Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Bu yöntem, nöroendokrin sistem plastisitesinde seks steroidlerinin rolü ve teleostlarda ve daha büyük ölçüde omurgalılarda düzenlenmesi de dahil olmak üzere gonadların fizyolojik işlevi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu protokol, araştırma camiasında yaygın olarak kullanılan küçük model teleost medekada gonadektominin yüksek başarı oranıyla yapılmasını mümkün kılmaktadır. Başarılı olmak ve yüksek bir hayatta kalma oranı elde etmek için bu teknik, özellikle gonadların değerlendirilmesi ve balıkların dikilmesi konusunda uygun eğitim gerektirir.

Balığı anestezik solüsyondan çıkararak ve diseksiyon mikroskobu altında yatay olarak yan yatırarak başlayın. Kadınlarda ovariektomi yapmak için, kesi alanındaki pulları kazıyın. Bir tıraş bıçağı kullanarak kaburgalar ile pelvik ve anal yüzgeçler arasında nazikçe iki ila 2,5 milimetrelik bir kesi yapın.

Geniş uçlu ince forseps kullanarak yumurtalıkları çıkarırken balığın karnını nazikçe sıkıştırın. Ölüme neden olabilecek kaburgaları kırmaktan kaçınmak önemlidir. Yumurtalıkların ucunu ince forseps ile kesin ve bir kenara koyun.

Erkeklerde orşidektomi yapmak için, anüsün üzerindeki kaburgalar arasında bir kesi yapın ve ince forseps kullanarak kesiyi yavaşça açın. Testisleri forseps ile nazikçe tutun ve yavaşça çıkarın. Sonra tamamen çıkarmak için testislerin ucunu kesin.

İşlemi gerçekleştirdikten sonra, kesiği erkekler ve kadınlar için benzer şekilde dikin. Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ipliği içeri almak için ultra ince forseps kullanarak cildi insizyonun sağ tarafından iç gövde boşluğundan bıçaklayın. Ardından, ipliği çıkarmak için cildi insizyonun sol tarafından dış gövde boşluğundan delin.

Kesi açıklığını kapatın, iki düğüm yapın ve fazla ipliği kesin. Balıkları izotonik geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat orada bırakın. Silikon kılcal damara bir cam iğne takarak kan çekmecesini monte edin.

İğnenin ucunu geniş uçlu forseps ile kırın ve iğnenin içini emerek ve üfleyerek pıhtılaşmayı önleyici solüsyonla kaplayın. İğneyi, kaudal pedinkül damarını hedefleyerek balığın pedinkül bölgesine doğru yönlendirin ve iğnenin toplam hacminin en az 1 / 4'ü dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin. İğneyi serbest bırakın ve keskin tarafa yakın bir parça bant koyun.

Bir toplama tüpünün üzerine delikli bir kapak yerleştirin ve iğneyi, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten tüpün içine sokun. Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat orada bırakın. Flash, tüpteki kanı toplamak için kanı 1.000 kez G'de bir ila iki saniye döndürün.

Kadınlarda ovariektomi veya OVX sonrası sağkalım oranı, orşidektomi sonrası erkeklerde %100 ve %94 idi. Tüm balıklar kan örnekleme prosedüründen kurtuldu. Sahte ameliyatlı dişiler OV pozisyonu gösterdi.

Tüm yumurtalar döllendi ve embriyonik gelişime geçildi. Gonadektomi prosedürü doğru bir şekilde yapıldığında, balığın vücut şekli hafifçe değişti ve hiçbir gonad parçası kalmadı. İnsizyon ve sütür, gonadektomiden dört hafta sonra tamamen kayboldu.

Dört ay sonra, tüm balıklar hala sağlıklı bir fenotip gösterdi ve gonadal doku bulunamadı. Dişilerde yapılan kan analizi, OVX balıklarındaki E2 seviyesinin, ameliyattan 24 saat sonra sahte olarak ameliyat edilen balıklardan önemli ölçüde daha düşük olduğunu ortaya koydu. Dört ay sonra, OVX balıklarındaki E2 seviyesi, sahte olarak işletilen balıklardan hala önemli ölçüde düşüktü.

Gonadın sadece 1/3 ila 1/2'sinin çıkarıldığı kısmen OVX balıkları, sahte olarak işletilen balıklardan önemli ölçüde daha düşük E2 seviyeleri ve tam OVX balıklardan önemli ölçüde daha yüksek E2 seviyeleri gösterdi. Orkideektomize edilmiş erkeklerde 11-KT konsantrasyonu, ameliyattan 24 saat sonra sahte olarak ameliyat edilen balıklardan önemli ölçüde daha düşüktü. Dört ay sonra, 11-KT seviyesi hala sahte olarak işletilen balıklardan daha düşüktü.

Kısmen orkideektomize balıklar, sahte olarak işletilen balıklardan daha düşük 11-KT seviyeleri ve tamamen orkideektomize balıklardan daha yüksek seviyeler göstermiştir. Prosedürün başarılı olmasını sağlamak için, balığın içindeki diğer organlara zarar vermeden gonadı mümkün olduğunca dikkatli ve eksiksiz bir şekilde çıkarmak çok önemlidir. Seks steroidlerinin beyin ve hipofiz hücre plastisitesinde önemli bir rol oynadığı bilindiğinden, bu teknik küçük teleost modellerinde altta yatan mekanizmaları araştırmak için güçlü bir araç sağlar.