Name: Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Keşfedin fare partenogenetik haploid embriyonik kök hücreleriyle sperm yerine kullanımını ve genomik damgalama çalışmaları için yarı klon embriyoların oluşturulmasını. Bu yöntem üreme biyolojisinde yeni araştırma olanakları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PhaESC hatlarının türeyen dr. Giulio Di Minin'e ve akış sitometrisi operasyonu için Dr. Remo Freimann'a teşekkür ederiz. Ayrıca Bayan Michèle Schaffner ve Bay Thomas M. Hennek'i embriyo transferi konusunda teknik destek için kabul ediyoruz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant 31003A_152814/1) tarafından desteklendi.

<ol><li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+genetic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li>
<li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice%3A+A+decision+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li>
<li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072(2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li>
<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
<li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li>
<li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li>
<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
<li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350(2019).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Memelilerin somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile klonlaması 1990'larda19,20,21'deöncü olmuştur. Bu gelişmeler amfibilerde 30 yıl önce yapılan klonlama çalışmalarının ardından22. Önemli gecikme, memelilerde embriyoloji ve genomik baskı zorliğini yansıtır. Memeli SCNT'nin gelişimi, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan sperm yerine haESC uygulamasının temelidir.
Hücre döngüsü senkronizasyonu SCNT23'ünbaşarısı için önemli bir faktördür. Bu protokolde haESC enjeksiyonu için de durum böyledir. Bir alıcıya donör genomu sokulması, embriyo gelişimini bozacak kromozomal kırılmayı veya aneuploidileri önlemek için hücre döngüsü aşamalarının eşleşmesini gerektirir. Yarı klonlama, iki genom ve bir sitoplastın uyumlu olması gereken ek karmaşıklığa sahiptir. Daha önceki bir rapor, M fazlı tutuklanmış androgenetik hESC'lerin enjeksiyonunun, yarı klonlanmış embriyoların G1 fazlı hESC'lerin oositlere enjeksiyonundan daha iyi gelişimsel oranlar sağladığını göstermiştir7. Bu rapor, yarı klonlama için uygun bir eşitleme noktası olarak M fazı önermektedir. Buna göre, fakihler metatatozda demekolsin ile mitotik olarak tutuklandı ve doğal olarak meiosis II metafazında tutuklanan MII oositlerinin ooplazmına enjekte edildi. Daha da önemlisi, M fazlı arrest, donör ve alıcı hücre döngüleri arasında mükemmel senkronizasyon sağlayan yüksek verimli fare ESC'lerinde elde edilebilir.
Mitoz sırasında, nükleer zar parçalanır ve çoğaltılan kromozomların bağlandığı bir mil oluşur. M fazlı DKO-fadezlerin enjeksiyonundan sonra, kardeş kromatlar sahte bir kutup gövdesine ve zigot7'ye (Şekil 3E) ayrılmıştır. Sonuç olarak, bir DKO-phaESC'den tek bir kromozom kümesi yarı klonlanmış embriyoya katkıda bulunur. DKO-phaESC kromozomlarının kardeş kromatlarının enjeksiyondan sonra doğru bir şekilde ayrıştırılabilmesi önemlidir. Sağlam bir DKO-phaESC'nin plazma zarı, sahte bir kutup gövdesine ayrımı önler. DKO-fazesklerin plazma zarının yırtılmadığı ve embriyoların enjeksiyondan sonra ooplazmada bozulmamış DKO-fakESC'ler sergilediği nadir vakaları gözlemledik (Şekil 3D). Bu nedenle DKO-fazesklerin plazma zarının pipetleme ile çıkarılmasına özen gösterilmelidir. Enjeksiyon sırasında, kromozom ayrım kusurlarına yol açabilecek ve aneuploidiye de neden olabilecek oosit meiotik milinin bozulmasını önlemek eşit derecede önemlidir.
