 mM sakkaroz ile 37 ° C'de 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın. Bu prosedürü ıslak bir odadaki kaymayı önleyici bir membran üzerinde gerçekleştirin. Daha sonra, 5 dakika boyunca geçirgenlik çözeltisi (PBS'de% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve PBS ile yıkayın.<ol><li>Blokaja izin vermek için PBS'de 45 dakika seyreltilmiş% 5 BSA kullanın, daha sonra anti-MAP2 antikoru ile inkübe edin, blokaj çözeltisinde 1:800 seyreltilmiş, gece boyunca 4 ° C'de.</li>
		<li>Kuluçka süresinin sonunda, PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca ikincil antikor (Malzeme Tablosu) ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve camları sulu bir montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin (Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Nörit atrofi analizi
<ol><li>CCD kamera ile donatılmış epifloresan ters çevrilmiş mikroskop kullanarak 20x hava lensi (NA 0.8) ile görüntüler elde edin. ImageJ eklentileriyle görüntüleri analiz edin. Bunun için resmi ImageJ'ye yükleyin ve İşlem | Arka planı çıkarın.</li>
	<li>Resme Tıklayın | Ayarlama | Eşik veya şu tuşları yazın: Ctrl (veya Cmd) + Üst Karakter + T. Minimum değerleri ayarlamak için bir pencere açılır ve yol ve soma izlemelerinin ayırt edilebilir olmasını sağlar. İkili resme tıklayın (nöritler ve somalar beyaz renklidir). Bu görüntüde, somonları silmek için serbest seçimi kullanın; seçilen soma bölgesi tekrar siyaha döner.</li>
	<li>İzleri seçin ve Düzenle'ye tıklayın | Seçim | Seçim Oluştur. Seçimin Ctrl (veya Cmd) ve T tuşlarına tıklayarak yatırım getirisini elde edin ve koruyun. Orijinal görüntüyü açın, ardından YG yöneticisi paneline tıklayın ve daha önce elde edilen ait YG'yi seçin. Ardından orijinal resme tıklayın.</li>
	<li>Yatırım getirisi görüntüde izlendikten sonra, Ctrl (veya Cmd) ve M tuşlarını (Analiz Et | Ölçün). Bir pencere açılır; istatistiksel analizi işlemek için ortalama değeri (keyfi birimler a.u.) kopyalayın. NOT: Değerleri μm olarak elde etmek için, Analiz Et | Ölçeği ayarlayın. Değerleri ayarlamak için bir pencere açılır. Doğru ölçeği eklediğinizden emin olun (Analiz | Set Scale) kullanılan mikroskobun özelliklerine bağlı olarak.</li>
</ol>

<ol><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+PERK+kinase+domain+suggests+the+mechanism+for+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).</li>
<li>Bollo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+interacts+with+PERK+and+dephosphorylates+calnexin+to+relieve+ER+stress+in+mammals+and+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs.</a> PLoS One. 5, 11925(2010).</li>
<li>Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+beta+protects+brain+after+injury+by+activating+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response.</a> Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).</li>
<li>Hetz, C., Saxena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).</li>
<li>Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+effects+of+PERK+and+IRE1+signaling+on+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability.</a> PLoS One. 4, 4170(2009).</li>
<li>Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+atrophy+and+apoptosis+mediated+by+PERK+signaling+after+accumulation+of+GM2-ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).</li>
<li>Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside-enhanced+neurite+growth%3A+evidence+for+a+selective+induction+of+high-molecular-weight+MAP-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2.</a> The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).</li>
<li>Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+%28shRNA%29%3A+design%2C+delivery%2C+and+assessment+of+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown.</a> Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Rusnak, F., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin%3A+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcineurin: form and function.</a> Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).</li>
<li>Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+is+crucial+for+the+induction+of+caspase-11+and+the+pathogenesis+of+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Bir nöronal hücre modelinde sağkalımdan apoptotik UPR fazlarına geçişin moleküler modülasyonunu sağlayan deneysel bir sistemi tanımladık.
Nörit atrofisinin doğru bir analizi için, çok, uzun, çok dallı süreçlere sahip birincil nöron kültürlerinin elde edilmesi esastır 9,11. Bu, nöron süreci uzantısının incelenmesini kolaylaştırır ve tedaviler arasındaki net farklılıkların tespit edilmesini sağlar. 7-8 günlük in vitro primer kor...

