Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması
25 Ocak 2021
Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.
Bu protokol, in vivo sahip olduğumuz yağ dokusunun fizyolojisi olan in vitro'yu sadık bir şekilde yeniden oluşturan beyaz ve kahverengi adipositlerin hücre kültürel modellerini oluşturmak için basit bir strateji sağlar. Bu protokol, yenidoğan farelerden hem beyaz hem de kahverengi preadipositlerin eşzamanlı olarak izolasyonunu sağlar ve bu yöntemi kullanarak izole ettiğimiz hücreler yüksek proliferatif kapasiteyi ve farklılaşma potansiyelini değerlendirir. Bu yaklaşım kullanılarak izole edilen hücreler yağ dokusunun karmaşıklığını diğer kültür modellerinden daha iyi yansıtır.
Ve obezite ve diyabette adiposit fonksiyonunu daha doğru incelemek için kullanılabilir. Öncelikle obezitede yağ dokusu disfonksiyonu anlamaya odaklanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntemle hazırlanan hücreler, gelişim biyolojisinde hücre ile ilgili temel soruları incelemek için de kullanılabilir.
Başarılı bir deneyin anahtarı, beyaz yağ depolarının küçük, ancak çok zengin ve çoğalan preadipositlerin yavrularda ayırt edilmesi zor olabilen bu depolar olarak nasıl tanımlanacağını belirlemektir. Görsel gösterim, bu protokolün ne kadar basit olduğunu gösterir ve beyaz ve kahverengi yağ depolarını bulmak ve parçalamak için ipuçları sağlanmasına izin verir. Depo izolasyonu görmek çok yararlıdır.
Deri altı beyaz yağ dokusunu toplamak için, ötanazi bir yenidoğan yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin ve cildi bacakların altına hafifçe çekin. Herhangi bir cilt dokusu toplamadan, cildin içine veya kuadriseps'in üstüne bağlı açık veya beyaz, ince uzun bir doku olarak görünecek olan yağ deposunu dikkatlice hasat edin. Hasat edilen depoyu PBS'de durulayın ve yağ dokusunu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Kesitler arası kahverengi yağ dokusunu toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin ve omuz bıçakları arasında bulunan koyu kırmızı kahverengi yağ dokusunu kaldırın. Vücuttan ayırmak ve dokuyu kıvam ve renk için kontrol etmek için yağlığın her yerinde dikkatlice kesiler yapın. Durulamadan sonra, dokuyu 250 mikrolitre PBS ve 200 mikrolitre 2X izolasyon tamponu içeren ikinci bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin.
Tüm depolar toplandığında, her depoyu doğrudan tüplerin içine dört ila altı kez nazikçe kıymak için makas kullanın ve her tüpe 2X izolasyon tamponunda 50 mikrolitre 10X kollajenaz ekleyin. Daha sonra dokuları karıştırmak ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya 37 santigrat derecede 30 dakika ve dakikada 1400 devir yerleştirmek için tüpleri hızlı bir şekilde ters çevirin. Sindirimin sonunda, tüpleri tekrar buza yerleştirin ve sindirim dokularını 100 mikron hücre süzgeçlerinden yeni 50 mililitrelik tüplere filtreleyin.
Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için, her tüpü bir mililitre izolasyon ortamı ile durulayın ve bu yıkamayı süzgeçten filtreleyin. Kahverengi ve beyaz yağ dokusu çözeltilerini taze izolasyon ortamında depo başına kuyu başına iki mililitre doku süspansiyonu ile seyreltin. Daha sonra dört ila altı kuyunun her birine iki mililitre beyaz yağ dokusu süspansiyonu ve altı kuyu plakasının iki ila üç kuyusunun her birine iki mililitre kahverengi yağ dokusu süspansiyonu, kuyu başına bir 100 mikron filtre ile plakaleyin.
Tüm hücreler kaplandığında, plakayı 60 ila 90 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, her bir kuyuyu iki mililitre serumsuz ortamla yıkayın ve kuyuların dibinden herhangi bir kan hücresini ayırmak için plakayı hafifçe çalkalayın. Üç yıkamadan sonra, kuyulara iki mililitre taze izolasyon ortamı ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri verin.
