Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model
10 Nisan 2021
Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.
Neovaskülarizasyon, yeni kan damarlarının üretilmesi hem normal hem de patolojik olaylarda son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Neovaskülarizasyonu daha iyi anlamak için, süreci doğal hücresel mikroçevrici in vitro olarak yeniden oluşturmak önemlidir. Mikroakışkan bir çip ve otomatik kontrol geliştirdik.
Yüksek verimli dolaşımlar perfüzyon mikro tüpleri oluşturmak ve yeni vaskülerizasyonun ilk olayına geri dönmek için proteini kullanmak için simüle etmek için yapılır. Mikroakışkan filizlenen çip üç kanaldan oluşuyordu. Endotel hücre kültürü kanalı ile sıvı kanal geniş bir merkezi hidrojel kanal ile ayrıldı.
Mikroakışkan kontrol sistemi bir mikrosyringe pompası ve elektromanyetik sıkıştırma vanası idi. Kabarcık tuzak çipi, mikroakışkan filizlenen çip, mikro-peristaltik pompa ve kültür orta rezervuarı. Mikroakışkan bir sistemle endotel hücreleri, yüksek ışıklı kesme stresi, transendotelyal akışın fizyolojik düzeyi ve çeşitli vasküler endotel büyüme faktörü dağılımları ile aynı anda uyarılabilir.
Hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon portuna fibronektin mililitresi başına 125 mikrogram pipet 20 mikrolitre. Hücre kültürü kanalının bağlantı noktasına makasla uyacak şekilde bir pipet ucu kesin. Pipet ucunu hücre kültürü kanalının diğer ortam ekleme bağlantı noktasına yerleştirin.
Daha sonra, fibronektin ile doldurmak için hücre kültürü kanalından hava boru. Cipsleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Hücre tohumlamadan önce, pipet her ortam enjeksiyon portuna 20 mikroliter endotel hücre ortamı ve cipsleri 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, tüm medya enjeksiyon bağlantı noktalarındaki tüm medyayı pipetle dışarı atın. Daha sonra, hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon bağlantı noktasına beş mikroliter hücre süspansiyonu pipet. Daha sonra endotel hücreleri diferansiyel hidrostatik basınç altında hızla tüm kanala yayılır.
Hidrostatik basıncı ayarlamak ve hücrenin hareket etmesini durdurmak için diğer bağlantı noktasına yaklaşık dört ila altı mikroliter ECM ortamı ekleyin. Çipleri hücre inkübatörüne uzaktan kumanda edin. Daha sonra, endotel hücreleri hücre kültürü kanalının iç yüzeyini kaplayana kadar her 30 dakikada bir çipleri ters çevirin, iki saat sonra.
Enjeksiyon bağlantı noktalarındaki ekli hücreleri çok dikkatli bir şekilde çıkarmak için pipet ucu kullanın. Ardından, ortam enjeksiyon bağlantı noktalarına dört dikenli dişi Luer adaptörü yerleştirin ve ECM ortamıyla doldurun. Çipleri hücre inkübatörüne çıkarın, ECM medyasını ve Luer adaptörlerini her 12 saatte bir değiştirin.
Mikroakışkan kontrol sistemini monte etmek için iki politetrafloroetilen tüp, iki kısa silikon tüp, üç uzun silikon tüp, bir dikenli dişi Luer adaptörü, bir Y tipi konektör ve ardından üç L tipi konektör hazırlayın. Şırınnayı önceden ısıtılmış 10 mililitre ECM ortamı ile doldurun. Dikenli dişi bir Luer adaptörü ile şırındağa bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın.
Ardından, politetrafloroetilen tüpün diğer ucunu bir Y tipi konektöre bağlayın. Ardından, iki uzun silikon tüpü Y tipi konektörün diğer iki ucuna bağlayın. Rezervuara bağlanmak için bir tüp ve kabarcık tuzak çipine bağlanmak için diğer tüpü kullanıyoruz.
Rezervuara başka bir uzun silikon tüp bağlayın. Daha sonra, kabarcık tuzak çipinin üst katmanındaki tüm giriş ve çıkış deliklerini bağlamak için iki kısa silikon tüp kullanın. Çipin arka ucuna bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın.
Ardından, bir şırıngayı mikrosyringe pompasına sabitlayın. Elektromanyetik sıkıştırma vanasına iki uzun silikon tüp takın. Ardından, şırıngam ve rezervuar arasındaki boru hattını açmak için elektromanyetik sıkıştırma vanasını değiştirin.
Tüpteki havayı tüketmek için mikrosyringe pompası kullanarak rezervuara ortam enjekte edin. Ardından, şırınna ve kabarcık tuzak çipi arasındaki boru hattını açmak için vanayı tekrar değiştirin. Kabarcık tuzak çipinin sıvı odasını ve arka uç tüpünü doldurmak için ortam enjekte edin.