Endoplazmik retikulum (ER) stresi, organeldeki protein katlama kapasitesini tehlikeye atan herhangi bir pertürbasyon olarak tanımlanır. Katlanmamış proteinlerin ER lümeni içinde birikmesi, katlanmamış protein yanıtı (UPR) adı verilen bir transdüksiyon kaskad sinyalini aktive eder. Bu karmaşık sinyal yolu üç stres sensörü tarafından düzenlenir: PERK (protein kinaz RNA [PKR] benzeri ER kinaz), IRE1 (inositol gerektiren enzim 1) ve ATF6 (aktif transkripsiyon faktörü 6). Hep birlikte homeostazı restore etmeye çalışır. Ancak stres devam ederse, UPR sonunda apoptoz1 ile hücre ölümünü indükler.
Bir ER transmembran proteini olan PERK, ER stresi üzerine, ökaryotik başlatma faktörü-2 alfanın (eIF2α) fosforilasyonuna yol açarak, küresel protein sentezini ve dolayısıyla ER2'deki protein yükünü azaltır. Bir heterodimer Ca2+ fosfataz olan kalsinörin A/B'nin (CNA/B), PERK'in sitozolik alanını doğrudan bağladığını, oto-fosforilasyonunu arttırdığını ve protein translasyonunun ve hücre canlılığının inhibisyonunu önemli ölçüde arttırdığını gösterdik 3,4. İlginç bir şekilde, CNA / B, memeli beyninde bol miktarda bulunur ve CN'nin A alt biriminin iki izoformunu ayırt eder: α ve β.
Sürekli ER stresi altında, PERK sinyal yolu aktif kalan tek UPR dalıdır, böylece hem hayatta kalma yanlısı hem de apoptotik tepkiye aracılık eder. Kronik fazda, önemli bir aşağı akış olayı, transkripsiyon faktörü olan CHOP'un (CCAAT / arttırıcı bağlayıcı protein homolog protein) indüksiyonudur5. Kronik ER stresi, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik bozukluklara ortak bir katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir6. UPR'nin hücre ölümü yerine sitoprotektif sinyallemeyi nasıl kolaylaştırabileceğini anlamak önemlidir 7. Bununla birlikte, şu anda bu iki UPR fazı arasındaki geçişi kontrol eden kesin mekanizma hakkında çok az şey bilinmektedir.
Son zamanlarda, kültürlü nöronlarda, ganglioside GM2'nin ER membranlarında biriktiğini ve luminal kalsiyum tükenmesini indüklediğini bulduk. Bu da nörit atrofisi ve apoptoz 8'e aracılık eden PERK sinyallemesini aktive eder. Bu çalışmada, kültürlü nöronlarda GM2 birikimi, ER stresine bağlı nörit atrofisinin bir hücre sistemi modeli olarak kullanılmıştır. Spesifik olarak, iki PERK faktör ifadesi manipüle edilir, CN-Aα ve CHOP, erken / koruyucu olaylar ile kronik / apoptotik bir faz arasındaki geçişi değiştirir. Bunu başarmak için, ilgili genler susturulur; Böylece, primer kortikal nöron kültürleri lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte olur. Western blot analizi, karıştırılmış bir shRNA taşıyan lentivirüs ile enfekte olmuş kontrol hücrelerine kıyasla CN-Aα ve CHOP ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını ortaya koymaktadır. Bu tedaviden sonra, nöronlar ekzojen GM2'nin farklı kuluçka sürelerine tabi tutulur, sabit ve anti-mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) antikoru9 ile immünoboyalıdır. Görüntüler epifloresan mikroskop ile elde edilir. Toplam nörit büyümesi toplam hücre sayısına göre değerlendirilir.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-Fare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>anti-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td> <td># MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CN-A & alfa;</td><td>Millipore</td> <td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td> <td># 1961</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta; -aktin</td><td>Thermo Fisher</td> <td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td> <td># 3595</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 epifloresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 ek</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#17504944</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td><td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#16000044</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu forseps&nbsp; stil #5</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep stili #3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW ikincil antikor</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 ikincil antikor</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW ikincil antikor</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW ikincil antikor</td><td>LI-COR Biyolojik Bilimler</td> <td># 92632211</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral zarf plazmidi pMD2.G</td><td>Addgene</td> <td># 12259</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral ambalaj plazmidi psPAX2</td><td>Addgene</td> <td># 12260</td><td></td></tr><tr><td>lentiviral vektör pLKO.3G</td><td>Addgene</td> <td># 14748</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin hemisülfat</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td> <td># 295358</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin LTX & Artı Reaktif (plazmid transfeksiyon reaktifi)</td><td>Life Technologies</td><td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MİSYON shRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran 0.45 & mikro; m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey kızılötesi görüntüleme sistemi</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Azaltılmış serum ortamı)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td><td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td> <td># 45036</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsülfonil florür</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td> <td># 329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>sigma aldrich</td><td>P # 2636</td><td></td></tr><tr><td>Düz keskin küçük yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Promega</td><td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0.25</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td> <td># 25200056</td><td></td></tr><tr><td>Vibra Hücreli Ultrasonik Sıvı İşlemci (VCX 130)</td> <td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard plus SV Minipreps DNA arıtma sistemi</td><td>Promega</td><td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

