Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Bir çapraz bağlayıcı varlığında bir gliserol gradyan santrifüjlemesinin gerçekleştirildiği gradyan fiksasyon yöntemi, çok alt birimli komplekslere geçici olarak bağlanan proteinler arasındaki etkileşimlerin tanımlanmasına yardımcı olur. Gliserol gradyanında fiksasyon reaktiflerinin kullanılması, çökelti oluşumu olmadan gevşek faktörlerin bağlanmasını stabilize eder ve spesifik proteinlerin eklenmiş yarı komplekslerle etkileşimlerinin tanımlanmasına izin verir. Bitiş protokolünün gösterilmesi, ilk kez kullananların yalnızca yazılı metinden anlaşılması zor olabilecek bilgileri öğrenmelerine yardımcı olur.

Maya toplam ekstrakt hazırlığı için, musluk etiketine kaynaşmış ekleme faktörlerinden birini ve uygun amino asitler veya nükleik bazlarla desteklenmiş bir litre Y ve B glikoz ortamını ifade eden maya hücrelerini büyütün. Kültür, 600 nanometre bir optik yoğunluğa ulaştığında, maya hücrelerini üç adet 500 mililitrelik santrifüj şişesinde santrifüjleme yoluyla toplayın ve hücreleri yıkama başına 10 mililitre soğuk steril suda iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri soğuk tampon A'nın hücre hacminin 10'da birinde yeniden süspanse edin ve maya hücresi süspansiyonunun 50 mikrolitrelik damlasını sıvı nitrojen içinde dondurun.

Dondurulduktan sonra, donmuş hücre peletlerini bir bilyalı değirmen cihazında üç dakika boyunca 20 hertz'de altı döngü boyunca öğütün, her döngünün sonunda donmuş hücre kabını sıvı nitrojene batırın. Son döngüden sonra, ekstraktları içeren tüpleri ara sıra çalkalayarak oda sıcaklığında suya yerleştirin. Eridikten sonra, ekstraktları toplamak için santrifüjleyin.

Ve temizlenen süpernatanların BCA yöntemi ile elde ettiği proteini ölçün. Daha sonra, eksi 80 santigrat derece depolama için ekstraktların alikotlarını sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurun. Bir gliserol gradyanı hazırlamak için, çapraz bağlama maddesi glutaraldehitin %0.1'lik bir nihai konsantrasyonunu %30'luk bir gliserol ve tampon A çözeltisine ekleyin ve homojenize etmek için karıştırın.

12 mililitrelik bir santrifüj tüpüne altı mililitre soğuk %10 gliserol ve tampon A çözeltisi ekleyin ve tüpün dibindeki %30 gliserol glutaraldehit çözeltisini katmanlamak için uzun bir iğne ile donatılmış bir gradyan ana cihaz şırıngası kullanın. Üreticinin spesifikasyonlarına göre doğrusal bir gliserol gradyanı oluşturmak için bir gradyan ana cihazı kullanın. Tüpün üstüne yaklaşık iki miligram hücre özütü eklemeden önce, 200 mikrolitre% 7'lik bir gliserolü dikkatlice katmanlayın ve gradyanın üstüne bir yastık tamponlayın.

Gliserol gradyanı oluşturulduktan sonra, numuneyi önceden soğutulmuş bir döner kova rotoruna yerleştirin ve ekstraktı santrifüjleme ile toplayın. Her 12 mililitrelik numune tüpünden numuneyi 24.500 mikrolitrelik fraksiyonlar halinde ayırın ve %40'lık bir gliserol çözeltisini tüpten fraksiyon toplamaya %10 ila 30 gradyan boyunca itmek için peristaltik bir pompa kullanın. Daha sonra, her fraksiyonun 50 mikrolitresini doğrudan bir nokta lekesi üzerindeki nitroselüloz membranlara yükleyin, ardından bloke edici tampon ekleyin ve immünoblo üzerindeki proteini tespit etmek için CBP'ye karşı bir birincil antikor ve gerektiği gibi uygun bir ikincil antikor kullanın.

Çapraz bağlayıcının yokluğunda CWC 24, yaklaşık 80 ila 200 megadaltonluk komplekslere karşılık gelen beş ve 13 fraksiyonları arasında konsantre edilir. Bununla birlikte, çapraz bağlayıcının varlığında, CWC 24'ün gradyan üzerindeki konumu, daha büyük komplekslere karşılık gelen gradyanın altındaki fraksiyonlara kaydırılır. CWC 24 sedimantasyonunu U5 snRNP alt birimi, Prp8 ve NTC alt birimi ile karşılaştıran Prp19, CWC 24'ün aynı fraksiyonlarda konsantre olduğunu ortaya koymaktadır.

Ancak, spliceosome ile geçici olarak ilişkili olduğu için, daha hafif fraksiyonlarda da bulunur. İlginç bir şekilde, 11 ve 12 numaralı fraksiyonlar, Prp8 ve 19'un konsantre olmaya başladığı fraksiyonlardır, bu da bunun, B Act kompleksinin çökelmeye başladığı gradyan kısmı olduğunu düşündürür. 11 ve 12 fraksiyonlarının Western blot analizi, Prp8 ve 19 sinyallerini, %8'lik bir akrilamid jeline zar zor giren yaymalar olarak ortaya çıkarır ve bu da bunların gerçekten büyük komplekslerin bir parçası olduklarını gösterir.

CWC 24 ayrıca fraksiyon 12'de de bulunur, ancak çok daha düşük bir konsantrasyonda, B Act kompleksine geçici bağlanması ile tutarlıdır. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar glutaraldehitin, geçici faktörlerin ekleme alt komplekslerine bağlanmasını stabilize etmek için bir çapraz bağlayıcı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, splisozom gibi bazı bileşenleriyle geçici olarak ilişkili olan herhangi bir dinamik motor alt birim kompleksinin çalışmasına uygulanabilir.