Memelilerde, genomik baskı sperm replasmanı olarak fadezlerin uygulanmasını sınırlar. Partenogenetik hemECC'ler genomik izlerin anne yapılandırmasına sahipken, sperm bir baba yapılandırmasına sahiptir. Bu nedenle, tam süreli yavruların üretimi, sperm replasmanı olarak wildtype faesklerin enjekte edildikten sonra gerçekleşmedi. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, IG- ve H19-DMR'lerin silinmesi faklarda tasarlanmıştır. Maternal Igf2-H19 ve Gtl2-Dlk1 loci'deki baskılı ifadenin değiştirilmesi, aktarılan 2 hücreli embriyolara dayanarak% 5,1'in üzerinde bir frekansa sahip yarı klonlanmış farelerin üretilmesine izin vermek için genomik baskıların yapılandırmasını değiştirmek için yeterlidir. Bu gözlemler, iki baskılı genin hedeflenmesi, fadeslerin genomunun farelerdeki spermlerin yerini alan işlevsel bir baba yapılandırmasına geçtiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu strateji için fadeslerin kalıcı bir genetik modifikasyonu gereklidir. Alternatif bir strateji olarak androgenetik haESC düşünülebilir. Androgenetik hESC'ler sperm genomundan türetilir ve baba izlerine sahiptir. Wildtype androgenetik hESC'lerin, transfer edilen embriyoların% 1.3 ila% 1.9'u arasında bir sıklıkta tam süreli yavrular üretmek için sperm replasmanı olarak katkıda bulunduğuna dair raporlar vardır4,7,24. Tam süreli yavrular ayrıca,transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 20.2'si oranında IG ve H19-DMR'lerin silinmesi ile androgenetik hESC'lerin enjekte ederek elde edilmiştir24. Modifiye androgenetik hESC'ler kullanılarak yarı klonlamanın artan verimliliği, künyelerin kültürde kararsız hale gelebilmesinden muhtemeldir. Baskı kusurları kritik DMR'lerin genetik silmeleri ile düzeltilir.
Genetik modifikasyonların doğrudan oosit veya sperm genomlarına sokulmasındaki zorluk göz önüne alındığında, hESC'ler ebeveyn genomlarını ayrı ayrı manipüle etmek için değerli bir araçtır. Sperm yerine HESC'leri kullanmak, fare mikrop hattında genom düzenleme için olağanüstü bir avantaj sağlar. Yeni bir çalışma CRISPR/ Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi embriyonik gelişim için kritik olan baskı bölgelerinin karakterizasyonu için HESK'lerin uygulanması ile birleştirdi12. Bu çalışma, Rasgrf1-DMR'nin bimaternal farelerin gelişiminde H19ve IG-DMR'lerle birlikte rolünü ve biipaternal farelerin gelişiminde 7 farklı DMR'nin işlevini analiz etti. Sperm için HESC'lerin ikame edilmesi yöntemi, ilkel mikrop hücresi gelişiminde DND1 proteini içindeki anahtar amino asitleri tanımlamak ve kemik gelişimindeki genleri tanımlamak için genetik tarama yaklaşımlarının temelini oluşturmuştur24,25,26. Embriyonik gelişimdeki temel faktörleri belirlemek için genomik baskı ve genetik tarama üzerine yapılan çalışmalar, HESC'lerin gametik genom olarak uygulanması için önemli yaklaşımlardır.

Memelilerde, gametler genetik bilgileri bir sonraki nesle ileten tek hücrelerdir. Bir oosit ve spermatozonun füzyonu, yetişkin bir hayvana dönüşen bir diploid zigot oluşturur. Gametik genomlardaki mutasyonlar böylece yavrular tarafından kalıtsaldır ve türlerde genetik varyasyonu yönlendirmektedir1. Mikroptaki mutasyonların tanıtılması, gen fonksiyonunun karakterizasyonu ve hastalık modellemesi de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik çalışmalar için genetiği değiştirilmiş hayvanlar üretmek için uygulanmıştır. Hem oositler hem de spermatozoa, çoğalma sona eren ölümcül farklılaşmış ve son derece uzmanlaşmış hücrelerdir. Bu nedenle, gametlerin doğrudan modifikasyonu teknik olarak zordur ve özel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Genetik değişiklikler, genetiği değiştirilmiş ESC'lerin gelişmekte olan embriyoya entegre oldukları ve germline kolonileştikleri blastosistlere enjekte edilmesiyle fare germline sokulabilir. Ek olarak, CRISPR/ Cas9 sistemi de dahil olmak üzere genom düzenleme yaklaşımlarını kullanan zigotların genetik modifikasyonu yaygın olarak benimsenmiştir2.
