Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Herkese merhaba. Benim adım Nicolas Wein. Columbus, Ohio'daki Nationwide Çocuk Hastanesi'nde baş araştırmacıyım.

Ve bugün size cilt biyopsisi alıp mioblastlara ve miyotube'a dönüştürme hakkında bir video göstereceğiz. Bu nöromüsküler bozukluğu incelemek için çok yararlı bir araçtır. Buna ek olarak, IPSC'ye kıyasla daha hızlı bir teknolojidir, çünkü bu tür bir hücreyle doğrudan mücadele etmek için iki farklı virüs türü kullanıyoruz.

Bu video, insan derisi türetilmiş fibroblast kültürleri oluşturma protokolünü, mioblastlara dönüştürmeyi ve daha sonra farklılaştırılmış miyotubeları göstermektedir. Deri biyopsisi dermal fibroblastları türetmek için hücre kültürüne aktarılır. HTERT ve MYOD genleri taşıyan lentivirüsler bu fibroblastları transdüse etmek için kullanılır.

Doxycycline ile desteklenmiş miyoblast büyüme ortamı ek olarak, MYOD geni ifade edilir ve fibroblastların miyoblastlara dönüştürülmesini teşvik eder. Daha sonra, ortam, Doxycycline ile de desteklenmiş bir farklılaşma ortamına geçilir. Sonra miyeoplastlar birbirleriyle kaynaşır ve çok yönlü miyotüpler oluştururlar.

Medyayı tüpten emiş edin ve biyopsiyi oda sıcaklığında bir x PBS olmak üzere 10 mililitre ile üç kez durulayın. Üçüncü yıkamadan sonra PBS'yi tüpte bırakın. PBS ve cilt biyopsisini 10 santimetre karelik bir kabın üzerine dökün.

Steril neşterler kullanarak biyopsiyi mümkün olduğunca küçük parçalara ayırın. Bir pipet kullanarak, tek bir cilt parçasını steril 10 santimetre kare bir tabağa aktarın. Pbs'in fazlalığını her parçanın etrafından epire edin.

Parçanın kendisini aspire etmemeye dikkat edin. Bulaşıkları kapakla kısmen örtün ve cilt biyopsi parçalarının beş ila 20 dakika kurumasını bekleyin. Parçaların çok uzun süre kurumasına izin vermeyin.

Parçalar kuruduktan sonra, kabı 45 derecelik bir açıyla eğin ve yavaşça yemeğin köşesine 12 mililitre fibroblast ortamı ekleyin. Parçaların medya tarafından kaldırılmaması için medyayı dikkatlice dağıtarak tabağı 2007'de 2007'den bularak aşağı 2007'de 2007'den bu derece 100'e indir. Bulaşıkları inkübatöre yerleştirin.

Medyayı beş ila yedi gün içinde ve bundan sonra haftada bir kez değiştirin. Tohum birincil fibroblastları, ertesi gün konfluensi yaklaşık% 50'ye sahip olmak için, konfluensi% 30'unda ve 12 kuyu plakasının iki kuyusunda, kuyu başına yaklaşık 20.000 hücre. Lentiviral transdüksiyon için, hTERP Puromycin Lentivirus'un iki ila 5 milyar viral genomlarını ve 400 mikrolitre fibroblast ortamını ekleyin.

Lentivirüs karışımını bir kuyuya ekleyin. İkinci kuyuya, sadece 400 mikrolitre fibroblast ortamı ekleyin. Ertesi gün, bir mililitre medya ekleyin.

Bir veya iki gün sonra, hücreleri altı kuyu plakasına aktarın ve% 60 ila% 70 izdiah edene kadar yetiştirin. Fibroblast ortamını mililitre başına bir mikrogram Puromycin ile destekleyin ve her kuyuya iki mililitre ekleyin. Kontrol kuyusundaki tüm hücreler ölene kadar hücreleri en az 12 gün boyunca seçim altında tutun ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirebilirsiniz.

12 kuyu plakasının üç kuyusunda fibroblastları %30'luk birleştiğinde ifade eden tohum H grafiği ertesi gün yaklaşık %50 izdihama sahiptir. Lentiviral transdüksiyon için, MYOD Hygromycin B lentivirüs'ün iki ila beş milyar viral genomını ve 400 mikrolitre fibroblast ortamını karıştırın ve iki kuyuya ekleyin. Ertesi gün bir mililitre orta ekleyin.

Bir veya iki gün sonra hücreleri altı kuyu plakasına aktarın ve% 60 ila% 70 birleştiğinde büyüyün. Hygromycin B mililitresi başına 400 mikrogram ile ek büyüme ortamı.Her kuyuya iki mililitre ekleyin. Kontrol kuyularındaki tüm hücreler ölene kadar hücreleri seçim altında tutun, genellikle en az 12 gün sürer ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirir.

Mioblastların indüksiyonu için, fibroblastları% 70 bir araya gelinceye kadar yetiştirin. Miyoblast büyüme ortamına mililitre başına sekiz mikrogram Doxycycline ekleyin. Her zaman doksiksin ve orta taze aliquots kullanın.

Ortam herhangi bir medya değişmeden hemen önce hazırlanmalıdır. Ayrıca, Doxycycline refrozen olmamalıdır. Fibroblast ortamını aspire edin ve hücreleri PBS ile durulayın.