endoplazmik retikulum stresli nöronlarda lentivirüs kaynaklı spesifik shrna'lar tarafından moleküler modülasyon

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

Herhangi bir stres durumunun neden olduğu endoplazmik retikulum (ER) içinde katlanmamış proteinlerin birikmesi, özel sensörlerin aktivasyonu yoluyla katlanmamış protein tepkisini (UPR) tetikler. UPR önce homeostazı restore etmeye çalışır; ancak hasar devam ederse, sinyal apoptozu indükler.
Sürekli ve çözülmemiş ER stresinin nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunduğuna dair kanıtlar artmaktadır. UPR, sitoprotektif ve apoptotik süreçler arasında geçiş yaparak hücre kaderini kontrol ettiğinden, bu geçişi tanımlayan olayları ve modülasyonunda yer alan unsurları anlamak önemlidir.
Son zamanlarda, anormal GM2 ganglioside birikiminin ER Ca2+ içeriğinin tükenmesine neden olduğunu ve bunun da UPR sensörlerinden biri olan PERK'yi (PKR benzeri-ER kinaz) aktive ettiğini gösterdik. Ayrıca, PERK sinyalizasyonu, GM2 birikiminin neden olduğu nörit atrofisine ve apoptozuna katılır. Bu bağlamda, aşağı akış PERK bileşenlerinin ekspresyonunu moleküler olarak modüle etmemize ve böylece nöronların nöritik atrofiye maruz kalma kırılganlığını değiştirmemize izin veren deneysel bir sistem kurduk.
Sıçan kortikal nöronal kültürlerinde kalsinörin (sitoprotektif) ve CHOP (pro-apoptotik) ekspresyonunun knockdown'unu gerçekleştirdik. Hücreler lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte edildi ve daha sonra farklı zamanlarda GM2 ile tedavi edildi, anti-MAP2 (mikrotüp ile ilişkili protein 2) antikoru ile sabitlendi ve immünoboyalandı. Daha sonra, hücre görüntüleri bir floresan mikroskobu kullanılarak kaydedildi ve toplam nörit büyümesi, kamu malı görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanılarak değerlendirildi. Bu PERK sinyal bileşenlerinin ekspresyonunun inhibisyonu, ER stresinin neden olduğu nöritik atrofiyi hızlandırmayı veya geciktirmeyi açıkça mümkün kılmıştır.
Bu yaklaşım, nöronların nörit atrofisine karşı savunmasızlığını değerlendirmek için ER stresinin hücre sistemi modellerinde kullanılabilir.

Burada, iki PERK aşağı akış bileşeninin susturulmasının bir ER gerilim hücresi modelinde UPR'nin geçiş aşamasını etkileyip etkilemediği sorusunu ele alıyoruz. Bunu başarmak için, CN-Aα genini ve CHOP genini, primer nöron hücre kültüründeki her biri için iki spesifik shRNA dizisi (Tablo 1) ile 1 gün10 boyunca susturuyoruz. İfade Batı lekelemesi ile analiz edilir (Şekil 1 ve Şekil 2). Nakavt hücrelerinde ER...