Son zamanlarda, bir gametik genom 3 , 4,5,6,7,8yerine haESC'leri uygulayan olağanüstü bir yaklaşımbildirilmiştir. HESC'ler, partenogenetik veya androgenetik haploid blastosistlerin iç hücre kütlesinden elde edilen kök hücre hatlarıdır ve tek bir kromozom kümesine sahiptir4,7,9,10. Hem partenogenetik hem de androgenetik hemECC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra yarı klonlanmış farelerin genomuna katkıda bulunabileceği gösterilmiştir. Diğer yaklaşımların aksine, hemAC'lerin genomları, kendi kendini yenileme kapasiteleri nedeniyle kültürde doğrudan değiştirilebilir. Spermin yerine hemESK'ler konarak mikrop hattına genetik modifikasyonların getirilmesi biyolojik çalışmalar için önemli bir yöntemdir. Sırasıyla partenogenetik veya androgenetik hemECS'lerden türetilen anne veya baba genomlarını ayrı ayrı kültüre etme ve manipüle etme imkanı sağlar. Daha sonra HESC'ler, özellikle genomik baskı, alel özgü ifade ve ebeveyne özgü süreçler için avantajlı olan gametik genom replasmanı olarak kullanılabilir.
Farelerde normal embriyo gelişimi için hem anne hem de baba genomik bilgi gereklidir11. Bu nedenle, sperm genom5,8yerine vahşi tip partenogenetik hemECS (faESC) enjekte edildiğinde tam süreli yavrular elde edilemedi. Gelişimsel bloğun üstesinden gelmek için, partenogenetik hemECC'lerin maternal genomunun genomik baskısının bir baba yapılandırmasına düzeltilmesi gerekir. Bu, farklı metillenmiş bölgelerin (DMR' ler) manipülasyonu ile elde edilebilir. Bugüne kadar, H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR ve Rasgrf1-DMR'nin hedeflenen silmeleri, 3 ,5,8,12falclerinde doğumla ifade edilen genleri bastırmak için çalışılmıştır. Bu çalışmalar, hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin silinmelerinin, bir anneyi sperm kromozomlarının yerini tutabilecek bir baba künyesi yapılandırmasına dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. İki DMR delesyonlarını oositlere taşıyan fazEZ'lerin intrasitoplazmik enjeksiyonu, transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 5.1 ila% 15.5'i arasında bir frekansa sahip yarı klonlanmış yavrular verdi.
Bu protokol, çift nakavtlı fadeskler (DKO-phaESC) olarak adlandırdığımız hem H19-DMR hem de IG-DMR silmeleri olan fakların uygulanmasına dayanmaktadır. DKO-phaESC hatları kurmak için faesklerde genomik baskı modifikasyonu, sperm genomunun yerine Oositlere DKO-faesk enjeksiyonu, yarı klonlanmış embriyoların blastosistlere kültürü ve yarı klonlanmış fareler elde etmek için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Bu protokol, baba genomunun kesin ve doğrudan manipülasyonu ve yarı klonlanmış embriyo ve farelerin üretilmesini gerektiren araştırmacılar için bir referanstır.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>15 ml Tüp</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>BSA fraksiyonu</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Demecolcine çözeltisi</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>DR4 fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>3208</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Donma ortamı</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC kültür</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Hepes çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Işınlanmış MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>LIF (Lösemi inhibitör faktör)</td> <td>(Ev yapımı)</td><td>-</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Lipofeksiyon reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC kültür</td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>piggyBac plazmidi bir CAG-EGFP transgeni taşıyan</td><td>Addgene</td> <td># 40973</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>piggyBac transpozaz plazmid</td><td>Sistem Biyobilimleri</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>pX330 plazmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>pX458 plazmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC kültürü</td></tr><tr><td>DNA polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>dNTP Karışımı</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Akson</td><td>A3830</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotipleme</td></tr><tr><td>5 mL Tüp</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>5 mL Hücre süzgeç kapaklı tüp</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Süperovülasyon</td></tr><tr><td>30 gauge 1/2 inç iğne</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Süperovülasyon</td></tr><tr><td>B6D2F1 fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>100006</td><td>Süperovülasyon</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD hayvan