Farelerde Cofilin Hedef Alan Adeno İlişkili Bir Virüs Kullanılarak Manipüle Edilen Serebral Korteks Alanlarının Elektrokortikografik Kaydı
February 21st, 2021
Bu makalede, adeno ilişkili virüsler kullanılarak serebral korteksteki moleküler hedeflerin manipülasyonu ve elektrokortikografik kayıtlar kullanılarak uyanıklık ve uyku sırasında bu manipülasyonun etkilerinin izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
Bu protokol, farklı Vigilin durumları sırasında elektrokortikografik aktivitenin düzenlenmesinde belirli bireysel moleküler hedeflerin rolünü tanımlamak için kullanılabilir. Adeno ilişkili virüs kullanmanın yararları arasında, belirli bir beyin bölgesini ve belirli bir hücre tipini tam olarak hedefleme yeteneği vardır. Protokolü gösteren julien Dufort-Gervais olacak, ekibimden bir araştırma görevlisi.
Uyuşturulmış 12 haftalık bir farede parmak sıkışma refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, kulakların arkasından kafanın önüne kadar olan saçları göz aralarında tıraş etmek için bir saç düzeltici kullanın. Dehidrasyonu önlemek için her göze cömert bir oftalmik merhem damlası ekleyin ve farenin başını stereotaksik bir aparat üzerine dikkatlice sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın. Boğulmayı önlemek için dili yavaşça ağızdan çekin.
Farenin burnunu cihaza sabitleyin ve kafadaki açıkta kalan cildi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Cildi ekstra ince Graefe tokaları ile tutarak, cildi kulakların tabanından göz hizasına kadar kesmek için doku makası kullanın ve cildi germek ve kafatasını ortaya çıkarmak için kesiğin her iki tarafına iki cerrahi kelepçe yerleştirin. Beyin dikişlerinden kaçınarak, periosteumu çıkarmak ve iki veya daha fazla yönde üst üste çizgiler oluşturmak için kafatası yüzeyini çizmek için bir makas ucu kullanın.
Kemik parçalarını çıkarmak ve kafatasını dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Stereotaksik kola sabitlenmiş daha önce hazırlanmış bir cannula ile bregma ve lambda'nın yerini belirleyin ve her birinin stereotaksik koordinatlarını not edin. Kafatasındaki kanamanın orta çizgiye doğru 1,5 milimetre yanal ve bregma için ön 1,5 milimetrelik konumunu işaretlemek için stereotaksik kolu ve kalemi kullanın.
0,7 milimetrelik bir matkap ucu kullanarak, kafatası yüzeyine dik ve dikey eksenle hizalanmış işaretli konumdaki kafatasını dikkatlice delin ve kafatasını% 10 betadin povidone iyot çözeltisine batırılmış steril bir pamuk ucuyla yıkayın, ardından kanülü tek bir mikrolitre hava kabarcığı ile yüklemek için 10 mikrolitrelik bir şırınganın pistonunu bir mikrolitre geri çekin. Daha sonra, ilgi çekici AAV karışımını yavaş pipetleme ile karıştırın ve karışımın 1,7 mikrolitresini steril bir Petri kabına ekleyin. Çözeltinin 1,5 mikrolitresini kanolaya yüklemek ve hava kabarcığı konumunu bağlı PE50 tüpüne işaretlemek için bu şırıngayı kullanın.
Canülleri kafatasındaki delik ile dikey olarak hizalayın, böylece canül kemiğin üst kenarına ulaşır ve kafatası yüzeyinin Z koordinatını işaretler. Uç kafatası yüzeyinin 1,5 milimetre altına ve motor korteksinin beş katına ulaşana kadar kanülleri yavaşça küçümseyin ve şırınga pompasını dakikada 0,025 mikrolitreden başlatarak 40 dakikadan fazla bir AAV mikrolitresi sunun. Enjeksiyonu izlemek için tüpteki hava kabarcığı kullanın, gerektiğinde herhangi bir ayarlama yapın.
Tüm virüs hacmi teslim edildiğinde, yeterli bir difüzyon sağlamak ve kanülleri korteksten çıkarmak için stereotaksik kolu yavaşça ve dikkatlice kaldırmadan önce geri akışı önlemek için kanülü beş dakika boyunca yerinde bırakın. Elektrot implantasyonu için, düz bir altın tel ile bir elektrokortikografik elektrodu yavaşça AAV'nin enjekte edildiği deliğin dikey eksenine vidalamak için düz Kelly forseps kullanın, dura ve serebral korteksteki hasarı en aza indirmek için kafatasının dışında en az 2,5 milimetre vida bırakın. Referans elektrodun orta hatta 2,6 milimetre yanal sağ ve bregma için 0,7 milimetre posterior konumunu ve arka elektrokardiyografik elektrodun orta hatta 1,5 milimetre yanal sağ ve lambda'ya 1,5 milimetre ön ve sol yarımküredeki üç bakım vidasının konumunu belirli koordinatları olmadan işaretlemek için bir kalem kullanın, ama birbirlerinden ve elektrokortikografik elektrotlardan mümkün olduğunca uzak.
