Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Bir protein yapısını karakterize etmek, işlevini anlamak için gereklidir. Kütle spektrometresi, özellikle geleneksel yöntemlerle incelenmesi zor protein sistemleri için bu amaç için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bir protein yapısını kütle spesifikasyonuna göre incelemek için, bir protein yapısal bilgisini kütlesine kodlayan çözeltide spesifik kimyasal reaksiyonlar gerçekleştirilir.

Özellikle etkili bir yaklaşım, erişilebilir amino asitlerin yan zincirlerinin çözülmesini kovalent olarak değiştiren reaktifler kullanmaktır. Bu reaksiyonlar, proteolitik sindirim ve tandem kütle spektrometresi ile birleştirildiğinde kalıntı seviyesi çözünürlüğü ile lokalize edilebilen kütle artışlarına yol açar. Burada, dietil pirokarbonat veya DEPC kullanımı ile ilgili protokolleri kütle spektrometresi tespiti ile birlikte bir kovalent etiketleme reaktifi olarak tanımladık.

DEPC, ortalama proteindeki kalıntıların% 30'una kadar etiketleme yapabilen ve böylece mükemmel yapısal çözünürlük sağlayan son derece elektrofilik bir moleküldür. DEPC, birçok farklı protein için yapısal bilgi elde etmek için kütle spektrometresi ile birlikte başarıyla kullanılmıştır. Onlarca mikromolar aralığında bir konsantrasyonda ilgi proteininizin tamponlanmış bir çözeltisini hazırlayarak başlayın.

Genellikle 10 milimolar pH 7.4 MOPS tampon kullanıyoruz. Alternatif olarak, orijinal örnek nükleofilik fonksiyonel gruplara sahip bir arabellek içeriyorsa, mevcut bir protein çözeltisi MOPS veya başka bir arabellek içine tampon değişimi olabilir. Tamponun nükleofilik fonksiyonel gruplara sahip olmaması gerekir, çünkü DEPC protein reaksiyonu ile müdahale ederler.

Farklı bir mikrotüpte, kuru asetonitrilde 100 milimolar DEPC stok çözeltisi hazırlayın. Depc hidrolizini önlemek için stok çözeltisinin kuru asetonitrilde hazırlanması gereklidir. Yeni bir mikrotüpte, HPLC sınıfı suda bir azı dişi imidazol çözeltisi hazırlayın.

Yeni bir mikrotüpte, MOPS tampon ve protein çözeltisini karıştırın. Protein ve tampona, reaksiyon karışımını bir dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirmeden önce düzgün bir şekilde karıştırdığından emin olmak için DEPC stok çözeltisinden bir aliquot ekleyin. Kullanılan DEPC stok çözeltisinin hacmi, istenen nihai DEPC protein konsantrasyon oranına göre seçilmelidir.

Her proteinle çalışacak tek bir DEPC ve protein konsantrasyonu kümesi yoktur, ancak optimum DEPC konsantrasyonu proteinde bulunan solvent erişilebilir histidin ve lizin kalıntıları sayısına göre tahmin edilebilir. Eklenen DEPC çözeltisinin hacmi olan asetonitrile hacminin, reaksiyon sırasında protein yapısının pertürbasyonunu önlemek için toplam reaksiyon hacminin% 1'ini geçmemesi gerektiği belirtilmelidir. Reaksiyon süresi sonuçta kullanıcıya kadardır, ancak örnek durum altında bir dakikalık reaksiyon, DEPC'nin protein ve hidrolizinin etiketlenerek en aza indirilmesine rağmen.

Bir dakika geçtikten sonra, tepki verilen DEPC'de kalanları çöpe atmak için imidazol ekleyerek reaksiyonun söndürülür. Son imidazol konsantrasyonunun DEPC konsantrasyonunun 50 katı olduğundan emin olmak. DEPC tarafından değiştirilen kalıntıları tanımlamak için, proteinin proteolitik olarak peptit parçalarına sindirilmesi gerekir.

Sindirim için, ilgi proteinine uygun koşulları seçin. Burada açıklanan yaygın adımlar, proteinin ortaya çıkmasını ve daha sonra sindirim verimliliğinin artırılabilmesi için disülfid bağların azaltılmasını ve alkilleştirilmesini içerir. Deneyimlerimize göre, sindirimden önce proteini bir denatürant ve ısı ile ortaya çıkarmak sindirimin verimliliğini artırır.

Protein açılırken, uygun bir sindirim tamponunda TCEP ve iodoasetamid çözeltilerini karşılaştırın. DTT, DEPC değiştirilmiş kalıntılarla reaksiyona girebildiğinden, dithiothreitol veya DTT yerine azaltıcı madde olarak TCEP kullanılmalıdır. Azaltmadan sonra elde edilen dosyaların alkilasyonu, serbest dosyaların ve proteinin değiştirilmiş amino asitlerle reaksiyona giren etiket karıştırmasını önlemek için gereklidir.

Açma adımı bittikten sonra, reaksiyon karışımına TCEP ekleyerek disülfür bağlarını azaltın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Azaltmadan sonra, reaksiyon karışımına iodoasetamid ekleyin, karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika reaksiyona girmesine izin verin. Burada reaksiyon karışımını bir kutuya yerleştirerek elde edilir.