sağlığı</td><td>49451</td><td>Süperovülasyon</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Süperovasyon</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Süperovülasyon</td></tr><tr><td>10 cm'lik çanak</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>4 oyuklu plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>6 cm çanak</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Merkez kuyu çanağı</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Dijital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>M16 orta</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>M2 orta</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Cam kılcal</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>Stronsiyum klorür</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embriyo manipülasyonu</td></tr><tr><td>5ml şırınga</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kapsül</td><td>Bilim ürünü</td><td>GB100T-8P</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>CellTram 4r Yağ</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon Florinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Tutma pipeti</td><td>Biyomedikal Aletler-Mikroenjeksiyon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon pipeti</td><td>Biyomedikal Aletler-Mikroenjeksiyon</td><td></td> <td>Mikrolaoder</td></tr><tr><td>uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör kolları</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-1000</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>PVP (Polivinilpirolidin)</td> <td>Merck</td><td>PVP360</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon Şırınga filtresi</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr></tbody></table>

sperm yerine fare partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin uygulanması

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Cinsel üremeye sahip organizmalarda, mikrop hücreleri yeni bireylere dönüşen totipotent hücrelerin kaynağıdır. Farelerde, bir oositin bir spermatozoon tarafından döllenmesi totipotent bir zigot oluşturur. Son zamanlarda, birkaç yayın haploid embriyonik kök hücrelerin (hemECS) gametik genomların yerini tutabileceğini ve farelere dönüşen embriyolara katkıda bulunabileceğini bildirmektedir. Burada, oositlere intrasitoplazmik enjeksiyon ile embriyo oluşturmak için sperm yerine partenogenetik hemECC'lerin uygulanması için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, haESC'lerin sperm replasmanı olarak hazırlanması, haESC kromozomlarının oositlere enjeksiyonu ve yarı klonlanmış embriyo kültürü için adımlardan oluşur. Embriyolar embriyo transferinden sonra verimli yarı klonlanmış fareler verebilir. Sperm replasmanı olarak HESC'lerin kullanılması mikrop hattında genom düzenlemesini, embriyonik gelişim çalışmalarını ve genomik baskıların araştırılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolün amacı, yarı klonlanmış embriyo ve fare elde etmek için sperm yerine HESK'leri uygulamaktır. Bu amaçla, CAG-EGFP transgene taşıyan bir DKO-phaESC hattı üretildi ve MII oositlerine intrasitoplazmik enjeksiyon için kullanıldı. Baba künye konfigürasyonu ile uygun bir fazESC hattı elde etmek için Cas9 çekirdeklerini kullanarak genetik mühendisliği gerçekleştirdik. Bir haploid ESC hattı, diploidizasyon için haploid ESC'lerin doğal eğilimi nedeniyle ortaya çıkan haploid ve diploid hücreleri içerir10. Haploid kromozom seti, sperm genomunun başarılı bir şekilde değiştirilmesi için bir ön koşuldur. Akış sitometrisine göre DNA içerik analizi, haploid ve diploid hücrelerin G0/G1-, S-ve G2/M fazlarındaki dağılımını göstermektedir (Şekil 2A).
DKO-phaESC hatlarını kurmak için, wildtype phaESC hatları stabil transgenik EGFP ekspresyonu için piggyBac transposon yapıları ve H19ve IG-DMR'lerin silinmesi için CRISPR / Cas9 plazmidleri ile trans enfekte edildi. Diploid ESC'leri dışlamak ve sadece EGFP'yi ifade eden haploid ESC'leri izole etmek için belirli bir sıralama kapısı tanımlanmıştır (Şekil 2A). Tek haploid EGFP pozitif hücreler daha sonra alt klonlar elde etmek için 96 kuyu plakalı bireysel kuyulara kaplandı. MEF besleyiciler, transfected fakların kaplama verimliliğini ve hayatta kalmasını artırmak için kullanıldı. Kültürlerin genişlemesinden sonra, pcr tarafından her iki DMR'nin silinmelerini taşıyan alt klonları tanımlamak için ilk genotipleme turu gerçekleştirildi. MEF besleyiciler kültürlerden çıkarıldıktan sonra, H19ve IG-DMR'lerde wildtype alellerinin yokluğunu doğrulamak için ikinci bir genotipleme yapıldı (Şekil 2B). Toplam 135 alt klondan, silinen alelleri taşıyan ve hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin wildtype alellerinden arındırılmış 5 haploid DKO-phESC hattı elde ettik.