Bu çalışmada, ekspresyon, spesifik shRNA'lar kullanılarak PERK yolunun iki aşağı akış sinyal bileşeninin, sitoprotektif kalsinörin ve pro-apoptotik CHOP'un ifadesi yıkılmıştır. Zıt yönlerde, bunlar endoplazmik retikulum stresinin indüksiyonundan sonra primer kortikal nöronların nörit atrofisine duyarlılığını modüle eder.

Endoplazmik Retikulum Stresli Nöronlarda Lentivirüs Kaynaklı Spesifik ShRNA'lar Tarafından Moleküler Modülasyon

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

Bu yaklaşım, aşağı akış çifti bileşenlerinin moleküler ekspresyonunu manipüle ederek endoplazmik retikulum stresinin hücre sistemi modellerinde kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nöral yolların görselleştirilmesi ve ölçülmesiyle eşleştirilmiş sinyallemenin etkisini ortadan kaldırmaktır. Bu yöntem, GM2 gangliosidozun yanı sıra çeşitli nörodejeneratif hastalık modellerinde ER stresinin akut ve kronik fazları arasındaki geçişin moleküler temelini anlamaya katkıda bulunabilir Başlamak için, dokuyu 20X büyüteç altında iki ince uçlu beş numaralı forseps ile diseke edin ve frontal korteksi meninkslerden ayırın.Frontal korteksi 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve kimyasal sindirim için dokuyu 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca üç ila dört mililitre tripsin EDTA ile inkübe edin. Bundan sonra, kalsiyum magnezyum iyonsuz Hank'in dengeli tuz çözeltisi ve% 0.1 glikoz ile üç kez yıkayın. DMEM'de 1.000 mikrolitrelik bir uç artı %10 FCS kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek, dokuyu 10 kez mekanik olarak ayrıştırın.Homojenatı bir dakika boyunca 100 G'de santrifüj edin, süpernatanı toplayın ve kalan hacmi 1.000 mikrolitrede tamamlayın. Hücre kültürü tabaklarındaki hücre süspansiyonunu,% 10 FCS,% 1 penisilin streptomisin ve% 1 esansiyel amino asit katkı maddesi içeren iki mililitre DMEM ile milimetre kare başına 520 hücre yoğunluğunda plakalayın. İki saat boyunca% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir ortamda 37 santigrat derecede inkübe edin.Nöral hücre farklılaşmasına izin vermek için, serumsuz bir nörobazal ortamın ortamını serumsuz takviye ile değiştirin. Kültürleri tedaviye kadar% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun. Tavlama için, iki tek sarmallı oligonükleotidi eşit molar miktarlarda tamamlayıcı dizilerle karıştırın.İki dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Numuneleri ısı bloğundan aktarın ve elde edilen ürünü 0.5 mikromolarlık bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. ShRNA ekini lentiviral vektör pLKO'ya klonlamak için.3G, vektörün bir mikrogramını EcoR1 ve PAC1 kısıtlama enzimleri ile sindirir. Pipetleyerek hafifçe karıştırın ve reaksiyonu 37 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca inkübe edin. Ligasyon için, sindirilmiş vektörü karıştırın ve 3: 1'lik bir molar oranında yerleştirin.T4 ligaz ve ligaz tamponu ile gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, bileşen E.coli'yi toplam ligasyon reaksiyonu hacmiyle karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. İki dakika boyunca 42 santigrat derecelik bir banyoya koyun ve ardından 15 dakika boyunca tekrar buz üzerinde soğutun.Isı şokuna maruz kalan toplam hacmi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hacmi Luria-Bertani veya L-B sıvı ortamı ile 1.000 mikrolitreye tamamlayın. Bakterileri yaklaşık 330 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 dakika boyunca 37 santigrat derece çalkalayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 5.000 G ile buluşan santrifüj.Süpernatantın 900 mikrolitresini atın ve peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın. Bakteri süspansiyonunu katı bir ampisilin L-B plakası üzerine eşit olarak yayın ve gece boyunca 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın. 10 mililitre L-B sıvı ortamı ve ampisilin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için tek bir koloni seçin.Bakterileri yaklaşık 330 RPM'de 37 santigrat derecede çalkalayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca bakterileri 5.000 G'de peletlemek için kültürü santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, bakteriyel peleti eksi 20 santigrat derecede koruyun. Transfeksiyondan 24 saat önce, 1 ila 5 milyon HEK-293 hücresini 100 milimetrelik kültür tabaklarına tohumlayın.14 mikrogram pKLO karıştırın. Belirli