Name: Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medakada Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Öğrenin Japon medakasında (Oryzias latipes) gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerini. Bu yöntem, teleost ve omurgalılarda cinsiyet steroidlerinin fizyolojik rolünü incelemek için yüksek sağkalım oranı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Bayan Lourdes Carreon G Tan'a balık hayvanlığındaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma NMBU, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Hibe-in-Aid (Hibe numarası 18H04881 ve 18K19323) ve Sumitomo Vakfı'ndan S.K.'ye Temel Bilim Araştırma Projeleri için hibe ile finanse edildi.

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,42,47'de açıklandığı gibi, dorsal ve anal yüzgecin büyüklüğü ve şekli gibi ikincil cinsel özellikleri ayırt ederek belirlendi.
1. Enstrümanlar ve çözüm hazırlama
<ol><li>Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (%0,6 Trikain).<ol>
<li>0,6 g Tricaine (MS-222) 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) 100 mL seyreltin.</li>
		<li>Tricaine stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını birkaç 1,5 mL plastik boruya dağıtın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 L akvaryum suyuna 18 g NaCl ekleyerek geri kazanım suyu (%0,9 NaCl çözeltisi) hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Keskin bir nokta elde etmek için bir jilet çapraz kırarak kesi aletlerini hazırlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>25 μL sodyum heparini 500 μL 1x PBS'ye seyrelterek kan pıhtı önleyici çözelti (0,05 U/μL sodyum heparin) hazırlayın. Pıhtı önleyici çözeltiyi kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çekerek(Şekil 1B)cam kılcal damar çekerek 90 mm uzunluğundaki cam kılcal damardan iki cam iğne hazırlayın. NOT: Cam iğnenin dış çapı 1 mm, iç çapı ise 0,6 mm'dir.</li>
	<li>Kapağı keserek 1,5 mL plastik boru kapağı hazırlayın ve iğne dış çapına uygun bir delik açın (Şekil 1C). Deliği açmak için, 9 mm'lik cam kılcal damarın bir ucunun ısıtın ve ısıtılmış cam kılcal damarı kapaktan bıçaklayın. Alternatif olarak, deliğin çapı 9 mm'lik cam kılcal damara sığana kadar kapağı saplamak için bir iğne kullanın.</li>
</ol>2. Gonadektomi prosedürü
<ol><li>30 mL akvaryum suyunda bir tüp Tricaine stoğunu (%0,6) seyrelterek anestezik çözeltinin% 0,02'sini hazırlayın.</li>
	<li>Adım 1.3'te açıklandığı gibi bir ultra ince ve iki ince forseps (biri nispeten geniş uçlu), küçük makas, naylon iplik ve jilet dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın.</li>
	<li>Balığı 30-60 saniye boyunca% 0.02 anestezik çözeltiye koyarak uyuşturun. NOT: Anestezi süresi balığın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlıdır ve uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, balık gövdesi kümesler kullanılarak hafifçe sıkıştırılabilir. Balık tepki vermezse, gonadektomi başlatılabilir.</li>
	<li>Balıkları anestezik çözeltiden çıkar ve balığı yatay olarak yan tarafına, sudan diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.</li>
	<li>Kadınlarda ovaerektomi (OVX)<ol>
<li>Varsa yumurtlama yumurtalarını (dişi vücudun dışına sarkan yumurtalar) çıkarın ve kesi alanındaki pulları kazıyın (Şekil 2A).</li>
		<li>Kaburgalar arasında, pelvik ve anal yüzgeçler arasında ( Şekil 2A ), jilet kullanarak yaklaşık2-2,5mm uzunluğunda bir kesi yapın. Daha sonra, geniş uçlu ince tokmakla yumurtalıkları azar azar çıkarırken balık karnını hafifçe çimdikleyin.</li>
		<li>İnce önlük kullanarak yumurtalıkların ucını kesin ve yumurtalıkları bir kenara yerleştirin (Şekil 2B). NOT: Mümkünse yumurtalık kesesini kırmamaya özenin. Yumurtalık kesesi kırılırsa, yumurtlanmamış yumurta bile bırakmadan gonad izlerini mümkün olduğunca tamamen çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Erkeklerde orkidektomi<ol>
<li>Anüs üzerindeki kaburgalar arasında hafifçe bir kesi yapın (Şekil 2A) ve ince tokmakla kesiği yavaşça açın.</li>