Mikroskop altında yeşil floresan görselleştirmesi yapılarak yarı klonlanmış embriyolara katkılarını incelemek üzere DKO-fazlere cag-EGFP transjeni sokuldu (Şekil 3A). İntrasitoplazmik enjeksiyon için, DKO-fakeskler M fazında tutuklanmaları için demekolsin ile tedavi edildi. Böylece, DKO-fazEZ'lerin hücre döngüsü MII oositlerininkiyle senkronize edildi. Akış sitometrisi analizi, demekolin ile tedaviden sonra G2/M fazı tutuklu haploid (2n) ve diploid hücrelere (4n) karşılık gelen 2 popülasyon göstermiştir (Şekil 3B). 1n haploid zirvesinin yokluğu, hücre döngüsü durmasının büyük ölçüde tamamlandığını gösterdi. M fazlı haploid ESC'ler daha sonra sıralandı ve oositlere enjekte edildi. Bunun için, mikroenjeksiyon pipetine tek bir DKO-phaESC yüklendi ve bir MII oosit sitoplazmına enjekte edildi (Şekil 3C). DKO-phaESC'nin plazma zarı mikroenjeksiyon pipetinin ucuna pipetle sokularak yırtıldı.
Enjeksiyondan sonra, DKO-phaESC'lerin sitoplazma oositin büyük sitoplazmında dağıldığı için, inşa edilen yarı klonlanmış embriyolarda EGFP ekspresyolü nadiren tespit edildi (Şekil 3D). Nadir durumlarda, ooplazm içinde yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak bir noktası gözlenebilir. Bu gözlem muhtemelen bozulmamış DKO-fazların yanlışlıkla enjektelenmesinden kaynaklanmıştır. DKO-phaESC hücre zarın yırtılmaması muhtemelen daha fazla embriyo gelişimi ile uyumlu değildir ve kaçınılmalıdır. Enjeksiyondan bir saat sonra, embriyolar stronsiyum klorür18ile tedavi ile aktive edildi. Aktivasyonun başlatılmasından altı saat sonra, mikroskop altında en fazla 3 kutup cisimleri gözlenmiştir (Şekil 3E). Bu kutup cisimleri, oositlerin birinci ve ikinci kutup gövdelerine ve DKO-phaESC7'densahte bir kutup gövdesine karşılık gelir. Ek olarak, sperm ile normal döllenmeden sonra zigotların pronükleer aşamasına benzeyen diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında iki pronüklei gözlendi.
Gelişimsel yeterliliği göstermek için yarı klonlanmış embriyolar blastosist aşamasına kültürlendi (Şekil 5A). Ayrıca, yarı klonlanmış 2 hücreli evre embriyoların alıcı bir dişinin yumurtalıklarına aktarılmasından sonra tam süreli bir fare elde edildi (Şekil 5B). Beklendiği gibi, yarı klonlanmış bir embriyodan elde edilen fare, ne oositler ne de oosit türevi faklar Y kromozomu taşımazken dişiydi. Yarı klonlanmış fare aşırı derecede normaldi ve vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştiğinde sağlıklı yavrular üretti. Şimdiye kadar, yarı klonlanmış fare 600 günden fazla bir süredir belirgin bir sağlık sorunu olmadan hayattaydı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Şekil 1: DKO-fakesklerin sperm replasmanı olarak uygulanmasına genel bakış. (A) Protokolün prosedürlerinin bir zaman dilimi. (B) Şema, DKO-phaESC hatları oluşturma adımlarını gösterir (adım 1-6). (C) Şema, bir DKO-phaESC'nin mii oosit içine intrasitoplazmik enjeksiyonu ile yarı klonlanmış embriyoları oluşturma adımlarını gösterir (adım 7-14). Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; FACS = floresanla etkinleştirilen hücre sıralama; MEF = fare embriyonik fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Şekil 2: H19ve IG-DMR'ların CRISPR/Cas9 aracılı silmeleri ile DKO-phaESC hatlarının kurulması. (A) Stabil EGFP ekspresyonu için piggyBac plazmidleri ve 4 CRISPR/Cas9 plazmidleri ile transfeksiyondan sonra fadeklerin akış sitometri analizi. Transfected olmayan fades'ler kontrol olarak gösterilir. DNA profili (üstte) haploid ve diploid hücrelerin hücre döngüsü dağılımını gösterir. EGFP'yi ifade eden G1/S fazlı haploid hücreler yeşil kapı (alt, sağ) ile gösterilir. (B) MEF'lerde yetişen phaESC alt klonlarının genotiplenimi (ilk genotipleme) ve MOF'ların çıkarılmasından sonra (ikinci genotipleme). Alt klonlanmış fazESC çizgileri 1, 2, 3 ve 4, sırasıyla wildtype hücrelerini, H19-DMR silmeli hücreleri, IG-DMR silme ve birleşik H19- ve IG-DMR silmeleri ile temsil eder. 5–8 DKO-phaESC hatları hem H19-DMR hem de IG-DMR silmelerine sahiptir ve wildtype alellerinden arındırılmıştır. