Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Bu protokol, Haploid fare embriyonik kök hücrelerinde genomik damgalamanın modifikasyonunu yanlış bir şekilde tarihlendirir, çünkü deneğimizin sahte spermden kaynaklanıyor ve farelerde evde yetiştirilen embriyoların üretilmesini sağlıyor. Bir gamedin genetik modifikasyonu genellikle zor teknikler gerektirir. Bu metodolojiyi kullanarak, ebeveyn gametleri, daha sonra bir sperm replasman seçeneği olarak farelere sokulmak üzere hibrit bir embriyonik kök hücrelerde manipüle edilebilir.

Bu yöntem, embriyolarda bir paternal gametin yapay olarak spesifik modifikasyonunu mümkün kıldığından, özellikle genomik damgalama ve koterizasyon çalışmaları için geçerlidir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir fare embriyoloğu olan Charles Etienne Dumeau olacak. Deney için tutma ve mikroenjeksiyon pipetleri hazırlamak için, önce borosilikat cam kılcal damarları uzun bir şekle ve kademeli bir konikliğe sahip çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın.

Tutma pipetlerini hazırlamak için, dış çapı 60 ila 100 mikrometre olan çekilmiş bir kılcal damarı, filament üzerindeki cam boncuk üzerine bir mikro dövme şeklinde yerleştirin. Filamenti açın ve kılcal damarı boncukla temas edene kadar indirin. Kılcal damar boncuğa bağlandığında, filamanı kapatın ve kılcal damarı geri çekerek kılcal damarın düz bir uçla kırılmasına neden olun.

Ardından, kırık kılcal ucu filament üzerindeki cam boncuğun yanına yatay olarak yerleştirin ve kılcal ucun iç çapı 10 ila 20 mikrometre çapa ulaşana kadar ucu eritmek için filamenti ısıtın. Daha sonra kılcal damarı uçtan yaklaşık bir milimetre uzakta cam boncuğun üzerine yerleştirin ve kılcal damarın 20 derecelik bir açıyla bükülmesini sağlamak için filamanı ısıtın. Bir mikro enjeksiyon pipeti hazırlamak için, ısıtılmış filament üzerine cam boncuğun üzerinde yaklaşık altı mikrometre dış çapa sahip çekilmiş bir kılcal damar yerleştirin ve kılıcı boncukla temas edene kadar indirin.

Kılcal damar takıldıktan sonra filamanı kapatın ve kılcal damarı geri çekin. Kılcal damar düz bir uçla kırılacaktır. Daha sonra kılcal damarı, kılcal uçtan yaklaşık bir milimetre uzakta cam boncuk üzerinde hareket ettirin ve kılcal damarın 20 derecelik bir açıyla bükülmesini sağlamak için filamanı ısıtın.

İntrasitoplazmik enjeksiyon yapmak için, 10 santimetrelik bir kabın baş aşağı kapağına beş mikrolitre damla PVP çözeltisi ve 20 mikrolitre damla M2 ortamı yerleştirin ve damlaları mineral yağ ile kaplayın. Çanağı sahneye yerleştirin ve mikromanipülatöre bir tutma pipeti takın. Mikroenjeksiyon pipetini florokarbon yağı ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın ve pipeti piezo aktüatöre monte edin.

Mikroskopla gözlemleyerek, mikroenjeksiyon pipetini bir damla PVP çözeltisine indirin. Pipet daldırıldığında, camı PVP ile kaplamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikroenjeksiyon pipetine küçük bir hacimde PVP çözeltisi yükleyin.

Mikroenjeksiyonu ve tutma pipetlerini M2 ortamına daldırın ve damlanın altındaki pipete odaklanın. Çift nakavtlı partojenik ES hücre süspansiyonunun yaklaşık iki mikrolitresini M2 orta damlasına aktarın ve 10 M2 oositi aynı damlaya aktarmak için bir ağız pipeti kullanın. Bir oositi döndürün ve oositi tutmak için tutma pipetinden negatif basınç uygulayın, böylece perivitellin boşluğu mikroenjeksiyon pipetine bakacak şekilde, metafaz iki plakanın mikroenjeksiyon pipetinin yoluna yerleştirilmemesine dikkat edin.

Mikroenjeksiyon pipetinin ucuna bir çift nakavt partojenik ES hücresi çizin ve hücre zarının yırtıldığını onaylayın. Mikroenjeksiyon pipetine hafif negatif basınç uygulayın ve zona pellucida'yı kırmak için mikroenjeksiyon pipetinin ucunu perivitellin boşluğuna doğru iterken dört piezo darbesi verin. Oosit bir mikroenjeksiyon pipeti ile penetre edin, böylece oolemma karşı tarafa gerilir ve oolemmayı delmek için bir piezo darbesi uygulayın, oolemmanın mikroenjeksiyon pipetinin şaftı boyunca gevşediğinden emin olun.

Çift nakavt partojenik ES hücresini minimum hacimde besiyeri ile ooplazmaya enjekte edin ve mikroenjeksiyon pipetini oositten düzgün bir şekilde geri çekin. Enjekte edilen oositi tutma pipetinden serbest bırakın ve daha sonra toplamak için mikro damlanın yanına taşıyın. Tüm oositler enjekte edildiğinde, oositleri KSOM ortamı içeren önceden ısıtılmış bir merkez kuyu kabına aktarın ve çanağı aktivasyondan önce bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Akış sitometrisi ile CAG/EGFP transgenini taşıyan bu temsili çift nakavt partojenik ES hücre hattının DNA içerik analizi, G0, G1, S ve G2 M fazlarında haploid ve diploid hücrelerin dağılımını gösterir. Genotipleme, H19 ve intergenik diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerde vahşi tip alellerin yokluğunu doğrulamak için yapılabilir. Bir CAG / EGFP transgeni, yeşil floresanın mikroskop altında görselleştirilmesi yoluyla yarı klonlanmış embriyolara katkılarını incelemek için çift nakavt patojenik ES hücrelerine sokulabilir.

Akış sitometri analizi, demuçülsen tedavisinden sonra G2 M fazı tutuklanmış haploid ve diploid hücrelere karşılık gelen iki popülasyonu gösterir. 1N haploid zirvesinin olmaması, hücrenin dinlenme döngüsünün büyük ölçüde tamamlandığını gösterir. Enjeksiyondan sonra, yapılandırılmış yarı klonlanmış embriyolarda EGFP ekspresyonu nadiren tespit edilir.

çift nakavt partojenik ES hücrelerinin sitoplazması oositin büyük sitoplazmasına dağılır. Aktivasyondan altı saat sonra, mikroskop altında üç adede kadar polar cisim gözlemlenebilir. Oositin birinci ve ikinci polar cisimleri ve haploid ESC'den bir psödopolar cisim.

Gelişimsel yeterliliklerini göstermek için, yarı klonlanmış embriyolar blastosit aşamasına kadar kültürlenebilir. Ayrıca, tam süreli dişi fareler, alıcı dişilerin yumurta kanallarına transfer edilen yarı klonlanmış iki hücre aşamalı embriyolardan elde edilebilir. Mikro enjeksiyon sırasında, oosit aktive edildiğinde kromozom ayrışmasını önlemek için haploid embriyonik kök hücrelerin plazma zarını yırtmak önemlidir.

Partenogenetik haploid ES hücreleri yerine, androjenik haploid ES hücreleri de kullanılabilir. çalışma amacına bağlı olarak anne veya baba gametinin sperm replasmanı olarak seçilmesine izin verir.