bir kesici uçlu 3G vektörü, 10.5 mikrogram ambalaj plazmidi psPAX ve 3.5 mikrogram zarf plazmidi pMD2. G.45 mikrolitre plazmid transfeksiyon reaktifini 700 mikrolitre azaltılmış serum ortamında seyreltin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Daha sonra DNA karışımını seyreltilmiş plazmid transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan sonra HEK-293 hücrelerinin kültür kabının ortamını taze bir ortamla değiştirin ve DNA çözeltisinin tüm hacmini damla damla ekleyin. Çanağı nazikçe sallayın ve shRNA'ların optimum transdüksiyonlarına ulaşmalarını sağlamak için hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin.Ortamı lentivirüs ile toplayın ve dört santigrat derecede saklayın. Viral süpernatantı 0.45 mikrometrelik naylon membran ve içinden geçen akışın bir milimetresi ile filokat yapın. Dört saat boyunca 17.000 G'de santrifüj.Süpernatantı atın ve peleti koruyun. Görünmez peletin kurumasına izin verin ve kuruduktan sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. Birincil kortikal nöron kültürlerini spesifik shRNA oligonükleotidleri ile enfekte edin, kalsinörin A-alfa veya CHOP'un üç asal UTR'lerini hedef alın ve bunları bir gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Bundan sonra, kültür kabının ortamına GM2 stok çözeltisini iki mikromolar'lık son bir konsantrasyonda ekleyin ve 16, 24 ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. PBS'de% 4 paraformaldehit ve 120 milimolar sakkaroz ile hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın. Beş dakika boyunca geçirgenlik çözeltisi ekleyin ve PBS ile yıkayın.Engellemeye izin vermek için PBS'de seyreltilmiş %5 BSA değerini 45 dakika boyunca kullanın. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede anti-MAP2 antikoru ile inkübe edin. Hücreleri kuluçka süresinin sonunda PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, bir saat boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edin.Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra gözlükleri takın. Epifloresan ters mikroskopla görüntüleri elde ettikten sonra, ImageJ'yi elde etmek için resmi yükleyin ve İşlem'e ve ardından Arka Planı Çıkar'a tıklayarak arka planı çıkarın. Minimum değerleri ayarlamak, yolun ve bazı izlemelerin ayırt edilebilir olmasına izin vermek için Resim, Ayarla, Eşik'e tıklayın.Serbest el seçimini kullanarak somaları silin. İzler'i seçin ve Düzenle, Seçim, Seçim Oluştur'a tıklayın. Seçimin kontrol ve T tuşlarına tıklayarak yatırım getirisini elde edin ve koruyun.Orijinal görüntüyü açın. YG Yöneticisi paneline tıklayın ve başlangıç YG'sini seçin. Ardından orijinal resme tıklayın.ROI görüntü üzerinde izlendikten sonra, istatistiksel analizi işlemek için control ve M tuşlarına basın. Burada, 2pERK aşağı akış bileşenlerinin susturulmasının, ER stres hücresi modelinde katlanmamış protein yanıtının geçiş aşamasını etkileyip etkilemediğini kontrol etmek için bir girişimde bulunulmuştur. Kalsinörin A-alfa geni ve CHOP geni, bir gün boyunca birincil nöron hücre kültüründe iki spesifik shRNA dizisi tarafından susturuldu.İfade Batı lekeleme ile analiz edilir. Nakavt hücrelerinde ER stres aracılı kalsinörin A-alfa ve CHOP seviye artışının açık bir inhibisyonu gözlenmiştir. GM2 birikimine bağlı ER stresinin nöronal dejenerasyon ile olası bağlantısı, primer nöronal kültürlerin MAP2 immün boyaması yapılarak incelendi.Nörit atrofisi, GM2'nin 16 ila 48 saatte inkübasyonu ile ER stresini indükledikten sonra önemli ölçüde artar. Kalsinörin A-alfa ekspresyonunun susturulması, özellikle GM2 tedavi edilmeyen gruplara göre 16 saatlik GM2 birikiminde nörit atrofisini önemli ölçüde arttırır. Böylece, kalsinörin A-alfa knockdown, nöronlardaki dejenerasyon sürecini hızlandırdı ve ortaya çıkan protein yanıtının erken evresinde kalsinörinin hayatta kalma yanlısı etkisini doğruladı.Tersine, CHOP knockdown, tam olarak 16 ila 24 saat arasındaki kontrollere göre nörit atrofisinin önemli ölçüde azalmasına neden oldu. uygun birincil hücre kültürü ile hücre protokolü ve ilgili lentivirüs ile enfekte hücrelerin 90 veya daha yüksek yüzdesinin elde edilmesi. Nöral terminal akson kaybı, sürecimizde ortaya koyduğumuz ilk adım olduğundan, bunu tahlil yaparak değerlendirmek de mümkündür.Bu teknik, grubumuzun ve diğerlerinin bazı molekülleri potansiyel terapötik araçlar olarak değerlendirmelerini sağlar.

