Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farelerde nöronların uzun süreli kayıtları ve rekonstrüksiyonu için hipokampüsün dorsal ara bölgesinden sağlıklı akut dilimler hazırlamaktır. Bizimki gibi birçok laboratuvar, özel öğrenme ve navigasyondaki rolü için dorsal hipokampusu inceliyor. Bu amaçla kullanılan yaygın teknikler davranış deneyleri, anatomik izleme ve bölgesel spesifik manipülasyonlardır.

Elektrofizyolojiyi bu tekniklerle birleştirerek video kayıtlarında invivodatanın doğrudan korelasyonunu sağlamak için bir beyin dilimleme yöntemi geliştirdik. Bu protokolün avantajı, transversal dilimleri elde etmek için basit bir prosedürü, beyin dokusunun canlılığını artırmak için koruma çözeltisi kullanımı ile birleştirmesidir. Bu yaklaşım özellikle davranış deneylerinde olduğu gibi olgun hayvanlar kullanıldığında uygundur.

Bu prosedüre başlamak için lavabonun yanında bu bölüm için gerekli ekipmanı hazırlayın. Her biri 10 santimetre çapında 150 mililitrelik bir beher ve iki cam Petri kabı hazırlayın. Plastik bir Petri kabının dibine kadar çizgilerin üç kısmını çizin ve bu kabı buz tepsisine yakın konumlandırın.

Vibratom için tutkal ve numune tutucuya da ihtiyacınız olacaktır. Ardından ameliyat bankını büyük makas, küçük makas, yuvarlak uçlu cımbız, ince uçlu cımbız, ince metal spatula, büyük metal spatula ve transfer pipetleri ile donatın. Petri tabaklarını bir kesme çözeltisi ile soyun.

Bir yemek başın diseksiyonunu, diğeri de beynin diseksiyonunu gerçekleştirmek için. İkincisi, ayrıca bir parça filtre kağıdı yerleştirin. Ayrıca kabı 30 mililitre kesme çözeltisi ile doldurun.

Transkardiyal perfüzyon için buna ihtiyaç duyulacaktır. Vibratom tepsisini buz gibi kesme çözeltisi ile doldurun ve tüm çözeltiyi bir karbojen köpürme cihazı ile oksijenli tutun. Sıcaklığı düşük tutmak için donmuş kesme çözeltisinden yapılan ezilmiş buzu soğuk taze kesme çözeltisine ekleyin.

Dilimlerken buzu bıçaktan uzak tutmaya dikkat edin. Kapiyondan sonraki hemen hemen tüm adımlar çözümler dahilinde gerçekleştirilir. Bu, metabolizma oksijen yoksunluğunu minimumda tutmaya yardımcı olur.

Sabit oksijenasyon altında bir kesme çözeltisi ile dolu bir kuluçka odası hazırlayın. Odayı 35 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. Birkaç bağımsız kuyu ile bir dilim depolama odası hazırlayın ve depolama çözeltisi ile doldurun.

Oda sıcaklığında sürekli oksijenlenme altında tutun. Doku floresan bir proteini veya hafif bir aktif opsonini ifade ediyorsa. Odayı karanlıkta tutmanızı tavsiye eder.

Örneğin, kutunun içinde. Transkardiyal perfüzyon yaptıktan sonra, farenin başını buz gibi kesme çözeltisi ile Petri kabına yerleştirin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi ince bir makasla açın.

Foramen magnumdan başlayarak, sagittal dikiş boyunca nazofrontal dikişe ulaşana kadar kesin. Beynin hasar görmesini önlemek için makası hafifçe yukarı çekmeye dikkat edin. Kafatasının tabanına iki yanal kesi yap.

Parietal kemikleri yukarı çekmek için yuvarlak uçlu cımbız kullanın. Menenjitleri de çıkarmaya dikkat edin. Bırakılırsa ekstraksiyon sırasında beyne zarar verebilirler.

Beyni kafatasının tabanından hafifçe gevşetmek için küçük spatulayı kullanın. Küçük bir spatula ile beyni kraniyal sinirlerden ayırın ve beyni ikinci Petri kabındaki küçük bir filtre kağıdına aktarın. Önceden soğutulmuş bir bıçak kullanarak beyni boyuna yarıklar halinde kesin.