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; DMR = diferansiyel metillenmiş bölge; MEF = fare embriyonik fibroblast; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; WT = wildtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Şekil 3: Miyotik olarak tutuklanan DKO-phaESC'lerin MII oositlerine enjeksiyonu. (A) H19 ve IG-DMR'lerin CAG-EGFP transgene ve silmelerini taşıyan bir DKO-phaESCkültürünün morfolojisi; ölçek çubuğu = 50 μm. (B) DKO-fazezlerin 8 saat boyunca demecolcine ile tutuklandıktan sonra temsili akış sitometri analizi, demekolsin tedavisi olmayan DKO-fazler kontrol olarak gösterilmiştir. (C) Mikroenjeksiyon pipetinde DKO-fadezlerin morfolojisi. Plazma zarını pipetleme ile yırtmadan önce (solda) ve sonra (sağda) tek bir bozulmamış DKO-phaESC gösterilir; ölçek çubuğu = 20 μm. (D) MII oositlerine DKO-phaESC enjekte edildikten sonra 1 saat içinde embriyolar inşa edildi. EGFP floresan ve parlak alanın birleştirilmiş görüntüsü gösterilmiştir. Siyah ok uçları, kaçınılması gereken sağlam DKO-phaESC enjeksiyonundan sonra yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak noktalarını gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Stronsiyum klorür ile aktivasyonun başlatılmasından 6 saat sonra yarı klonlanmış embriyoların diferansiyel girişim kontrast görüntüsü gösterilmiştir. Beyaz ok uçları, enjekte edilen DKO-phaESC'den bir sahte kutup gövdesi de dahil olmak üzere 3 kutup gövdesine sahip embriyoları gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Şekil 4: DKO-phaESC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyonu için kurulumun şeması. (A) Enjeksiyon odasında bir enjeksiyon pipeti, bir tutma pipeti ve bir oosit düzenlenmesi gösterilmiştir. α, mikroenjeksiyon pipetinin büküm açısı. (B) İntrasitoplazmik enjeksiyon için mikromanipülasyon kabındaki damlaların düzeni. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Şekil 5: Yarı klonlanmış embriyoların gelişimi. (A) Yarı klonlanmış embriyoların in vitro preimplantasyon gelişimi. EGFP ekspresyasyonu ilk olarak intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra 2. günde dört hücreli embriyolarda gözlenir. 4. günde, blastosistlerde yoğun EGFP ekspresyolü görülebilir; ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Alıcı bir kadına 2 hücreli embriyo transferinden sonra elde edilen yarı klonlanmış bir fare. 74 dpp'de, yarı klonlanmış fare (ok ucu), vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştikten sonra ilk yavrularını (yıldız işareti) doğal doğumla teslim etti. Yarı klonlanmış embriyolar ve bu şekilde gösterilen yarı klonlanmış fare, Aizawa ve ark.3'te bildirilenlerle aynıdır. Kısaltmalar: EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; .dpp, doğum sonrası günler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Jelatin çözeltisi</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Jelatin</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embriyonik kök hücre (HaESC) ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lıf</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC bakım tamponu</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>HaESC ortamı</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES çözümü</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Yıkama arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA kesir</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lizis arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mm</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS çözümü</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinaz K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Etkinleştirme ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Stronsiyum klorür</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidaz ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidaz</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Kısaltmalar: LIF = lösemi inhibitör faktörü; MEF = fare embriyonik fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetal sığır serumu; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası; BSA = sığır serum albümin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = etileniamintetraasetik asit; SDS = sodyum dodecylsulfate; EGTA = etilen-bis(oksitilennitrilo)tetraasetik asit;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfat tamponlu salin; PVP = poliviniliptirolidon; hCG = insan koryonik gonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = hamile kısrak serum gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Orta, tampon ve çözelti tarifi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td colspan="2">Sıra (5' ila 3')</td>
			<td>Uygulama</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT ETIKETI AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Oligonükleotidlerin listesi.

