Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

Protokolümüz, araştırmacıların damar ağı oluşum sürecini açık ve kolay izlenebilir bir şekilde incelemelerini, yeni çalışmalara kapıları açmalarını ve kan damarı davranışlarına ışık açmalarını sağlar. Bu teknik, çevredeki çevreye yanıt veren son derece organize ve tekrarlanabilir vasküler ağlar oluşturma imkanı sunar. Vasküler bir hastalıktan muzdarip hastalardan endotel hücreleri bu sistem kullanılarak alınabilir, bu da vasküler hastalığın yeniden oluşturulmasını ve uygun bir tedavinin bulunmasını mümkün hale getirir.

Önerilen yöntem, farklı hücre tipleriyle eşleştirildiğinde vasküler ağ davranışını incelemek için genişletilebilir ve gelişmekte olan damarların belirli bir doku tipi ile etkileşimini gözlemlemeye izin verir. İskeleleri en az 15 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak başlayın, ardından PBS'de iki kez yıkayın. Tohumlanacak iskele başına 28,5 mikrolitre PBS ile 1,5 mikrolitre fibronektin stok çözeltisini karıştırın.

Pipetleme hatalarını önlemek için tüm iskeleler için kullanılacak bir fibronektin seyreltme hazırlayın. İskeleleri seyrek bir hidrofobik yüzeyin üzerine yerleştirin ve her iskeleyi 30 mikrolitre fibronektin seyreltme ile örtün. Plakanın kapağını değiştirin ve fibronektin kaplı iskeleleri en az bir saat boyunca 37 santigrat dereceye ve% 100 neme ayarlanmış bir inkübatöre koyun.

İnkübasyondan sonra, fibronektin kalıntılarını çıkarmak için PBS'deki iskeleleri hafifçe durulayın. İskeleler PBS'de bir haftaya kadar dört santigrat derecede tutulabilir. Bazal ortamı, üretici tarafından belirtildiği gibi bir antibiyotik çözeltisi, FBS ve endotel hücre büyüme takviyeleri de dahil olmak üzere ilgili ortam kiti bileşenleriyle karıştırarak endotel hücre veya EC ortamı hazırlayın.

mililitre başına dört milyon hücre konsantrasyonu ile EC ortamında insan yağsız mikrovasküler endotel hücre süspansiyonu yapın. Tokmalar kullanarak, TC olmayan 24 kuyu plakasına kuyu başına bir fibronektin kaplı iskele yerleştirin. Her iskeleyi hücre süspansiyonunun 25 mikroliter damlacıklarıyla kapla ve süspansiyonun iskeleden akmasına izin vermeyin.

Kapağı tabağa koyun ve 60 ila 90 dakika boyunca 37 santigrat derece, % 5 karbondioksit ve% 100 nemde bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu 700 mikrolitre EC ortamı ile doldurun. Endotelize edilmiş iskeleleri, floresan mikroskopi kullanılarak veya üç gün boyunca EC izdihamı gözleninceye kadar kuluçkaya yatırın.

Ortamı iki günde bir değiştirin. 500 mililitre düşük glikoz DMEM, 57,5 mililitre FBS, 5,75 mililitre esansiyel olmayan amino asit, 5,75 mililitre GlutaMAX ve 5,75 mililitre penisilin-streptomisinin-nystatin çözeltisini karıştırarak DPSC ortamını hazırlayın. Endotelize edilmiş iskeleleri TC olmayan yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.

Vakumu doğrudan iskeleye uygulamamaya dikkat ederek, bir pipet veya vakum emme kullanarak mevcut plakadaki tüm ortamları atın. Her kuyunun ortasına bir iskele yerleştirin, ardından çevreyi hafif vakumla kurulayın. Trombin ve fibrinojen stok çözeltilerini PBS ile mililitre başına beş birim ve mililitre başına 15 miligramlık son konsantrasyona seyreltin.

