Farelerde Cofilin Hedef Alan Adeno İlişkili Bir Virüs Kullanılarak Manipüle Edilen Serebral Korteks Alanlarının Elektrokortikografik Kaydı

Bu protokol, farklı Vigilin durumları sırasında elektrokortikografik aktivitenin düzenlenmesinde belirli bireysel moleküler hedeflerin rolünü tanımlamak için kullanılabilir. Adeno ilişkili virüs kullanmanın yararları arasında, belirli bir beyin bölgesini ve belirli bir hücre tipini tam olarak hedefleme yeteneği vardır. Protokolü gösteren julien Dufort-Gervais olacak, ekibimden bir araştırma görevlisi.

Uyuşturulmış 12 haftalık bir farede parmak sıkışma refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, kulakların arkasından kafanın önüne kadar olan saçları göz aralarında tıraş etmek için bir saç düzeltici kullanın. Dehidrasyonu önlemek için her göze cömert bir oftalmik merhem damlası ekleyin ve farenin başını stereotaksik bir aparat üzerine dikkatlice sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın. Boğulmayı önlemek için dili yavaşça ağızdan çekin.

Farenin burnunu cihaza sabitleyin ve kafadaki açıkta kalan cildi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Cildi ekstra ince Graefe tokaları ile tutarak, cildi kulakların tabanından göz hizasına kadar kesmek için doku makası kullanın ve cildi germek ve kafatasını ortaya çıkarmak için kesiğin her iki tarafına iki cerrahi kelepçe yerleştirin. Beyin dikişlerinden kaçınarak, periosteumu çıkarmak ve iki veya daha fazla yönde üst üste çizgiler oluşturmak için kafatası yüzeyini çizmek için bir makas ucu kullanın.

Kemik parçalarını çıkarmak ve kafatasını dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Stereotaksik kola sabitlenmiş daha önce hazırlanmış bir cannula ile bregma ve lambda'nın yerini belirleyin ve her birinin stereotaksik koordinatlarını not edin. Kafatasındaki kanamanın orta çizgiye doğru 1,5 milimetre yanal ve bregma için ön 1,5 milimetrelik konumunu işaretlemek için stereotaksik kolu ve kalemi kullanın.

0,7 milimetrelik bir matkap ucu kullanarak, kafatası yüzeyine dik ve dikey eksenle hizalanmış işaretli konumdaki kafatasını dikkatlice delin ve kafatasını% 10 betadin povidone iyot çözeltisine batırılmış steril bir pamuk ucuyla yıkayın, ardından kanülü tek bir mikrolitre hava kabarcığı ile yüklemek için 10 mikrolitrelik bir şırınganın pistonunu bir mikrolitre geri çekin. Daha sonra, ilgi çekici AAV karışımını yavaş pipetleme ile karıştırın ve karışımın 1,7 mikrolitresini steril bir Petri kabına ekleyin. Çözeltinin 1,5 mikrolitresini kanolaya yüklemek ve hava kabarcığı konumunu bağlı PE50 tüpüne işaretlemek için bu şırıngayı kullanın.

Canülleri kafatasındaki delik ile dikey olarak hizalayın, böylece canül kemiğin üst kenarına ulaşır ve kafatası yüzeyinin Z koordinatını işaretler. Uç kafatası yüzeyinin 1,5 milimetre altına ve motor korteksinin beş katına ulaşana kadar kanülleri yavaşça küçümseyin ve şırınga pompasını dakikada 0,025 mikrolitreden başlatarak 40 dakikadan fazla bir AAV mikrolitresi sunun. Enjeksiyonu izlemek için tüpteki hava kabarcığı kullanın, gerektiğinde herhangi bir ayarlama yapın.