Diğer elektrotların ve vidaların işaretli konumlarında kafatası yüzeyine dik kafatasını dikkatlice delmek ve delinmiş kafatasını% 10 povidon iyot çözeltisi ile yıkamak için matkabı kullanın. Kanamayı ve kirlenmeyi önlemek için vidaları takmadan önce küçük yuvarlanmış hassas görev silme parçalarıyla delikleri tıkayın ve vidaları deliklerin delindiği açıyla matkap deliklerine yerleştirmek için düz Kelly önlükleri kullanın. Vidaların içindeki halka benzeri alanın ortasına birkaç küçük damla diş çimentosu yerleştirin ve cildi boyun kaslarının üzerine kaldırmak için ekstra ince Graefe tokmakları kullanın.
Dumont'un beş numaralı asaletini kullanarak, bir elektromiyografik elektrotunun kavisli ekstremitesini tutun ve kaslara yaklaşık bir ila iki milimetre yerleştirin. Elektrodun kavisli tarafını ve katlama noktasını diş çimentosuna yerleştirin ve ikinci elektromiyografik elektrodu aynı şekilde yerleştirin. Hayvanın gözlerini kapattıktan sonra, çimentoyu katılaştırmak için üç ila beş dakika ışık uygulayın ve elektrokortikografik elektrotların tabanını ve çapa vidalarını taç şeklinde bir kontur oluşturmak için örtmek için ek diş çimentosu kullanın.
Üç ila beş dakika daha ışık uyguladıktan sonra, montajın merkezini akrilik çimento ile doldurun ve cerrahi kelepçeleri çıkarın. Montajın önündeki ve arkadaki cildi kapatmak için sentetik emilebilir bir monofilament dikiş kullanın, böylece kafatası açıkta kalmaz ve elektrotların altın tellerini konektör pimleriyle dikkatlice hizalamak için konektörü montajın üzerinde tutmak için kavisli önlükler kullanın, ardından her elektrot ekstremitesini tek bir ilgili konektör pimine hızla lehimlayın. Fareyi çerçeveden çıkardıktan sonra, konektör ve kafa arasındaki boş boşluğu akrilik çimento ile örtün.
Tartımdan sonra, fareyi bir ısı yastığının üzerine mesh edilmemiş bir kapakla temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan iki hafta sonra, fareleri kayıt kablolarına bağlayın ve en az bir hafta sonra, elektrokortikografik ve elektromiyografik sinyalleri 24 saat veya daha fazla kaydedin. Başarılı bir enfeksiyon, enjeksiyon bölgesini çevreleyen motor korteks içindeki nöronların HA lekesi ile doğrulanır ve cofilin S3D HA'nın varlığını gösterir. Uyarıcı nöron işaretçisi CaMKII alfa ile birlikte lekelenme, yüksek büyütme altında net cofilin S3D HA ve CaMKII alfa birlikte ifadesini gösterir.
Uyanıklık, yavaş dalga uykusu ve paradoksal uyku için kütüğe dönüştürülmüş göreceli güç spektrumu, cofilin inaktivasyonu altındaki spektral aktivitede duruma özgü farklılıklar göstermektedir. Elektrokortikografik kayıt ve hassas moleküler hedeflerin AAV aracılı manipülasyonunun kombinasyonu, birden fazla beyin bölgesi ve uykuya ek olarak epilepsi veya hafıza üzerine araştırma gibi diğer sinirbilim alt alanları için de geçerlidir.
Genel Bakış
Bu makale, uyanıklık ve uyku sırasında elektrokortikografik aktiviteyi izleyerek, adeno-ilişkili virüsler aracılığıyla serebral korteks içinde moleküler hedeflerin manipülasyonu için bir protokol taslağını sunar. Bu yöntem, beynin belirli bölgelerinin ve hücre tiplerinin elektrokortikografik düzenlemedeki rollerini araştırmak için kesin hedeflemeyi sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Adeno-ilişkili virüsler, hedeflenmiş gen manipülasyonu için kullanılır.
- Elektrokortikografi, farklı durumlarda beyin aktivitesi hakkında bilgi sağlar.
- Moleküler hedef rollerinin anlaşılması nörobilimlere katkıda bulunabilir.
- Araştırma hem uyku hem de uyanıklık durumlarında gerçekleştirilir.
Çalışmanın Amacı
- Elektrokortikografik aktivitenin düzenlenmesinde moleküler hedeflerin rolünü değerlendirmek.