		<li>İnce toksları kullanarak testisleri yavaşça alın ve testisleri yavaşça dışarı alın. Daha sonra testisleri tamamen çıkarmak için testislerin ucunun kesilmesi (Şekil 2B). Erkek orkidektomi için, kesi kısmına kadar tüm preparatlar kadınlarda benzerdir. Testisleri tutarken, bazen testislere benzeyen yağ elde edilir. Bununla birlikte, yağı geri yükledikten sonra testisleri tekrar bulmaya çalışmak mümkündür (Şekil 2B). NOT: Hem erkekler hem de kadınlar için, mortaliteye yol açabilecek aşırı hasarı önlemek için karındaki kesi boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bazen bağırsaklar da gonadlarla birlikte kesiden ortaya çıkabilir, bu nedenle kapanmadan önce kesi içinde düzgün bir şekilde geri döndüklerinden emin olun. Medaka karın bölgesinde yumurtalıklar ve testisler hakkında önceden bilgi sahibi olmak esastır.</li>
	</ol></li>
	<li>Kesiği erkeklerde ve kadınlarda benzer şekilde dikin (Şekil 3).<ol>
<li>Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ince önlüklerle ipliği içeri almak için ultra ince önlük kullanarak derini kesiğin sağ tarafından iç vücut boşluğundan bıçaklayın (Şekil 3; 1-2).</li>
		<li>İpliği çıkarmak için kesiğin sol tarafındaki deriyi dış vücut boşluğundan bıçaklayın ( Şekil 3; 3-4).</li>
		<li>Kesi açıklığını kapatın ve iki düğüm yapın ve aşırı ipliği kesin (Şekil 3; 4-6). NOT: Dikiş yeterince sıkı olmalı ve balık üzerindeki kalan iplik dikişin gevşemesini önleyecek kadar uzun olmalıdır. Anesteziden dikişe kadar tüm işlem genellikle 6 dakika kadar sürer. Daha uzun süre ölüm oranına yol açabilir.</li>
		<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Gonadektomi balıklar genellikle geri kazanım suyunda 1-2 saat sonra normal davranış gösterir. Bu nedenle, deney amacına bağlı olarak, bu zaman aralığından sonra balıkları örnekleyebilirsiniz.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kan örnekleme prosedürü
<ol><li>Aletleri hazırlayın: bir cam iğne, silikon kılcal damar, delikli plastik bir tüp, boş bir 1,5 mL plastik tüp, bir minicentrifuge ve bant.</li>
	<li>2.1. adımda açıklandığı gibi% 0.02 anestezik çözelti kullanarak balığı uyuşturun ve balıkları dikey bir konumda diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 4A). Kaudal delinme damarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için balığı parlak bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Silikon kılcal damara cam iğne takarak kan çekmecesini takın (Şekil 4B). İğnenin ucunu geniş uçlu forsepslerle kırın ve iğnenin içini emiş ve üfleyerek pıhtı önleyici çözelti ile kaplayın. NOT: Emme sırasında kanın doğrudan temasını önlemek için güvenlik önlemleri için enayi ve en az 50 cm uzunluğunda silikon kılcal damar kullanılması önerilir. Ek olarak, iğne ucunun açıklığının kanın çizilmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>İğneyi balığın peduncle bölgesine doğru yönlendirin, kaudal peduncle damarını hedefleyin (Şekil 5A) ve iğnenin toplam hacmi en az dörtte biri dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin (Şekil 5B). NOT: İğneyi balık vücudundan çıkarmadan önce emmeyi durdurmak önemlidir.</li>
	<li>İğneyi bırakın ve iğnenin keskin tarafının yakınlık kısmına bir bant parçası koyun. Kapağı bir toplama tüpüne bir delik ile yerleştirin ve iğneyi tüpün içine, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten geçirin (Şekil 5C).</li>
	<li>Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin. NOT: Aynı balıktan ikinci bir kan örneği almak için, ilk kan örneklemesi yapıldıktan bir hafta sonra kanı örneklemek.</li>
	<li>Flash, tüpteki kanı toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g ile toplanan kanı 1-2 saniye boyunca aşağı çevirin.</li>
	<li>Doğrudan aşağı akış uygulamalarına geçin veya kullanıma kadar kanı -20 °C'de saklayın. NOT: Tüm kandan seks steroid ekstraksiyonu için önceki çalışmaya bakın48.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki literatürde bildirildiği gibi, gonadektomi ve kan örneklemesi uzun zamandır BPG ekseninin düzenlenmesinde seks steroidlerinin rolü ile ilgili soruları araştırmak için diğer model türlerde kullanılmaktadır. Ancak, bu teknikler sadece daha büyük hayvanlar için uygun görünüyor. Yaygın olarak kullanılan teleost modeli Japon medaka'nın küçük boyutunu göz önünde bulundurarak, bu tür için mümkün olan gonadektomi ve kan örneklemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Gonadektomi yapılan balı...

Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,2,3,4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin6, 7,8ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar11. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.
Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlarhalinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri22, bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispetenucuzdurlar 23,24. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir23, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlarsağlar.
Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,27,28, kuşlar29 ve amfibiler30. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyükbalıklar 40 için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.
Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir25ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi41. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir42. Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesinitamamlayacaktır 43, hipofiz bölümleri44 ve beyin nöronları45ve birincil hücre kültürü46. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Cam kılcal</td><td></td><td>damar GD1</td><td>Filamentli Cam Kılcal GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>İğne çektirmesi</td><td></td><td>P97</td><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet çektirmesi Model P-97; Sutter Instrument</td></tr><tr><td>Naylon iplik</td><td></td><td>N45VL</td><td>Poliamid sütür, 0.2 metrik; Crownjun</td></tr><tr><td>Plastik tüp</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Güvenli kilitli mikrosantifuge tüp 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>Tıraş</td> <td>Bıçağı-Astra</td><td></td> <td>Superior Platinum Çift Kenarlı Tıraş Bıçağı Yeşil, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>Silikon kılcal</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell Silikon Tüp 1 mm İç Çap x 2 mm Dış Çap, amazon.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Trikain</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>Aldrich kimyası</td></tr></tbody></table>

küçük boyutlu teleost model japonca medaka'da gonadektomi ve kan Örnekleme İşlemleri (oryzias latipes)

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, beyin ve hipofiz doku plastisitesinde ve beyin ve hipofiz geri bildirim sağlayarak tüm omurgalılarda üremenin nöroendokrin kontrolünde önemli bir rol oynar. Teleost balıkları, memeliler ile karşılaştırıldığında üreme stratejilerinde daha yüksek derecede doku plastisitesine ve varyasyona sahiptir ve seks steroidlerinin rolünü ve hareket ettikleri mekanizmaları araştırmak için yararlı modeller gibi görünmektedir. Steroid seviyelerini ölçmek için kan örneklemesi ile birlikte gonadektomi kullanarak seks steroid üretiminin ana kaynağının kaldırılması iyi kurulmuş ve daha büyük balık oldukça uygulanabilir olmuştur ve seks steroidlerin rolünü ve etkilerini araştırmak için güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknikler küçük boyutlu teleost modellerinde uygulandığında zorlukları gündeme getirmektedir. Burada, hem erkeklerde hem de dişi Japon medakasında gonadektomi ve ardından kan örneklemesi gibi adım adım yapılan işlemleri açıklıyoruz. Bu protokoller yüksek hayatta kalma oranı, balıkların yaşam süresi ve fenotip için güvenlik ve seks steroid boşluk açısından tekrarlanabilirlik ile belirtilen medaka son derece uygulanabilir olarak gösterilmiştir. Bu prosedürlerin kullanımı, bu küçük teleost modelini kullanmanın diğer avantajları ile birlikte, omurgalılarda cinsiyet steroidleri tarafından sağlanan üreme ve doku plastisitesinin nöroendokrin kontrolünde geri bildirim mekanizmalarının anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirecektir.