Tüm virüs hacmi teslim edildiğinde, yeterli bir difüzyon sağlamak ve kanülleri korteksten çıkarmak için stereotaksik kolu yavaşça ve dikkatlice kaldırmadan önce geri akışı önlemek için kanülü beş dakika boyunca yerinde bırakın. Elektrot implantasyonu için, düz bir altın tel ile bir elektrokortikografik elektrodu yavaşça AAV'nin enjekte edildiği deliğin dikey eksenine vidalamak için düz Kelly forseps kullanın, dura ve serebral korteksteki hasarı en aza indirmek için kafatasının dışında en az 2,5 milimetre vida bırakın. Referans elektrodun orta hatta 2,6 milimetre yanal sağ ve bregma için 0,7 milimetre posterior konumunu ve arka elektrokardiyografik elektrodun orta hatta 1,5 milimetre yanal sağ ve lambda'ya 1,5 milimetre ön ve sol yarımküredeki üç bakım vidasının konumunu belirli koordinatları olmadan işaretlemek için bir kalem kullanın, ama birbirlerinden ve elektrokortikografik elektrotlardan mümkün olduğunca uzak.

Diğer elektrotların ve vidaların işaretli konumlarında kafatası yüzeyine dik kafatasını dikkatlice delmek ve delinmiş kafatasını% 10 povidon iyot çözeltisi ile yıkamak için matkabı kullanın. Kanamayı ve kirlenmeyi önlemek için vidaları takmadan önce küçük yuvarlanmış hassas görev silme parçalarıyla delikleri tıkayın ve vidaları deliklerin delindiği açıyla matkap deliklerine yerleştirmek için düz Kelly önlükleri kullanın. Vidaların içindeki halka benzeri alanın ortasına birkaç küçük damla diş çimentosu yerleştirin ve cildi boyun kaslarının üzerine kaldırmak için ekstra ince Graefe tokmakları kullanın.

Dumont'un beş numaralı asaletini kullanarak, bir elektromiyografik elektrotunun kavisli ekstremitesini tutun ve kaslara yaklaşık bir ila iki milimetre yerleştirin. Elektrodun kavisli tarafını ve katlama noktasını diş çimentosuna yerleştirin ve ikinci elektromiyografik elektrodu aynı şekilde yerleştirin. Hayvanın gözlerini kapattıktan sonra, çimentoyu katılaştırmak için üç ila beş dakika ışık uygulayın ve elektrokortikografik elektrotların tabanını ve çapa vidalarını taç şeklinde bir kontur oluşturmak için örtmek için ek diş çimentosu kullanın.

Üç ila beş dakika daha ışık uyguladıktan sonra, montajın merkezini akrilik çimento ile doldurun ve cerrahi kelepçeleri çıkarın. Montajın önündeki ve arkadaki cildi kapatmak için sentetik emilebilir bir monofilament dikiş kullanın, böylece kafatası açıkta kalmaz ve elektrotların altın tellerini konektör pimleriyle dikkatlice hizalamak için konektörü montajın üzerinde tutmak için kavisli önlükler kullanın, ardından her elektrot ekstremitesini tek bir ilgili konektör pimine hızla lehimlayın. Fareyi çerçeveden çıkardıktan sonra, konektör ve kafa arasındaki boş boşluğu akrilik çimento ile örtün.

Tartımdan sonra, fareyi bir ısı yastığının üzerine mesh edilmemiş bir kapakla temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan iki hafta sonra, fareleri kayıt kablolarına bağlayın ve en az bir hafta sonra, elektrokortikografik ve elektromiyografik sinyalleri 24 saat veya daha fazla kaydedin. Başarılı bir enfeksiyon, enjeksiyon bölgesini çevreleyen motor korteks içindeki nöronların HA lekesi ile doğrulanır ve cofilin S3D HA'nın varlığını gösterir. Uyarıcı nöron işaretçisi CaMKII alfa ile birlikte lekelenme, yüksek büyütme altında net cofilin S3D HA ve CaMKII alfa birlikte ifadesini gösterir.

Uyanıklık, yavaş dalga uykusu ve paradoksal uyku için kütüğe dönüştürülmüş göreceli güç spektrumu, cofilin inaktivasyonu altındaki spektral aktivitede duruma özgü farklılıklar göstermektedir. Elektrokortikografik kayıt ve hassas moleküler hedeflerin AAV aracılı manipülasyonunun kombinasyonu, birden fazla beyin bölgesi ve uykuya ek olarak epilepsi veya hafıza üzerine araştırma gibi diğer sinirbilim alt alanları için de geçerlidir.