Trombin seyreltmede mililitre süspansiyon başına sekiz milyon DPSC hazırlayın ve süspansiyonun 12,5 mikrolitresini tohumlanacak iskele başına ayrı mikrotüplere dağıtın. 12,5 mikrolitreye beş ila 50 mikrolitre pipet ayarlayın ve fibrinojen çözelti ile doldurun. Ucu çıkarmadan pipet 25 mikrolitreye ayarlayın.

Uçtaki malzeme yükselmeli ve boş bir hacim bırakmalıdır. Sıvı uç açıklığı gelene kadar piston düğmesine yavaşça basın, ancak dışarı sızmaz. Pistonu bu pozisyonda tutun ve ucu trombin süspansiyonundaki hücreleri içeren mikrosantrifüj tüplerinden birine yerleştirin ve ucun sıvıyla temas halinde olduğundan emin olun.

Piston düğmesini yavaşça bırakın ve hücre süspansiyonunu ucuna çekin. Kabarcık oluşumunu önleyerek her iki malzemeyi de iyice karıştırın. Karışık malzemeleri endotelize edilmiş bir iskelenin üzerine hızla dağıtın.

Her iskele için önceki adımları tekrarlayın, uç içinde beklenmeyen fibrin jeli oluşumunu önlemek için kullanımlar arasında ipuçlarını değiştirdiğinden emin olun. Plaka kapağını değiştirin ve iskeleleri 37 santigrat derecede, % 5 karbondioksit ve% 100 nemde 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, her kuyuyu bir mililitre bire bir DPSC ve EC ortamı ile doldurun.

Bir hafta boyunca kültür, her gün ortamı değiştirmek. Kültür sırasında farklı zaman noktalarında, ortamı kuyudan çıkarın ve vasküler gelişimi veya ilgi çekici başka bir parametreyi incelemek için konfokal mikroskop kullanarak yapıları görüntüleyin. Bu protokol, SU-8 fotoresistlerinden yapılmış mozaikli iskelelerin imal edilmesine izin verir.

Farklı bölme geometrilerine ve son derece doğru ve tekrarlanabilir özelliklere sahip iskeleler elde edilmiştir. Hem endotel hücrelerinin hem de destek hücrelerinin geleneksel eşzamanlı tohumlanmasıyla, hücreler iskelenin üzerine homojen bir şekilde dağıtıldı ve bu da öngörülemeyen ve düzensiz damar ağlarıyla sonuçlandı. Aksine, adım adım hücre tohumlama oldukça organize vasküler ağlara neden oldu.

Floresan endotel hücreleri kullanırken, damarlar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Endotel hücrelerini ifade eden kırmızı floresan protein altıgen iskelelerde kültürlendi ve görüntülendi. Destek hücreleri ilk gün eklendi ve damar ağları damar gelişimini ölçmek için her gün görüntülendi.

Her zaman noktası için, tüm iskelenin geniş görüntüleri çekildi. Gemi büyümesi toplam damar uzunluğu ve alanı olarak ölçüldü. Çok renkli endotel hücreleri kullanılarak tek damar takibine olanak sağlamak için konfokal görüntüleme zaman atlamalı olarak gerçekleştirildi.

Gemi yolu zaman atlamalı olarak oluşturuldu, bu da gemi göçini gözlemlemeyi mümkün hale getirdi. Damar olgunlaşması düz kas aktüensi ve destek hücrelerinin varlığı ile gözlendi. Dairesel, altıgen ve kare bölmeler için hücreler çoğalır ve yapılara dönüşür.

Yedinci güne gelindiğinde, tüm şekiller zengin ve karmaşık bir damar ağı gösterdi. Daha yüksek büyütme görüntüleri, daha yoğun bir düz kas aktisin ve oluşan damarlarla birlikte lokalize hücre varlığını desteklediğini, destek hücresi alımını ve damar yapılarını çevreleyen farklılaşmayı ortaya çıkardı. Bu teknik, belirli hücre inhibitörleri gibi farklı durumlara maruz kaldığında veya ek hücre tiplerinin varlığında üç boyutlu vasküler ağların davranışını incelemek için kullanılabilir.