CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Bu teknik, kısa bir zaman dilimi içinde CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi ile C.elegans'a kesin mutasyonlar eklemek için faydalıdır. Bu teknik, C.elegans genomunu düzenlemek için verimli ve akıcı bir yol sağlar, çünkü bir Co-CRISPR işaretleyicisinin kullanılması, pozitif olarak düzenlenmiş solucanları tanımlama olasılığını büyük ölçüde artırır. Mikroenjeksiyonları gerçekleştirme pratiği yaptığınızdan ve istenen düzenlemeleri elde etme şansını artırmak için mümkün olduğunca çok sayıda solucanın gonad kollarının her ikisini de enjekte ettiğinizden emin olun.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan lisans öğrencileri olan Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith ve Carter Dierlam olacak. Genç yetişkin solucanları enjeksiyona hazırlamak için, L2, L3 evre C.elegans'ı bir MYOB plakası üzerindeki taze bir bakteri çimine toplayın ve plakayı gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, enjeksiyon karışımını steril nükleaz içermeyen tüplerde tabloda belirtildiği gibi hazırlayın ve pipetleme ile karıştırın.

Karışımı santrifüjleme ile döndürmeden önce ribonükleoprotein komplekslerini birleştirmek için enjeksiyon karışımını 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, rahimde 10'dan az embriyo bulunan yaklaşık 30 genç yetişkin solucanı seçmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve her solucanın her iki gonad koluna kol başına birkaç pikolitre enjeksiyon karışımı enjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra, enjeksiyon pedinden enjekte edilen solucanları OP50 E.coli ile tohumlanmış 60 milimetrelik bir MYOB plakasına nazikçe pipetlemek için bir kurtarma aparatı kullanın.

Enjekte edilen solucanların oda sıcaklığında bir saat iyileşmesine izin verin. İyileşme süresinin sonunda, enjekte edilen her solucanı tek tohumlu 35 milimetre MYOB agar plakasına aktarmak için bir platin tel kıracağı kullanın ve solucanların 20 santigrat derecede yumurta bırakmasına izin verin. 24 saat sonra, enjekte edilen solucanları yeni ayrı 35 milimetrelik plakalara aktarın.

Enjeksiyondan sonraki üç ila dört gün boyunca, hayvanlar dairesel bir düzende hareket ederken uzun ekseni etrafında dönen hayvanın gövdesi ile gösterildiği gibi, silindir fenotipleri sergileyen F1 döllerine sahip plakaları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve aynı gelişim aşamasındaki kontrol hayvanlarına kıyasla daha kısa ve daha sağlam bir fizyoloji ile kanıtlandığı gibi, dumpy fenotipleri. 50 ila 100 F1 silindir solucanını kendi plakalarına aktarın ve solucanların bir ila iki gün boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Bir ila iki günlük F2 solucanı üretiminden sonra, her bir F1 silindir annesini numaralı bir plakadan, mililitre proteinaz başına 20 miligramlık 1:100 seyreltme ile desteklenmiş 2.5 mikrolitre lizis tamponu içeren karşılık gelen numaralı PCR tüpüne aktarın K. Solucanları bir termocycler'da parçalamadan önce tüpleri eksi 30 santigrat derecede 20 dakika dondurun, belirtildiği gibi.

Döngünün sonunda, deoksinükleosit trifosfatlar, DNA polimeraz, magnezyum klorür ve yükleme boyası, bir mikrolitre 10 mikromolar ileri astar, bir mikrolitre 10 mikromolar ters astar içeren 12,5 mikrolitre 2X PCR karışımı ekleyin ve reaksiyon karışımını her parçalanmış solucan numunesi başına 25 mikrolitreye getirmek için yeterli steril su. Ardından numuneleri belirtildiği gibi termosikler üzerinde çalıştırın. Uzunluğu 50 baz çiftinden daha az olan düzenlemeleri taramak için, her bir PCR reaksiyonunun 10 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve her tüpe beş mikrolitre kısıtlama sindirim ana karışımı ekleyin.

Sindirim reaksiyonlarını iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, 65 santigrat derecede 10 ila 15 dakikalık bir inkübasyon ile sindirimi ısıtın ve aktive edin. Daha sonra, her bir tüpten gelen tüm reaksiyonu% 1 ila% 2'lik bir agaroz jelinin tek bir kuyucuğuna yükleyin ve uygun bant ayrımı elde edilene kadar jeli 110 miliamperde çalıştırın.

Çalışmanın sonunda, DNA bant boyutlarını tespit etmek için UV ışığı altında agaroz jelleri görselleştirin. Pozitif olarak düzenlenmiş solucanlar, onarım şablonu kullanılarak düzenleme nedeniyle beklenen boyutta fazladan bir DNA bandı gösterecek ve kısıtlama bölgesini solucan genomu içinde istenen lokusta taşıyacaktır. İlgili pozitif olarak düzenlenmiş F1 silindir solucan plakalarından sekiz ila 12 vahşi tip görünümlü, yuvarlanmayan F2 solucanı seçin ve solucanların yumurtlamasına ve bir ila iki gün boyunca döl üretmesine izin verin.

Ardından, pozitif olarak düzenlenmiş solucanlar için gösterildiği gibi homozigot solucan hatlarını tanımlayın ve standart protokollere göre düzenlemenin varlığını doğrulamak için dizi analiz yazılımı kullanarak sıralama sonuçlarını analiz edin. Burada genomik DNA ve C.elegans rbm-3.2 geni için tasarlanmış CRISPR RNA ve onarım şablonu gözlemlenebilir. Bu temsili analizde, 73 F1 solucanından yedisinin düzenleme için pozitif olduğu bulundu.

Düzenlenmemiş solucanlar, EcoRI sindirimi üzerine 445 baz çiftinin tek DNA fragmanını gösterirken, rbm-3.2 geninde erken durdurma kodonu taşıyan solucanlar, EcoRI sindirimi üzerine 265 ve 166 baz çiftinde iki fragman sergiledi. Heterozigot düzenlenmiş solucanlar, EcoRI sindirimi üzerine üç parça gösterdi. Tanımlanan pozitif F1 heterozigotlarından elde edilen 12 F2 solucanından altısının, ilgilenilen düzenleme için homozigot olduğu bulundu.

Tanımlanmış bir homozigot düzenlenmiş solucan hattının genomik DNA'sı daha sonra, düzenlemenin homozigot durumundaki varlığını doğrulayan bir DNA dizileme reaksiyonu oluşturmak için kullanılabilir. Düzenleme reaktiflerinin ve eleme astarlarının doğru tasarlanmasına ve enjeksiyon karışımının uygun şekilde hazırlanmasına dikkat edin. Doğru bir mikroenjeksiyon da çok önemlidir.

Bu prosedürü takiben, genom düzenlemesinin doğruluğunu doğrulamak için mümkünse düzenlemenin fenotipik doğrulaması ve gen ve protein ekspresyon analizi yapılabilir.