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Bu protokol, Haploid fare embriyonik kök hücrelerinde genomik damgalamanın modifikasyonunu yanlış bir şekilde tarihlendirir, çünkü deneğimizin sahte spermden kaynaklanıyor ve farelerde evde yetiştirilen embriyoların üretilmesini sağlıyor. Bir gamedin genetik modifikasyonu genellikle zor teknikler gerektirir. Bu metodolojiyi kullanarak, ebeveyn gametleri, daha sonra bir sperm replasman seçeneği olarak farelere sokulmak üzere hibrit bir embriyonik kök hücrelerde manipüle edilebilir.Bu yöntem, embriyolarda bir paternal gametin yapay olarak spesifik modifikasyonunu mümkün kıldığından, özellikle genomik damgalama ve koterizasyon çalışmaları için geçerlidir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir fare embriyoloğu olan Charles Etienne Dumeau olacak. Deney için tutma ve mikroenjeksiyon pipetleri hazırlamak için, önce borosilikat cam kılcal damarları uzun bir şekle ve kademeli bir konikliğe sahip çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın.Tutma pipetlerini hazırlamak için, dış çapı 60 ila 100 mikrometre olan çekilmiş bir kılcal damarı, filament üzerindeki cam boncuk üzerine bir mikro dövme şeklinde yerleştirin. Filamenti açın ve kılcal damarı boncukla temas edene kadar indirin. Kılcal damar boncuğa bağlandığında, filamanı kapatın ve kılcal damarı geri çekerek kılcal damarın düz bir uçla kırılmasına neden olun.Ardından, kırık kılcal ucu filament üzerindeki cam boncuğun yanına yatay olarak yerleştirin ve kılcal ucun iç çapı 10 ila 20 mikrometre çapa ulaşana kadar ucu eritmek için filamenti ısıtın. Daha sonra kılcal damarı uçtan yaklaşık bir milimetre uzakta cam boncuğun üzerine yerleştirin ve kılcal damarın 20 derecelik bir açıyla bükülmesini sağlamak için filamanı ısıtın. Bir mikro enjeksiyon pipeti hazırlamak için, ısıtılmış filament üzerine cam boncuğun üzerinde yaklaşık altı mikrometre dış çapa sahip çekilmiş bir kılcal damar yerleştirin ve kılıcı boncukla temas edene kadar indirin.Kılcal damar takıldıktan sonra filamanı kapatın ve kılcal damarı geri çekin. Kılcal damar düz bir uçla kırılacaktır. Daha sonra kılcal damarı, kılcal uçtan yaklaşık bir milimetre uzakta cam boncuk üzerinde hareket ettirin ve kılcal damarın 20 derecelik bir açıyla bükülmesini sağlamak için filamanı ısıtın.İntrasitoplazmik enjeksiyon yapmak için, 10 santimetrelik bir kabın baş aşağı kapağına beş mikrolitre damla PVP çözeltisi ve 20 mikrolitre damla M2 ortamı yerleştirin ve damlaları mineral yağ ile kaplayın. Çanağı sahneye yerleştirin ve mikromanipülatöre bir tutma pipeti takın. Mikroenjeksiyon pipetini florokarbon yağı ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın ve pipeti piezo aktüatöre monte edin.Mikroskopla gözlemleyerek, mikroenjeksiyon pipetini bir damla PVP çözeltisine indirin. Pipet daldırıldığında, camı PVP ile kaplamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikroenjeksiyon pipetine küçük bir hacimde PVP çözeltisi yükleyin.Mikroenjeksiyonu ve tutma pipetlerini M2 ortamına daldırın ve damlanın altındaki pipete odaklanın. Çift nakavtlı partojenik ES hücre süspansiyonunun yaklaşık iki mikrolitresini M2 orta damlasına aktarın ve 10 M2 oositi aynı damlaya aktarmak için bir ağız pipeti kullanın. Bir oositi döndürün ve oositi tutmak için tutma pipetinden negatif basınç uygulayın, böylece perivitellin boşluğu mikroenjeksiyon pipetine bakacak şekilde, metafaz iki plakanın mikroenjeksiyon pipetinin yoluna yerleştirilmemesine dikkat edin.Mikroenjeksiyon pipetinin ucuna bir çift nakavt partojenik ES hücresi çizin ve hücre zarının yırtıldığını onaylayın. Mikroenjeksiyon pipetine hafif negatif basınç uygulayın ve zona pellucida'yı kırmak için mikroenjeksiyon pipetinin ucunu perivitellin boşluğuna doğru iterken dört piezo darbesi verin. Oosit bir mikroenjeksiyon pipeti ile penetre edin, böylece oolemma karşı tarafa gerilir ve oolemmayı delmek için bir piezo darbesi uygulayın, oolemmanın mikroenjeksiyon pipetinin şaftı boyunca gevşediğinden emin olun.