Hücreler% 80 ila 90 izdiah ulaştığında, yeni hedef plakaları 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede damıtılmış suda steril% 0.1 jelatin ile kaplayın. Plakalar inkübasyon yaparken, hücre kültürü inkübatöründe üç dakika tripin ile tedavi etmeden önce hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreler ayrıldığında, hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak ve hücreleri yeni bir tüpe aktarmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez pipetlayın.
Tüm hücreler toplandığında, her bir kuyuyu bir mililitre izolasyon ortamıyla yıkayın ve yıkamaları hücre süspansiyonu ile çekin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve saymak için peleti üç ila beş mililitre izolasyon ortamına yeniden koyun. Hücreleri taze izolasyon ortamında kaplamak için uygun konsantrasyona seyreltin ve fazla jelatinleri çıkarmak için jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücreleri jelatin kaplı plakalara tohumlayın ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün. Hücreler konfluense ulaştığında, yalıtım ortamını farklılaşma ortamıyla değiştirin. Kahverengi yağ dokusu preadipositlerini ayırt ediyorsanız, bir nanomoler triiyodotironin de ekleyin.
48 saat sonra, ortamı kültür başına uygun bakım ortamı hacmiyle yenileyin. Şu anda, hücreler içindeki küçük sıvı damlacıklarının birikmesi parlak alan mikroskopisi altında görünür hale gelmelidir. Filtrelemeden sonra bile, bazı hücresel döküntüler ve kan hücreleri hücre süspansiyonu içinde kalır.
Kaplamadan bir saat sonra nazik yıkamalar, preadipositler kuyunun dibine hızla yapıştıkça ilgili olmayan hücreleri uzaklaştırır. Yenidoğan yavrulardan izole edilen hem beyaz hem de kahverengi preadipositler yüksek proliferatif kapasiteye sahip olsa da, beyaz preadipositlerin verimi genellikle depo bazında kahverengi preadipositlerin iki katıdır. Bu nedenle, senkronize kültürler isteniyorsa, beyaz preadipositlerin bu başlangıç yoğunluğu buna göre hesaplanmalıdır.
Farklılaşmanın sonunda, hücreler lipit damlacıkları ile yüklenmiş gibi görünecek ve sırasıyla beyaz ve kahverengi adipositlerin klasik belirteçlerini ifade edecektir. Bazal koşullar altında primer beyaz ve kahverengi adipositlerin mitokondriyal stres testinde oksijen tüketiminin bu karşılaştırmalı analizinde ve mitokondriyal fonksiyonun bilinen uyarıcılarına yanıt olarak, her hücre tipinin bu spesifik biyoenergetik yetenekleri gözlemlenebilir. Canlı hücreleri izole ettiğimizi ve onları birkaç gün boyunca kültüre etmek istediğimizi unutmayın.
Bu nedenle, sonraki kültürü tehlikeye atabilecek kirlenmeyi önlemek için izolasyon sırasında steril koşulları koruduğunuzdan emin olun. Bu yöntem, adiposit işlevini etkileyen hücre otonom mekanizmalarını incelemek için fonksiyonel tahliller, genetik veya kimyasal ekranlar veya omik profilleme dahil olmak üzere farklı uygulamalar için kullanılabilecek tamamen olgun adipositler üretir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu rapor, yeni doğan farelerden birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin eşzamanlı izolasyonu için bir protokolü ayrıntılandırmaktadır, bu da araştırmacıların bu hücreleri kültür etmelerine ve olgun adipositlere farklılaşmalarını indüklemelerine olanak tanır. Bu yöntem, özellikle obezite ve diyabet bağlamında adiposit fonksiyonunun çalışılmasını artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Adipos doku biyolojisi
- Hücre kültürü yöntemleri
- Obezite ve diyabet araştırması
Arka Plan
- Adipos doku işlevsizliğini anlamak, obezite araştırması için kritik öneme sahiptir.