İodoasetamid'in son konsantrasyonu, TCEP için kullanılan konsantrasyonun iki katı veya protein konsantrasyonunun veya disülfid bağın 80 katı olmalıdır. İlgi enzimini hazırlayın, genellikle tripin veya chymotrypsin üreticinin özelliklerine göre. Tercih ettiği enzimi hazırladıktan sonra sindirime başlayın ve reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Hareketsiz enzimler kullanılarak üç saatlik sindirime sahip 10:1 proteinden enzime oranı, DEPC etiketli proteinler için tipik olarak iyi bir seçimdir. Sindirimden sonra, numunenin bozulmasını ve etiket kaybını en aza indirmek için numune derhal LC-MS/MS tarafından analiz edilmeli veya sıvı nitrojen ile dondurulmalıdır. Aşağıdan yukarıya proteomik için standart LC-MS/MS parametreleri, proteolitik peptit parçalarındaki etiketli bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir.

Peptitlerin en iyi ayrımını elde etmek için ters faz C18 sabit faz kullanılmalıdır. Deneyimlerimize göre, kılcal damar LC, kullanılan numune miktarlarının daha yüksek olması nedeniyle modifikasyon seviyeleri hakkında nano LC'den daha güvenilir nicel bilgiler sağlar. DEPC etiketli peptitleri ayırmak için kullanılan tipik bir LC mobil fazı iki çözücüden oluşur.

Solvent A% 0.1 formik asitli sudur ve çözücü B% 0.1 formik asit içeren bir asetonitrildir. Degrade elution kullanılır ve ayırma süresi örnek karmaşıklığına göre optimize edilebilir. Peptitlerdeki DEPC değişiklik sitelerini tanımlamak için çevrimiçi LC-MS ve MS/ MS yapabilen bir kütle spektrometresi gereklidir.

Deneylerimizde, çeşitli kütle spektrometrelerini başarıyla kullandık. Bir Thermo Orbitrap Fusion'ın mükemmel sonuçlar sağladığını gördük, ancak bir LC-MS analizi sırasında birçok peptidin MS / MS'ini otomatik olarak gerçekleştirebilen herhangi bir kütle spektrometresi uygun olmalıdır. HPLC koşulları ve kütle spektrometrik parametreleri ölçümden önce uygun şekilde ayarlanmalıdır.

Numune flaş dondurulduysa, analizden hemen önce çözülmelidir. Numune hazırlama ve HPLC enjeksiyonu arasındaki süreyi en aza indirmek için elinden geleni yapın. Sindirilen etiketli protein örneğini LC sistemine yükleyip enjekte edin ve LC-MS/MS alımına veya DEPC etiket sitesi tanımlamasına ve tepe alanı nicelleştirmesine başlayın, birden fazla yöntem vardır.

Thermo Fisher aletlerinde, excalibur veya proteome discoverer kullanılmış olabilir. Bir programda peptit tanımlaması için uygun parametreleri ayarlayın. DEPC ilavesi ve karbamidometi iletilmesi, kalıntılara yardımcı olan değişken değişiklikler olarak dahil edilir veya tahsis edilir.

Kalıntı seviyesi değişiklik yüzdelerini belirlemek için peptitlerin modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş versiyonlarının kromatografik tepe alanları kullanılır. MS algılamalı DEPC etiketleme, proteinlerdeki daha yüksek sıralı yapısal değişiklikleri karakterize etmek için de değerli bir araçtır. Çalışmamızdan, DEPC kovalanslı etiketleme, termal ve oksidatif stres üzerine yapısal değişikliklere uğrayan belirli protein bölgelerini tanımlayabilir.

Şekilde, etiketlemedeki azalma için değişiklik yüzdelerindeki önemli değişiklikler mavi, etiketlemedeki artış için kırmızı renkte gösterilirken, önemli etiketleme değişikliği olmayan kalıntılar soluk yeşil renkte gösterilmiştir. Örneğin, beta-2 mikroglobulin ısı stresine maruz kaldıktan sonra, etiketleme kapsamlarında önemli düşüşler yaşayan birçok kalıntı, N-terminus, serine 28, histidin 31, serine 33, serine 55, serine 57 ve lizin 58, proteinin bu bölgesinin doğrulayıcı bir değişikliğe uğradığını veya muhtemelen toplamada aracılık ettiğini düşündüren proteinin bir tarafından daha yakındır. Protein oksidatif strese maruz kaldıktan sonra, oksidasyon kaynaklı onay değişikliğinin başka bir yerde meydana geldiğini gösteren proteinin başka bir aşamasındaki bir kümeden serine 11, histidin 13, lizin 19, lizin 41 ve lizin 94'te azalma ile farklı kalıntılar.

Bu çalışmanın şu anda ilaç pazarının en hızlı büyüyen segmenti olan protein terapötikleri için önemli etkileri vardır. Grubumuzun diğer çalışmaları da DEPC kovalent etiketleme kütlesi spektrometresinin stresli monoklonal antikor terapötiklerindeki onay değişikliklerinin yerlerini tespit edebildiği ve tanımlayabildiği gösterilmiştir. Gördüğünüz gibi, DEPC ile birlikte tanımlayıcı etiketlemenin deneysel olarak uygulanması kolaydır, ancak proteinler için değerli yapısal bilgiler sağlayabilir.

DEPC etiketleme kütle spektrometresi tarafından sağlanan yapısal çözünürlük, x-ışını kristalografisi ve NMR gibi tekniklerle karşılaştırıldığında mütevazıdır, ancak büyüklüğüne veya kristalize olma yeteneğine bakılmaksızın hemen hemen her proteine uygundur. DEPC kovalent etiketleme kütlesi spektrometresi de protein karışımları ile çalışır ve hücre lisat ve haCat hücreleri gibi çok karmaşık örnek türleriyle çalışabilir. Bu videoyu izledikten sonra, DEPC etiketlemesini protein yapısını karakterize etmek için yararlı bir araç bulacağınıza eminiz.