molecular-modulation-lentivirus-delivered-specific-shrnas-endoplasmic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization...

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Kaynak: Tagliafierro, L., et al. Epigenom Düzenleme Araçlarının İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Hastalık Modellerine Verimli Bir Şekilde Sunulması için Lentiviral Vektör Platformu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Parkinson hastalığında önemli bir protein olan alfa-sinükleinin hedeflenen epigenetik modifikasyonu için nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) lentiviral transdüksiyonunu göstermektedir. Protokol, metiltransferaz aracılı DNA metilasyonunu mümkün kılarak, gen regülasyonunu ve...

Alfa-sinüklein ekspresyonunun epigenetik regülasyonu için nöral progenitör hücrelerin lentiviral transdüksiyonu

Kaynak: Bender, H. R., et.al. Terapötik siRNA'nın katyonik ve anyonik lipozomlar kullanılarak CNS'ye verilmesi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, prion proteini (PrP) siRNA'nın lipozomal siRNA-peptit kompleksleri (LSPC'ler) kullanılarak nöronlara hedefli dağıtımını göstermektedir. Katyonik lipozomlar, kan-beyin bariyeri boyunca reseptör aracılı taşıma için RVG-9r peptidi tarafından daha da stabilize edilen PrP hedefleme siRNA'yı elektrostatik olarak bağlar. Beynin içine girdikten sonra, LSPC'ler...

Lipozomal Kompleksler Kullanılarak Prion Protein Susturması için Nöronlara Hedeflenen siRNA Dağıtımı

MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet...

Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi

Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.

Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Bu iletişim kuralı, yapay mikroRNA aracılı RNA müdahale optogenetics özellikle presynaptic boutons selektif gene(s) sağlam nöronal devreler içinde azaltılmış ifade ile uyarmak için birleştirmek bir iş akışı sağlar.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Poliglutamin spinoserebellar ataksiler, CAG genişlemelerinin agregasyona yatkın proteinler üretmesiyle oluşur. Bu protokol, vektör üretimi, stereotaksik teslimat ve inklüzyonlar ile nöronal belirteç kaybının analizini tanımlar; böylece nörodejeneratif hastalıklar için mekanizmaları araştırmak ve hedefe yönelik tedavileri değerlendirmek için kontrollü bir platform sağlar.

Poliglutamin spinoserebellar ataksiyaların preklinik modeli olarak lentiviral indüksiyonlu striatal patoloji

Keşfedin, endoplazmik retikulum stresli kortikal nöronlarda lentivirüs kaynaklı shRNA ile kalsineurin ve CHOP gen susturmasını. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklardaki koruyucu ve apoptotik yolları anlamaya yardımcı olur.

Endoplazmik Retikulum Stresli Nöronlarda Lentivirüs Kaynaklı Spesifik ShRNA'lar Tarafından Moleküler Modülasyon

Daha fazla video keşfet