Endotel filizlenen çipleri hücre inkübatöründen çıkarın, ardından hücre kültürü tarafındaki Luer adaptörlerini çıkarın. Mikroakışkan filizlenen çipin hidrojel enjeksiyon portlarına iki boru fişi yerleştirin. Kabarcık tuzak çipinin arka uç tüpünü hücre kültürü kanalının bir bağlantı noktasına bağlayın.
Diğer bağlantı noktasına bir T tipi konektör takın ve rezervuara bağlı uzun silikon tüpe bağlayın. Uzun silikon tüpü mikro peristaltik pompaya kırpın. Ardından, rezervuara bir hava filtresi yerleştirin.
Ardından, mikroakışkan filizlenen çipi sahne üstü inkübatöre monte edin. Ardından, vakum pompasını bir TPU tüpü ile kabarcık tuzak çipinin alt tabakasındaki deliklere bağlayın. Mikrosyringe pompasını ve elektromanyetik sıkıştırma vanasını aynı anda kontrol eden özel programda karşıt sirkülasyon hacmi ve bir akış hızı ayarlayın.
Ardından, mikro peristaltik pompanın akış hızını ayarlayın. Mikrosyringe pompasını açın. Daha sonra sirkülasyon kontrol sistemi kurulur.
Modelimizdeki bazı mikro damarların bariyer fonksiyonunu 40 kDa F-I-T-C dekstrin difüzyonal geçirgenlik katsayısını ölçerek test ediyoruz. Şekilde gösterildiği gibi, hücre astarlı statik kültür çipinin difüzyonal geçirgenlik katsayısı saniyede 0,1 artı veya eksi 0,3 mikrometredir. Ve hücre astarı olmayan boş kanalın difüzyonal geçirgenlik katsayısı saniyede 5,4 artı veya eksi 0,7 mikrometredir.
Endotel filizlenme tahlili, endotel hücrelerinin 24 saatlik statik kültlemeden sonra büyük ölçüde merkezi hidrojel içine filizlendiğini, ışıklı kesme stresinin artmasıyla filizlenme derecesinin önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Nicel olarak, luminal kesme stresi, filizlenme alanı, ortalama filizlenme uzunluğu ve en uzun filiz uzunluğu açısından endotel filizlenmesini önemli ölçüde azalttı. Sistemimizle, endotel hücreleri üzerindeki kesme stresi, transendotelyal akış fizyolojik düzeyde kalırken, deney sırasında isteğe bağlı olarak herhangi bir zamanda değiştirilebilir.
Bu in vitro 3D biyomimetik model doğrudan neovasularizasyon mekanizmasının çalışmasına uygulanabilir ve ilaç taraması ve toksikoloji uygulamaları için düşük maliyetli bir platform olarak potansiyel sözü tutar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fizyolojik koşullar altında neovaskülarizasyonun başlangıç aşamalarını replike eden in vitro bir 3D mikroakışkan modelin geliştirilmesini sunmaktadır. MIEN olarak adlandırılan bu model, erken neovaskülarizasyon sırasında endotel hücrelerinin (EC'lerin) biyomekanik ve biyokimyasal mikroçevresini simüle etmek için bir mikroakışkan tomurcuklanma çipi ile otomatik bir dolaşım sistemini entegre eder. Bu platform; lüminal kayma geriliminin, transendotelyal akışın ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gradyanlarının hassas kontrolünü sağlayarak, mekanistik çalışmalar ve ilaç taramaları için değerli bir araç sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Vasküler biyoloji
- Doku mühendisliği
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Neovaskülarizasyon, mevcut damar yapısından yeni kan damarlarının oluşmasıdır ve hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda kritik öneme sahiptir.
- Neovaskülarizasyon sırasında endotel hücrelerinin (EC'ler) maruz kaldığı başlangıç mikroçevresi, sonraki aşamalardan önemli ölçüde farklılık gösterir.
- Mevcut modeller, neovaskülarizasyonun erken biyomekanik ve biyokimyasal koşullarını genellikle doğru şekilde taklit edememektedir.
- Mekanistik ve translasyonel araştırmalar için bu başlangıç olaylarını yeniden canlandıran in vitro sistemlere ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- Fizyolojik mikroçevresel koşullar altında neovaskülarizasyonun başlangıç sürecini simüle eden 3 Boyutlu in vitro bir model geliştirmek.
- Endotel hücrelerine kontrollü kayma gerilmesi, transendotelyal akış ve VEGF gradyanlarının uygulanmasını sağlamak.
- Mekanistik çalışmalar ve ilaç/toksikoloji taramaları için uygun bir platform sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Üç kanallı (bir EC kültür kanalı, merkezi bir hidrojel kanalı ve bir sıvı kanalı) bir mikroakışkan tomurcuklanma çipinin üretimi.
- Kanalların fibronektin ile kaplanması ve konfluent bir endotelyum oluşturmak için endotelyal hücrelerin ekimi.
- Şırınga ve peristaltik pompalar, hava kabarcığı tuzağı ve programlanabilir akış kontrolünü içeren otomatik bir mikroakışkan kontrol sisteminin kurulumu.