10 mililitre takviyeli myoblast ortamı ekleyin. İki ila üç gün sonra, hücreler% 90 ila 95 bir aradadır ve morfolojileri değişmiş olacaktır. Myoblast büyüme medyasını aspire edin ve hücre yüzeyini PBS ile durulayın.

Mililitre taze Doxycycline başına sekiz mikrogram ile desteklenmiş 10 mililitrelik farklılaşma ortamı ekleyin. Miyotubelar oluşana kadar her iki ila üç günde bir medyayı değiştirmeye devam edin. Miyotube farklılaşmasından yedi ila 10 gün sonra, hücreler tamamen ayırt edilmelidir, ancak bu bir hücre hattından diğerine değişir.

İlk fibroblastlar, cilt parçaları kültüre geçtikten beş gün sonra ortaya çıkabilir. Resim B'de, fibroblastlar bir arayadır ve daha fazla çoğalma için 75 santimetre kare şişelere aktarılmaya hazırdır. Birincil hücreler çoğalıcı senescence girerken, birkaç fibroblast şişesini düşük geçiş sayılarında dondurmak önemlidir.

Fibroblastların miyotüplere dönüştürülmesi için FM hücre hatları kurulduktan sonra, fibroblastlar resimde gösterildiği gibi% 70'e kadar çoğalmalıdır A.Yüksek yoğunluk farklılaşmayı bozabileceğinden% 80'i geçmemek önemlidir. Doxycycline'ın ortama eklenmesinden sonra, iki ila dört gün içinde hücreler, resimde görüldüğü gibi uzun bir morfoloji ve paralel yönelim ile karakterize miyeoplastlar haline gelir.Farklılaştırılmış miyotüpler resimde gösterilir C.Miyotütlerin füzyon ve farklılaşma süresi çell genotipine bağlı olarak yedi ila 21 gün arasında değişebilir. Hücreler ayrılmadan önce toplanmalı veya düzeltilmelidir.

Müfrezenin başlangıcı, bu resimdeki oklarda belirtildiği gibi, miyotüp kenarlarının rengi ve parlaklığı ile gözlemlenebilir. İmmünofluoresans ile, olgun kas spesifik proteinlerin ekspresyonu fibroblastların miyotüplere başarılı bir şekilde dönüştürünü doğrular. Bu resimlerde üç farklı hücre gösterilmiştir.

Farklılaşma derecesi hücreden hücreye değişecektir ve B ve C şekillerindeki hücrelerde olduğu için birincil mutasyondan etkilenebilir veya etkilenmeyebilir.Modelin daha fazla doğrulanması RNAseq tarafından doğrulandı. Bu arsada gösterildiği gibi, FM miyotüplerinde iskelet kasına kıyasla tespit edilen 12.000'den fazla farklı ifade edilmiş gen vardır. Her iki transkriptom arasındaki anlamlı korelasyon, FM hücrelerinin kas türevi hücre hatları için yararlı ve güvenilir bir taşıyıcı olduğunu gösteren kas spesifik bir ifade profiline sahip olduğunu destekler.

Bu in vitro modelin yararlılığını göstermek için DMD geninde en yaygın eksonik çoğaltmalardan birini kullandık. Exon iki'nin çoğaltılması, DMD okuma çerçevesinin bozulmasına yol açar ve atlanması, bu okuma çerçevesinin geri yüklenmesine veya iç ribozom giriş sitesinin kullanılmasına neden olabilir. Bu tedavi zaten in vivo çalışmalarla doğrulandı Şekil A, bu özel mutasyona uğramış hücre hattının RTPCR analizi ile ekson atlayarak tedavi ile ve tedavi olmadan kavram kanıtı gösterdik.

Şekil B'deki batı lekesi, fonksiyonel Distrofin proteininin tedavi edilen hücrelerde ifade edildiğini göstermektedir. Bu tedavinin verimliliğini in vivo modellerle karşılaştırırken, sonuçlar hücre farklılaşma tekniğinin güvenilirliğini destekler ve çeşitli mutasyona özgü gen tedavilerini test etmek için kullanımını destekler. Klinik çalışmalardan önce, hayvan ve hücresel modellerin yeteneğine bağlı olarak nöromüsküler bozukluklar üzerinde resmi tedavi desteğinin etkinliğini test etmek gerekir.

Hayvan modellerinin gelişimi, günümüzde daha kolay olmasına rağmen, her belirli mutasyon için uygun bir seçenek değildir. Dermal fibroblastlardan elde edilen IPS hücreleri aracılığıyla mioblastların üretilmesi bir alternatiftir, ancak zaman alıcı bir tekniktir. Bu nedenle, bu prosedür, fibroblastların miyoblastlara doğrudan dönüştürülmesine izin veren IPS üretimine basit bir alternatiftir.

Kas biyopsilerinin daha invaziv uygulamasından kaçınarak insan hücre modellerine erişimi kolaylaştırır Sonuç olarak, fibroblastların miyoblastlara doğrudan dönüştürülmesi, nöro kas bozuklukları için tedavilerin spesifik bağlamla sınırlı olarak test etmek için güçlü bir araçtır.