En küçük spatulayı kullanarak iki yarımküreyi ayırın. Bir yarımküreyi, medial yüzeyi aşağı bakacak şekilde plastik Petri kabına aktarmak için en büyük spatulayı kullanın. Parietal korteksi, ikinci kesim için bir referansa sahip olmak için paralel çizgilerden biriyle hizalayın.

Fazla çözeltiyi kurutmak için bir parça filtre kağıdı kullanın. Bıçağı çizgilere paralel olarak yerleştirin ve yarımkürenin ventral kısmını kesin. Bu düz yüzey daha sonra numune tutucusuna yapıştırılacaktır.

Yarımküreyi cam Petri kabının oksijenli pamuk çözeltisine geri döndürün ve ikinci yarımkürede aynı işlemi uygulayın. Vibratom numune tutucusuna bir damla siyanoakrilat tutkal yerleştirin ve ince bir tabaka oluşturmak için bir spatula ile yayın. Spatulanın yuvarlatılmış tarafını kullanarak yarımküreyi ventral tarafı aşağı olacak şekilde vibratom tutucuya aktarın.

Bu dilimlemenin parietal korteksten başlaması hipokampüsün dorsal bölgesini toplamak için gereken süreyi azaltacaktır. Yapıştırıcıyı katılaştırmak için birkaç damla soğuk kesme çözeltisi ekleyin. Numune tutucuyu vibratom tepsisine taşıyın ve uygun ayarlarla beyni dorsal hipokampus bölgesi görünene kadar dilimleyin.

Daha sonra, dilimleri plastik bir transfer pipet kullanarak toplayın. Her dilimi kuluçka odasına aktarın ve 12 dakika dinlendirin. Bu arada, sonraki dilimleri kesmeye devam edin.

12 dakikalık inkübasyondan sonra, dilimleri saklama odasına aktarın. Ve deneyin başlangıcına kadar dinlensin. Hazırlığımızın saflığını göstermek için, dorsal hipokampustan kaydetmek için yaygın olarak kullanılan bir koronal preparatla karşılaştırıyoruz.

Burada gösterilenler, dentat girusunun üst bıçağından iki aylık farelerden akut dilimlerde elde edilen diferansiyel girişim kontrast mikro grafiğidir. Transversal dilimde nöronlar çoğunlukla pürüzsüz yüzeyler ve sadece siyah oklarla gösterilen kontrastlı sınırlar gösterdi. Coronal dilimlerindeki nöronlar ancak sıklıkla rota ortaya çıktı ve beyaz oklarla gösterilen güçlü bir şekilde zıt anahatlar gösterdi.

Bu, transversal dilimdeki nöronların daha iyi yaşayabilirliğini göstermektedir. Bu izlenime uygun olarak, transversal dilimlerimizde yama sırasında oluşumu mühürleme süresi koronal dilimlere göre önemli ölçüde daha hızlıydı. Hücre bütünlüğü için genel bir proxy olarak, granül hücrelerin ve parvalbumin pozitif inter nöronların istirahat membran potansiyellerinin, koronal ve transversal dilimlere karşı her iki hücre tipinde de önemli ölçüde daha fazla depolarize olduğunu kaydederiz.

Sonunda koronal preparatta dışlanmaları gereken önemli ölçüde daha fazla hücre ile sonuçlandı. Granül hücre aksonları transversal düzlemde çalışırken, kaydedilen hücrelerin rekonstrüksiyonu, hazırlığımızda tam aksonal arborizasyonun alınmasına neden oldu. Aksonların kolayca kopmuş olabileceği koronal dilimlerde durum böyle değildi.

Ek olarak, transversal dilimlerdeki parvalbumin pozitif inter nöronların morfolojik rekonstrüksiyonu, dendritik dikenler gibi küçük bir ayrıntının görselleştirilmesi de dahil olmak üzere geniş aksonal ve dendritik arborizasyon tasvirine izin sağladı. Her şeyden önce, yetişkin fareler için yüksek nöronal canlılığa sahip transversal hipokampus dilimleri elde etmek için bir dilimleme yöntemleri sunduk. Bu yöntem hipokampüsün ara dorsal kısmına odaklanan anatomik ve davranışsal çalışmalarla elektrofizyolojik in vitro incelemeyi ölçmek için kullanılabilir.