- Önceki modeller, adipos dokuların karmaşıklığını doğru bir şekilde yansıtmayabilir.
- Hem beyaz hem de kahverengi depolardan preadipositlerin izole edilmesi, deneysel kontrolü iyileştirir.
Kullanılan Yöntemler
- Yeni doğan farelerden adiposit öncülerinin izolasyonu ve kültürü
- Biyolojik model sistemi olarak fareler
- Enzimatik sindirim ve hücre yerleştirme tekniklerini içerir
Ana Sonuçlar
- İzole edilen preadipositlerin yüksek çoğalma kapasitesi ve farklılaşma potansiyeli.
- Adipositlere başarılı farklılaşma, beklenen fizyolojik tepkileri yansıtır.
- Bu model, adiposit işlevselliğinin araştırılmasını daha iyi kolaylaştırabilir.
Sonuçlar
- Çalışma, preadipositlerin izolasyonu ve karakterizasyonu için güvenilir bir yöntem gösterir.
- Bu yaklaşım, adipos doku ile ilişkili metabolik hastalıklar üzerinde araştırma yapmayı ilerletmek için önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Primary adipocyte models derived from newborn mice provide a physiologically relevant system for studying white and brown adipose tissue biology, addressing limitations of immortalized cell lines. This approach supports target validation and phenotypic screening in metabolic disease research by capturing the heterogeneity and developmental dynamics of adipocyte populations. The method enables reproducible, scalable cultures suitable for genetic and functional assays, enhancing predictive confidence in preclinical de-risking strategies for obesity and diabetes therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipocyte differentiation pathways using primary cells that reflect in vivo depot complexity.
- Operational Value: Supports rapid expansion and differentiation of white and brown preadipocytes within 4-5 days, accelerating target engagement studies.
- Strategic Value: Facilitates phenotypic screening of genetic mouse models to assess cell-autonomous adipocyte phenotypes and de-risk therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems with high proliferative capacity for consistent compound screening in metabolic disease models.
- Operational Value: Standardized isolation and plating procedures ensure reproducibility across wells and experiments, enabling reliable dose-response assessments.
- Strategic Value: Scalable primary cell production supports medium-throughput screening workflows for lead identification in adipocyte biology.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Differentiated primary adipocytes express classical markers and exhibit measurable bioenergetic functions, enabling translational biomarker alignment.
- Operational Value: Mitochondrial stress test compatibility allows quantitative assessment of adipocyte function under basal and stimulated conditions.
- Strategic Value: Supports preclinical model continuity by providing a disease-relevant system for studying adipose tissue dysfunction in obesity and diabetes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying validated primary adipocyte cultures for target validation, progressing to screening and preclinical validation stages with maintained physiological relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through depot-specific isolation of white and brown preadipocytes from developing adipose tissue.
- Screening: Enables assay readiness via rapid differentiation and high-yield plating of primary cells for compound evaluation.
- Analytics: Facilitates quantitative measurements such as lipid droplet accumulation and mitochondrial respiration for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation through depot-specific functional readouts that mirror in vivo adipose tissue complexity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying genetic and environmental impacts on adipocyte function across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through physiologically relevant models that reduce mechanistic ambiguity in adipocyte biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of primary cell isolation and differentiation across experimental batches.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced late-stage biological risk in metabolic disease target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on cell-autonomous adipocyte phenotypes from genetic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and depot identification to ensure viable preadipocyte yield.
- Dependent on enzymatic digestion equipment (collagenase, temperature-controlled mixer) and sterile filtration infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of isolation buffer composition and plating densities for white versus brown adipocyte cultures.
- Adaptation considerations include adjusting seeding densities due to higher white adipocyte yield per depot compared to brown.
- Practical limitations include the need for timely processing of neonatal tissue to maintain progenitor viability and proliferative capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:32
Adipose Depot Collection and Digestion
3:28
Plating Preadipocytes
4:56
Preadipocyte Culture Expansion
6:17
White and Brown Preadipocyte Differentiation
6:55
Results: Representative Adipocyte Progenitor Collection and Differentiation
8:14
Conclusion