- Hedef manipülasyon ve izleme için tekrarlanabilir bir protokol geliştirmek.
- Farklı davranışsal durumlarda nöronal işlev hakkında olası içgörüler keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yaklaşım, fare serebral korteksine adeno-ilişkili virüs enjeksiyonu kullanır.
- In vivo deneyler için biyolojik model olarak 12 haftalık fareler kullanılır.
- Aktiviteyi izlemek için elektrokortikografik kayıtlar alınır.
- Protokol, ameliyat öncesi hazırlıklar, şırınga yerleştirme teknikleri ve elektrot implantasyon adımlarını içerir.
- Elektrokortikografik ve elektromiyografik sinyalleri toplamak için ameliyat sonrası izleme yapılır.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, korteks içinde moleküler yolakların hedeflenmiş manipülasyonunu sağlar.
- Elektrokortikografik aktivite kaydedilir ve uyku ve uyanıklık durumları ile ilgili içgörüler sağlar.
- Kritik cerrahi ve izleme adımları veri toplamada hassasiyeti artırır.
- Bulgular, moleküler değişikliklere yanıt olarak nöronal dinamiklerin daha iyi anlaşılmasına işaret eder.
Sonuçlar
- Bu çalışma, canlı beyinde moleküler fonksiyonları değerlendirmek için değerli bir protokol sağlar.
- Yaklaşım, uyku ve uyanıklık altındaki mekanizmaları açıklamada önemli ölçüde yardımcı olur.
- Uygulamalar, nörobilimdeki daha geniş uygulamalara ve beyin işlevinin anlaşılmasına uzanır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise molecular interrogation of cortical circuits to assess their impact on electrophysiological readouts relevant to sleep-wake regulation. By linking AAV-mediated target manipulation with ECoG monitoring, it supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience discovery. The approach provides a scalable framework for evaluating protein function in vivo, informing early-stage target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of specific molecular targets like cofilin to assess their role in regulating cortical electrocorticographic activity during wakefulness and sleep states.
- Operational Value: Uses AAV for precise spatial and temporal control of protein expression in defined brain regions, reducing off-target effects and increasing target specificity.
- Predictive Value: Facilitates assessment of how molecular perturbations influence network-level electrophysiological outputs, supporting hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable ECoG readouts (e.g., log-transformed relative power spectra) that enable objective comparison of vigilance states under molecular perturbation.
- Operational Value: Establishes a reproducible surgical and recording workflow suitable for longitudinal monitoring and cross-group comparisons.
- Assay Readiness: Combines viral delivery with electrophysiological readout to create a dual-output assay for target engagement and functional consequence.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Links molecular manipulation in motor cortex to changes in sleep-wake ECoG signatures, providing a disease-relevant system for studying neuropsychiatric and neurodegenerative conditions.
- Preclinical Continuity: Supports progression from molecular target validation to functional circuit assessment in intact behaving animals.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether a target of interest modulates synchronized cortical activity, reducing ambiguity in downstream target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through functional validation, enabling mechanistic insight before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing selective inactivation of cofilin to determine its necessity in cortical EEG dynamics across behavioral states.
- Screening: Produces standardized, quantifiable ECoG metrics that allow comparison of sleep architecture and spectral power between control and experimental groups.
- Analytics: Enables spectral analysis and state-dependent power comparisons, providing quantitative outputs for assessing target modulation effects.
- Translational Research: Connects molecular changes in cortex to altered sleep-wake physiology, relevant for modeling cognitive deficits associated with sleep loss.
- Enterprise Reuse: The surgical and viral delivery framework can be adapted to other cortical targets, brain regions, or disease models beyond sleep research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into how cytoskeletal regulators like cofilin influence neuronal network synchrony during wakefulness and sleep.
- Operational Value: Combines stereotaxic AAV delivery with chronic electrode implantation for long-term, reproducible in vivo monitoring.
- Strategic Value: Reduces biological uncertainty in target selection by linking molecular function to electrophysiological phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on target effects on network-level brain activity, improving risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery, viral handling, and electrophysiological recording in rodents.
- Depends on sterile surgical tools, stereotaxic apparatus, microsyringes, and EEG/EMG acquisition systems.
- Necessitates post-operative recovery time (3 weeks) for viral expression and tissue healing before data collection.
- Requires histological validation (e.g., HA and CaMKII staining) to confirm target expression and cell-type specificity.
- Limited to cortical surfaces accessible via skull puncture; deep brain targets may require alternative approaches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Intracortical Adeno-Associated Virus (AAV) Injection
4:04
Electrocorticographic (ECoG) and Electromyographic (EMG) Electrode Implantation and Recording
7:28
Results: Representative AAV Cofilin Targeting within the Mouse Cerebral Cortex
8:08
Conclusion