<strong...

Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Bu yöntem, nöroendokrin sistem plastisitesinde seks steroidlerinin rolü ve teleostlarda ve daha büyük ölçüde omurgalılarda düzenlenmesi de dahil olmak üzere gonadların fizyolojik işlevi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu protokol, araştırma camiasında yaygın olarak kullanılan küçük model teleost medekada gonadektominin yüksek başarı oranıyla yapılmasını mümkün kılmaktadır. Başarılı olmak ve yüksek bir hayatta kalma oranı elde etmek için bu teknik, özellikle gonadların değerlendirilmesi ve balıkların dikilmesi konusunda uygun eğitim gerektirir.Balığı anestezik solüsyondan çıkararak ve diseksiyon mikroskobu altında yatay olarak yan yatırarak başlayın. Kadınlarda ovariektomi yapmak için, kesi alanındaki pulları kazıyın. Bir tıraş bıçağı kullanarak kaburgalar ile pelvik ve anal yüzgeçler arasında nazikçe iki ila 2,5 milimetrelik bir kesi yapın.Geniş uçlu ince forseps kullanarak yumurtalıkları çıkarırken balığın karnını nazikçe sıkıştırın. Ölüme neden olabilecek kaburgaları kırmaktan kaçınmak önemlidir. Yumurtalıkların ucunu ince forseps ile kesin ve bir kenara koyun.Erkeklerde orşidektomi yapmak için, anüsün üzerindeki kaburgalar arasında bir kesi yapın ve ince forseps kullanarak kesiyi yavaşça açın. Testisleri forseps ile nazikçe tutun ve yavaşça çıkarın. Sonra tamamen çıkarmak için testislerin ucunu kesin.İşlemi gerçekleştirdikten sonra, kesiği erkekler ve kadınlar için benzer şekilde dikin. Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ipliği içeri almak için ultra ince forseps kullanarak cildi insizyonun sağ tarafından iç gövde boşluğundan bıçaklayın. Ardından, ipliği çıkarmak için cildi insizyonun sol tarafından dış gövde boşluğundan delin.Kesi açıklığını kapatın, iki düğüm yapın ve fazla ipliği kesin. Balıkları izotonik geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat orada bırakın. Silikon kılcal damara bir cam iğne takarak kan çekmecesini monte edin.İğnenin ucunu geniş uçlu forseps ile kırın ve iğnenin içini emerek ve üfleyerek pıhtılaşmayı önleyici solüsyonla kaplayın. İğneyi, kaudal pedinkül damarını hedefleyerek balığın pedinkül bölgesine doğru yönlendirin ve iğnenin toplam hacminin en az 1 / 4'ü dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin. İğneyi serbest bırakın ve keskin tarafa yakın bir parça bant koyun.Bir toplama tüpünün üzerine delikli bir kapak yerleştirin ve iğneyi, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten tüpün içine sokun. Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat orada bırakın. Flash, tüpteki kanı toplamak için kanı 1.000 kez G'de bir ila iki saniye döndürün.Kadınlarda ovariektomi veya OVX sonrası sağkalım oranı, orşidektomi sonrası erkeklerde %100 ve %94 idi. Tüm balıklar kan örnekleme prosedüründen kurtuldu. Sahte ameliyatlı dişiler OV pozisyonu gösterdi.Tüm yumurtalar döllendi ve embriyonik gelişime geçildi. Gonadektomi prosedürü doğru bir şekilde yapıldığında, balığın vücut şekli hafifçe değişti ve hiçbir gonad parçası kalmadı. İnsizyon ve sütür, gonadektomiden dört hafta sonra tamamen kayboldu.Dört ay sonra, tüm balıklar hala sağlıklı bir fenotip gösterdi ve gonadal doku bulunamadı. Dişilerde yapılan kan analizi, OVX balıklarındaki E2 seviyesinin, ameliyattan 24 saat sonra sahte olarak ameliyat edilen balıklardan önemli ölçüde daha düşük olduğunu ortaya koydu. Dört ay sonra, OVX balıklarındaki E2 seviyesi, sahte olarak işletilen balıklardan hala önemli ölçüde düşüktü.Gonadın sadece 1/3 ila 1/2'sinin çıkarıldığı kısmen OVX balıkları, sahte olarak işletilen balıklardan önemli ölçüde daha düşük E2 seviyeleri ve tam OVX balıklardan önemli ölçüde daha yüksek E2 seviyeleri gösterdi. Orkideektomize edilmiş erkeklerde 11-KT konsantrasyonu, ameliyattan 24 saat sonra sahte olarak ameliyat edilen balıklardan önemli ölçüde daha düşüktü. Dört ay sonra, 11-KT seviyesi hala sahte olarak işletilen balıklardan daha düşüktü.Kısmen orkideektomize balıklar, sahte olarak işletilen balıklardan daha düşük 11-KT seviyeleri ve tamamen orkideektomize balıklardan daha yüksek seviyeler göstermiştir. Prosedürün başarılı olmasını sağlamak için, balığın içindeki diğer organlara zarar vermeden gonadı mümkün olduğunca dikkatli ve eksiksiz bir şekilde çıkarmak çok önemlidir. Seks steroidlerinin beyin ve hipofiz hücre plastisitesinde önemli bir rol oynadığı bilindiğinden, bu teknik küçük teleost modellerinde altta yatan mekanizmaları araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı niteliktedir. Bu protokol, Medaka embriyolara başarılı mikroenjeksiyon, bir laboratuvarda Medaka ve zebrafish kullanarak embriyolojik ve genetik analiz için önemli bir tekniktir için kilit noktaları vurgulamaktadır.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

, Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kullanmak için gereklidir.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Embriyonik evreler, ksenobiyotiklere en duyarlı olanlardır. Kimyasal toksisite tuzluluğa bağlı olmasına rağmen, toksisitenin suda yaşayan organizmalara tuzluluk bağımlılığını test etmek için hiçbir yöntem yoktur. Burada, toksisitenin suda yaşayan embriyolara tuzluluk bağımlılığını belirlemek için yeni ve yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Medaka Yumurta kullanma Gümüş Nanocolloids tuzluluk bağımlı zehirlilik Deneyi

Küçük laboratuvar balıkları, insan kemik bozukluklarının altında yatan mekanizmalar üzerine kemik araştırmaları ve kemik modüle edici ilaçların taranması için popüler modeller haline gelmiştir. Bu yazıda, osteoporotik lezyonları olan medaka larvalarında alendronatın kemik hücreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Amfitiyoloji biyolojisinin incelenmesi, birçok taksononomik grubun organizmalarını kullanan üreme, fizyolojik, embriyolojik ve gelişimsel süreçler hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, biz ayı kontrol ve amfitezya izleme incelemek için kullanılabilecek farklı metodolojiler üzerinde kapsamlı bir rehber sunuyoruz.

Anbürlerde Ovaryalı Izleme ve kontrol için üreme teknikleri

In vitro fertilizasyon, laboratuvar nüfusunu korumak ve akım uygulamaları için senkronize embriyolar üretmek için çeşitli model organizmalar ile yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Burada, biz Meksika Tetra balık, Astyanax mexicanusfarklı nüfusu için bu tekniği uygulayan bir protokol sunuyoruz.

Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon

Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.

Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma

Bu makalede, küçük model balık medakasından (Oryzias latipes) sperm toplamak için iki hızlı ve etkili yöntemin yanı sıra, bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanarak sperm kalitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Teleost Modelinde Sperm Toplama ve Bilgisayar Destekli Sperm Analizi Japon Medakası (Oryzias latipes)

Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.

Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu

Yetişkin erkek X. laevis'ten bir testisin cerrahi olarak alınması için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, ikinci testisin daha sonra kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Bu protokol, in vitro döllenme için gereken erkek kurbağa sayısını azaltmayı amaçlamaktadır.

Yetişkin erkek Xenopus laevis'te tek taraflı gonadektomi

Öğrenin Japon medakasında (Oryzias latipes) gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerini. Bu yöntem, teleost ve omurgalılarda cinsiyet steroidlerinin fizyolojik rolünü incelemek için yüksek sağkalım oranı sağlar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Daha fazla video keşfet