- Kontrollü lüminal kayma gerilmesi, fizyolojik transendotelyal akış ve VEGF gradyanlarının uygulanması.
- FITC-dekstran geçirgenlik analizleri yoluyla damar bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesi.
- Farklı kayma gerilmesi koşulları altında endotelyal tomurcuklanmanın nicelleştirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Model, erken neovaskülarizasyonu taklit eden, perfüze edilebilir ve endotelize mikrokanalların başarıyla oluşturulmasını sağlamıştır.
- Hücrelerle kaplı kanallarda, boş kanallara kıyasla düşük geçirgenlik katsayıları saptanarak bariyer fonksiyonu kanıtlanmıştır.
- 24 saatlik statik kültürden sonra, hidrojele doğru endotelyal tomurcuklanma gözlemlenmiştir.
- Lüminal kayma gerilmesinin artırılması, endotelyal tomurcuklanmanın kapsamını ve uzunluğunu önemli ölçüde azaltmıştır.
- Sistem, fizyolojik transendotelyal akışı korurken kayma gerilmesinin dinamik olarak modüle edilmesine olanak sağlamıştır.
Sonuçlar
- MIEN modeli, neovaskülarizasyonun başlangıç mikroortamını in vitro ortamda etkili bir şekilde yeniden oluşturmaktadır.
- Bu bağlamda, kayma gerilmesi endotel tomurcuklanmasının temel bir düzenleyicisidir.
- Bu platform, neovaskülarizasyonun mekanistik çalışmaları için gelecek vaat eden bir yöntem ve ilaç taraması ile toksikoloji için düşük maliyetli bir araçtır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygulanabilirlik
Erken evre neovaskülarizasyon modellemesi, vasküler hedef hipotezlerindeki risklerin azaltılması ve ilaç keşif süreçlerinde öngörüsel güvenin optimize edilmesi açısından kritik öneme sahiptir. MIEN mikroakışkan platformu, başlangıç vasküler mikroçevresinin hassas bir şekilde simüle edilmesine olanak tanıyarak endotelyal yanıtların mekanistik sorgulanmasını ve kantitatif değerlendirmesini destekler. Bu yetenek, translasyonel sürekliliği artırır ve vasküler hedefli terapötikler için portföy önceliklendirmesine veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fizyolojik kayma gerilmesini ve VEGF gradyanlarını yeniden oluşturarak vasküler hedeflerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar.
- Kontrollü mikroçevresel koşullar altında endotel hücre davranışının fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Erken aşama vasküler biyoloji hipotezlerinde öngörüsel güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Endotel filizlenmesi üzerindeki bileşik etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir 3D analiz platformu sağlar.
- Güçlü bir karşılaştırma için geçirgenlik katsayıları ve filizlenme metrikleri gibi kantitatif çıktılar üretir.
- İlaç adaylarının ve toksikoloji profillerinin fizyolojik olarak ilgili bir bağlamda ölçeklenebilir şekilde taranmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Geliştirilmiş translasyonel biyobelirteç stratejileri için in vitro bulguları hastalıkla ilgili vasküler mekanizmalarla ilişkilendirir.
- Erken neovaskülarizasyon olaylarını modelleyerek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Vasküler hedefli programların preklinik ilerleme kararlarındaki biyolojik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
MIEN modeli, vasküler hedeflerin hipotez testlerini, kantitatif taramalarını ve mekanistik doğrulamalarını sağlayarak keşiften preklinik aşamaya kadar uzanan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü mikroçevresel manipülasyon yoluyla yolakların netleştirilmesini ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi ve analiz standardizasyonu için tekrarlanabilir, kantitatif metrikler sunar.
- Analitikler: Deneysel koşulları karşılaştırmak ve karar verme süreçlerini bilgilendirmek için geçirgenlik ve filizlenme verileri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkle ilgili olduğunda, in vitro mekanistik içgörüleri preklinik vasküler modellerlele birleştirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli vasküler biyoloji ve ilaç tarama uygulamaları için yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vasküler hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Endotel analizlerini standartlaştırır ve Ar-Ge ekipleri arasında tekrarlanabilirliği destekler.
- Stratejik Değer: Karar süreçlerini (go/no-go) bilgilendirir ve erken aşama vasküler programların risklerini azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Vasküler hedefli varlıkların riskle uyumlu önceliklendirmesini ve ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkanlar, endotelyal hücre kültürü ve kantitatif analiz yöntemlerinde uzmanlık gerektirir.
- Programlanabilir pompalara, mikroakışkan çiplere ve görüntüleme altyapısına erişim gereklidir.
- Analiz kurulumu ve veri yorumlamasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Farklı endotelyal hücre kaynakları veya hastalık modelleri için adaptasyon gerekebilir.
- Sınırlamalar arasında işlem hacmi kısıtlamaları ve özel teknik eğitim ihtiyacı yer almaktadır.
![Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca 2+] I Ve Nitrik Oksit Üretimi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