Çift nakavt partojenik ES hücresini minimum hacimde besiyeri ile ooplazmaya enjekte edin ve mikroenjeksiyon pipetini oositten düzgün bir şekilde geri çekin. Enjekte edilen oositi tutma pipetinden serbest bırakın ve daha sonra toplamak için mikro damlanın yanına taşıyın. Tüm oositler enjekte edildiğinde, oositleri KSOM ortamı içeren önceden ısıtılmış bir merkez kuyu kabına aktarın ve çanağı aktivasyondan önce bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Akış sitometrisi ile CAG/EGFP transgenini taşıyan bu temsili çift nakavt partojenik ES hücre hattının DNA içerik analizi, G0, G1, S ve G2 M fazlarında haploid ve diploid hücrelerin dağılımını gösterir. Genotipleme, H19 ve intergenik diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerde vahşi tip alellerin yokluğunu doğrulamak için yapılabilir. Bir CAG / EGFP transgeni, yeşil floresanın mikroskop altında görselleştirilmesi yoluyla yarı klonlanmış embriyolara katkılarını incelemek için çift nakavt patojenik ES hücrelerine sokulabilir.Akış sitometri analizi, demuçülsen tedavisinden sonra G2 M fazı tutuklanmış haploid ve diploid hücrelere karşılık gelen iki popülasyonu gösterir. 1N haploid zirvesinin olmaması, hücrenin dinlenme döngüsünün büyük ölçüde tamamlandığını gösterir. Enjeksiyondan sonra, yapılandırılmış yarı klonlanmış embriyolarda EGFP ekspresyonu nadiren tespit edilir.çift nakavt partojenik ES hücrelerinin sitoplazması oositin büyük sitoplazmasına dağılır. Aktivasyondan altı saat sonra, mikroskop altında üç adede kadar polar cisim gözlemlenebilir. Oositin birinci ve ikinci polar cisimleri ve haploid ESC'den bir psödopolar cisim.Gelişimsel yeterliliklerini göstermek için, yarı klonlanmış embriyolar blastosit aşamasına kadar kültürlenebilir. Ayrıca, tam süreli dişi fareler, alıcı dişilerin yumurta kanallarına transfer edilen yarı klonlanmış iki hücre aşamalı embriyolardan elde edilebilir. Mikro enjeksiyon sırasında, oosit aktive edildiğinde kromozom ayrışmasını önlemek için haploid embriyonik kök hücrelerin plazma zarını yırtmak önemlidir.Partenogenetik haploid ES hücreleri yerine, androjenik haploid ES hücreleri de kullanılabilir. çalışma amacına bağlı olarak anne veya baba gametinin sperm replasmanı olarak seçilmesine izin verir.

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

Germ hücre nakli ve testis dokusu xenografting için Protokoller açıklanmıştır. Germ hücre nakli alıcı testiste donör kaynaklı spermatogenez ve spermatogonial kök hücreler (DGM) belirlenmesi için fonksiyonel bir sulandırma tahlil sonuçları temsil eder. Xenografting Testis dokusu alıcı farelerde testis gelişimini ve spermatogenezi çeşitli donör türleri üretir.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Sperm ile dondurulmuş çözülmüş İki hücreli evre embriyo gelişimi bu kit kullanımı ile 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 genetiği değiştirilmiş fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlendiği ve daha sonra başarılı IVF tarafından kurtarıldı.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Sunulan servikal manipülasyon yöntemi, vazektomize erkeklerle üreme dişilerine gerek kalmadan farelerde yalancı gebeliği indükleyebilir. Yalancı gebelik indüksiyonu, her ikisi de sunulan ameliyatsız embriyo transferi ve ameliyatsız suni tohumlamanın başarısı için gereklidir.

Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Keşfedin fare partenogenetik haploid embriyonik kök hücreleriyle sperm yerine kullanımını ve genomik damgalama çalışmaları için yarı klon embriyoların oluşturulmasını. Bu yöntem üreme biyolojisinde yeni araştırma olanakları sunar.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Daha fazla video keşfet